Preparação do Cromossomo Meioético Se espalha de espermatocitocitos de zebrafish
Summary
Os spreads de superfície nuclear são uma ferramenta indispensável para estudar eventos cromossomos durante a meiose. Aqui demonstramos um método para preparar e visualizar cromossomos meioóticos durante a profase I de espermatotatocitos de zebrafish.
Abstract
A meiose é o processo celular-chave necessário para criar gametes haploides para reprodução sexual. Os organismos modelo têm sido fundamentais para entender os eventos cromossomos que ocorrem durante a profase do meioético, incluindo a combinação, a sinapse e eventos de recombinação que garantem a segregação adequada do cromossomo. Embora o mouse tenha sido um modelo importante para entender os mecanismos moleculares subjacentes a esses processos, nem todos os eventos meioticéticos neste sistema são análogos à meiose humana. Recentemente demonstramos o potencial excitante do zebrafish como um modelo de espermatogênese humana. Aqui descrevemos, em detalhes, nossos métodos para visualizar cromossomos meioóticos e proteínas associadas em preparações de propagação de cromossomos. Esses preparativos têm a vantagem de permitir a análise de alta resolução das estruturas cromossais. Primeiro, descrevemos o procedimento de dissecação de testículos de zebrafish adultos, seguido de dissociação celular, lise e disseminação dos cromossomos. Em seguida, descrevemos o procedimento para detectar a localização de proteínas cromossomos mestióticas, por detecção de imunofluorescência, e sequências de ácido nucleico, por fluorescência na hibridização situ (FISH). Essas técnicas compreendem um conjunto útil de ferramentas para a análise citológica da arquitetura de cromatina meiotic no sistema de zebrafish. Pesquisadores da comunidade de zebrafish devem ser capazes de dominar rapidamente essas técnicas e incorporá-las em suas análises padrão da função reprodutiva.
Introduction
A reprodução sexual prossegue através da combinação de dois gametes haploides, cada um carregando metade do complemento cromossomo de uma célula somática. Meiosis é uma divisão de células especializadas que produz gametas haploides através de uma rodada de replicação de DNA e duas rodadas sucessivas de segregação de cromossomos. Na profase I, os cromossomos homônimos (homologs) devem passar por pareamento, recombinação e sinapse, sendo este último caracterizado pela formação do complexo sinaponômico que compreende dois eixos homolog a ponteados pelo filaverso transversal, Sycp1(Figura 1A,B). A não execução desses processos pode levar à produção de gametes aneuploides, que são uma das principais causas de abortos em humanos1. Nosso conhecimento da coordenação entre emparelhamento, recombinação e sinapse tem sido facilitado por estudos em uma ampla gama de organismos, como levedura, C. elegans,rato e Drosophila,entre outros2. Embora o processo geral de emparelhamento cromossomo homônimo seguido de segregação seja bem conservado, sua dependência da recombinação e sinopse e da ordem desses eventos varia.
A formação de quebra de fio duplo meiotic (DSB), que inicia a recombinação homóloga, ocorre perto de telômeros agrupados no buquê durante leptotene e a sinopse segue logo após3,4. Essa configuração de formação dsb e iniciação de sinapse também é uma característica da meiose masculina em humanos, mas não no rato5,6,7,8,sugerindo que os zebrafish podem servir de modelo para a spermatogênese humana. Há também várias vantagens práticas de estudar a meio-peixe-zebra. Machos e fêmeas passam por gametogênese durante toda a idade adulta, suas gônadas são facilmente acessíveis, e centenas de descendentes são gerados a partir de uma única cruz. Além disso, os embriões são transparentes e se desenvolvem externamente, o que facilita a detecção precoce de aberrações em desenvolvimento embrionário devido aos gametes aneuploides3,9. As desvantagens do uso de zebrafish são de que eles são lentos para atingir a maturidade sexual (~60 dias) e a quantidade de material necessário para propagações de superfície nuclear deve ser coletada de ~10-20 animais adultos, dependendo de seu tamanho.
Os preparativos de disseminação do cromossomo meioético são uma ferramenta vital para estudar dinâmicas cromossãs em todos os organismos modelo, uma vez que as principais assinaturas da dinâmica do cromossomo meioético podem ser sondadas. Em zebrafish, aspectos-chave da progressão do programa de meiotética e organização nuclear foram dissecados através da sondagem de superfícienuclear espalhadas, referidas aqui como spreads cromossomos, com anticorpos para detecção de proteínas e/ou ácidos nucleicos pelo PEIXE3,4,9,10,11. De fato, a localização polarizada de telômeros agrupados no buquê pode ser preservada na preparação de spread(Figura 1C). Recentemente, usamos cromossomo de espermatoósico de zebrafish, se espalha junto com métodos de detecção de fluorescência e microscopia de superresolução para elucidar a progressão detalhada da dinâmica do telômero de zebrafish, emparelhamento de cromossomo homólogo, localização de quebra de fio duplo e sinopse nas principais transições meioticas3. Aqui apresentamos métodos para preparar spreads cromossomos de espermatocitocitos dos testículos de zebrafish e, posteriormente, manchá-los com sondas de ácido nuclecítico de peptídeo fluorescente (PNA) a repetidas sequências de telômero e detecção de imunofluorescência de proteínas associadas ao cromossomo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui descrevemos métodos para sondar a localização de telômeros e proteínas associadas ao cromossomo na superfície nuclear se espalha de espermatocitoses isolados de testículos de zebrafish. Esperamos que esses métodos sejam aplicáveis para análise de espermatocitocitos em outras espécies teleast com ajuste ao tamanho dos testículos.
Embora apenas alguns anticorpos tenham sido elevados para proteínas meioticas de zebrafish, tivemos sucesso usando os seguintes anticorpos levantados…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Trent Newman e Masuda Sharifi por comentários sobre o manuscrito e An Nguyen por ajudarem a otimizar métodos para espalhar e manchar cromossomos de meiocitos de zebrafish. Este trabalho foi apoiado pelo NIH R01 GM079115 concedido à S.M.B.
Materials
| 1.5 mL centrifuge tubes | Several commercial brands available | ||
| 1.5 mL microcentrifuge tube rack | Several commercial brands available | