הכנת כרומוזום מיוסטי כפולות מדגים בזימטציטים
Summary
כפולות משטח גרעיני הם כלי הכרחי עבור לימוד אירועי כרומוזום במהלך meiosis. כאן אנו מדגימים שיטה כדי להכין ולדמיין כרומוזומים מיוטיים במהלך prophase הייתי מתוך הדגים הספרציטים.
Abstract
Meiosis הוא תהליך הסלולר המפתח הנדרש כדי ליצור מגיים פלואידי עבור רבייה מינית. אורגניזמים מודל היו אינסטרומנטלי הבנת האירועים כרומוזום כי מתרחשים במהלך proiotic, כולל הזיווג, synapsis, ושילוב מחדש אירועים המבטיחים הפרדה כרומוזום נכון. בזמן שהעכבר היה מודל חשוב להבנת המנגנונים המולקולריים הנמצאים בבסיס תהליכים אלה, לא כל האירועים המיוטיים במערכת זו הינם מקבילה למיוזיס אנושי. לאחרונה הדגמנו את הפוטנציאל המרגש של דג הזיברפיש כמודל של זרע-בראשית אנושי. כאן אנו מתארים, בפרוטרוט, שיטות שלנו להמחיש כרומוזומים מיוטיים וחלבונים הקשורים ההכנות כרומוזום התפשטות. ההכנות הללו יש את היתרון של מתן ברזולוציה גבוהה ניתוח של מבנים כרומוזום. ראשית, אנו מתארים את ההליך לבתר את האשכים של מבוגרים zebrafish, ואחריו הדיסוציאציה תא, הליזה, והפצת הכרומוזומים. לאחר מכן, אנו מתארים את ההליך לגילוי הלוקליזציה של חלבונים כרומוזום meiotic, על ידי זיהוי אימונוofor, ו חומצות גרעין רצפים, על ידי היברידיזציה באתרו (דג). טכניקות אלה מהווים ערכה שימושית של כלים לניתוח ציטולוגי של אדריכלות כרומטין מיוטית במערכת הדגים. חוקרים בקהילה דג זברה צריך להיות מסוגל במהירות לשלוט בטכניקות אלה ולשלב אותם לניתוח הסטנדרטי שלהם של תפקוד הרבייה.
Introduction
רבייה מינית ההכנסות באמצעות שילוב של שני מגיים פלואידי, כל אחד סוחב חצי כרומוזום משלים של תא סומאטיק. Meiosis היא חלוקת תאים מיוחדים המייצרת את גמטות מגיים דרך סיבוב אחד של שכפול DNA ושני סיבובים רצופים של הפרדה כרומוזום. ב-prophase I, כרומוזומים הומוולוגי (הומוולוג) חייבים לעבור זיווג, שילוב מחדש וsynapsis, האחרון שמאופיין בהיווצרות הקומפלקס הsynaptonemal המורכב משני צירי הומולוג הגושרים על ידי החוט הרוחבי, Sycp1 (איור 1A, B). אי כראוי לבצע תהליכים אלה יכול להוביל לייצור של מגיים aneuploid, אשר הם הגורם המוביל של הפלות בבני אדם1. הידע שלנו על הקואורדינציה בין זיווג, שילוב מחדש וsynapsis הונחה על ידי מחקרים במגוון רחב של אורגניזמים, כגון שמרים,כגון העכבר, ודרוסופילה, בין השאר2. בעוד התהליך הכללי של שיוך כרומוזום הומוולוגי ואחריו הפרדה היא שמירה היטב, התלות שלה על שילוב מחדש ו synapsis ואת סדר האירועים האלה משתנה.
Meiotic הפסקה כפולה (dsb) היווצרות, אשר יוזם שילוב הומוולוגי, מתרחשת ליד טלומרים באשכולות הזר במהלך לפטוטנא ו synapsis תפתח זמן קצר לאחר3,4. תצורה זו של היווצרות dsb ו synapsis חניכה היא גם מאפיין של המיוזיס גברי בבני אדם, אבל לא בעכבר5,6,7,8, מציע כי דג זברה יכול לשמש כמודל הזרע האנושי. ישנם גם מספר יתרונות מעשיים של הלומדים מיוזיס. שני הזכרים והנקבות עוברים במהלך הבגרות, הגונדות שלהם נגישים בקלות, ומאות צאצאים מופקים מצלב אחד. בנוסף, העוברים שקופים ולפתח חיצונית, אשר מקלה על גילוי מוקדם של סטיות בהתפתחות העובריים בשל מגיים aneuploid3,9. החסרונות של השימוש דג זברה הם כי הם איטיים להגיע בגרות מינית (~ 60 ימים) ואת כמות החומר הדרוש עבור כפולות משטח גרעיני יש לאסוף מ-~ 10-20 בעלי חיים למבוגרים, בהתאם לגודלם.
ההכנות התפשטות כרומוזום מיוטית הם כלי חיוני עבור לימוד דינמיקה כרומוזום בכל האורגניזמים המודל, מאז חתימות מפתח של דינמיקה כרומוזום meiotic יכול להיות נחקר. ב zebrafish, היבטים מרכזיים של ההתקדמות של התוכנית meiotic והארגון הגרעיני כבר גזור דרך בודק כפולות משטח גרעיני, המכונה כאן כמו כרומוזום מתפשט, עם נוגדנים לזיהוי אימונוofor, חלבונים ו/או חומצות גרעין על ידי דגים3,4,9,10,11,12. ואכן, ניתן לשמור על ההתאמה המקוטלת של טלומרים באשכולות בפרחים בהכנה לכפולה (איור 1C). לאחרונה, השתמשנו בכרומוזום הספרציט spermatocyte מתפשט יחד עם שיטות זיהוי של הקרינה הפלואורסצנטית ומיקרוסקופ סופר ברזולוציה כדי להבהיר את ההתקדמות המפורטת של הדינמיקה של ההומופיש, שיוך כרומוזום הומוולוגי, לוקליזציה של כפול סטרנד, ו synapsis ב מעברים meiotic מפתח3. כאן אנו מציגים שיטות כדי להכין כרומוזום כפולות מן הזרע של האשכים דג זברה ולאחר מכן כתם אותם עם חומצות הגרעין של הפלורסנט פפטיד (הרשות הפלסטינית) בדיקות חוזרות ונשנות רצפי ו מimmunofluorescence זיהוי של חלבונים הקשורים בכרומוזום.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מתארים שיטות כדי לחקור את המיקום של טלומרים ו כרומוזום הקשורים חלבונים בפני שטח גרעיני כפולות מבודד spermatocytes מתוך האשכים דג זברה. אנו מצפים כי שיטות אלה יחולו על ניתוח של ספרציטים במינים אחרים של teleost עם הסתגלות לגודל של בדיקת.
בעוד רק כמה נוגדנים הועלו כדי להשתמש בחלב…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים טרנט ניומן ומאסדה שריפי על הערות על כתב היד ו נגוין על סיוע לייעל את השיטות למריחה ולצביעת כרומוזומים מן הדגים מייציטים. עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01 GM079115 הוענק S.M.B.
Materials
| 1.5 mL centrifuge tubes | Several commercial brands available | ||
| 1.5 mL microcentrifuge tube rack | Several commercial brands available | ||
| 16% formaldehyde, methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 2 mL | Several commercial brands available | ||
| 24 x 50 mm glass coverslips | Corning | 2980-245 | |
| 24 x 60 mm glasscoverslips | VWR International | 16004-312 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | 363696 | |
| Autoclave bag | Several commercial brands available | Used to make plastic coverslips. | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605-100 | Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water. |
| Cell Strainer, 100 µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed | Biotium | 203775-500uL | Use at 1:1000 |
| Chicken anti-zfSycp1 | Generated by Burgess lab | N/A | Use at 1:100 |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C0130-500MG | |
| Coplin jar | Several commercial brands available | ||
| DNase I, grade II from bovine pancreas | Roche Diagnostics | 10104159001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | MT10014CV | |
| Dumont No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | Two are required for dissecting the testes. |
| Eppendorf Tubes, 5 mL | VWR International | 89429-308 | |
| Formamide | Fisher Scientific | BP228-100 | |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11039 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11042 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-hDMC1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8973 | Does not work in our hands |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Use at 1:1000 |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10mL | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393-100KU | |
| Humidity chamber | Fisher Scientific | 50-112-3683 | |
| Hybridization Oven | VWR International | 230401V (Model 5420) | |
| Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | Model Classic C25 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Kimwipes | Kimerbly-Clark Professional | 34155 | Used for the humidity chamber |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Microscope | Several commercial brands available | Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient. | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse anti-hamsterSCP3 | Abcam | ab97672 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hMLH1 | BD Biosciences | 550838 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hRPA | Sigma-Alrich | MABE285 | Does not work in our hands |
| Na2HPO4 · 7 H2O | Fisher Scientific | S373-500 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Photo-Flo 200 solution | Electron Microscopy Sciences | 74257 | |
| Plastic transfer pipettes | Several commercial brands available | ||
| PNA TelC-Alexa647 | PNA Bio Inc | F1013 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| PNA TelC-Cy3 | PNA Bio Inc | F1002 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36970 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36971 | |
| Rabbit anti-hRPA | Bethyl | A300-244A | Use at 1:300 |
| Rabbit anti-hSCP3 | Abcam | ab150292 | Use at 1:200 |
| Rabbit anti-hRad51 | GeneTex | GTX100469 | Use at 1:300 |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Supercut Scissors, 30° angle, 10 cm | Fisher Scientific | 50-822-353 | Can also use any pair of small scissors. |
| Sylgard kit | Fisher Scientific | NC9897184 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight. |
| Trypsin | Worthington Biochemical | LS003708 | |
| Trypsin inhibitor from chicken egg white | Sigma-Aldrich | T9253-500MG | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 170-6531 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. |
| Vannas Spring Scissors – 4 mm (micro scissors) | Fine Science Tools | 15018-10 |
References
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews Genetics. 13, 493-504 (2012).
- Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, (2015).
- Blokhina, Y. P., Nguyen, A. D., Draper, B. W., Burgess, S. M. The telomere bouquet is a hub where meiotic double-strand breaks, synapsis, and stable homolog juxtaposition are coordinated in the zebrafish, Danio rerio. PLoS Genetics. 15, e1007730 (2019).
- Saito, K., Sakai, C., Kawasaki, T., Sakai, N. Telomere distribution pattern and synapsis initiation during spermatogenesis in zebrafish. Developmental Dynamics. 243, 1448-1456 (2014).
- Oliver-Bonet, M., Turek, P. J., Sun, F., Ko, E., Martin, R. H. Temporal progression of recombination in human males. Molecular Human Reproduction. 11, 517-522 (2005).
- Gruhn, J. R., Rubio, C., Broman, K. W., Hunt, P. A., Hassold, T. Cytological studies of human meiosis: sex-specific differences in recombination originate at, or prior to, establishment of double-strand breaks. PLoS One. 8, e85075 (2013).
- Pratto, F., et al. Recombination initiation maps of individual human genomes. Science. 346, 1256442 (2014).
- Brown, P. W., et al. Meiotic synapsis proceeds from a limited number of subtelomeric sites in the human male. American Journal of Human Genetics. 77, 556-566 (2005).
- Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1. Genes and Development. 18, 1527-1532 (2004).
- Saito, K., Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C., Sakai, N. Isolation and cytogenetic characterization of zebrafish meiotic prophase I mutants. Developmental Dynamics. 240, 1779-1792 (2011).
- Sansam, C. L., Pezza, R. J. Connecting by breaking and repairing: mechanisms of DNA strand exchange in meiotic recombination. Febs Journal. 282, 2444-2457 (2015).
- Feitsma, H., Leal, M. C., Moens, P. B., Cuppen, E., Schulz, R. W. Mlh1 Deficiency in Zebrafish Results in Male Sterility and Aneuploid as Well as Triploid Progeny in Females. Genetics. 175, 1561-1569 (2007).
- Dia, F., Strange, T., Liang, J., Hamilton, J., Berkowitz, K. M. Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes. Journal of Visualized Experiments. (129), e55378 (2017).
- Moens, P. B. Zebrafish: chiasmata and interference. Genome. 49, 205-208 (2006).
- Lisachov, A. P., Zadesenets, K. S., Rubtsov, N. B., Borodin, P. M. Sex chromosome synapsis and recombination in male guppies. Zebrafish. 12 (2), 174-180 (2015).
- Ocalewicz, K., Mota-Velasco, J. C., Campos-Ramos, R., Penman, D. J. FISH and DAPI staining of the synaptonemal complex of the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) allow orientation of the unpaired region of bivalent 1 observed during early pachytene. Chromosome Research. 17 (6), 773 (2009).
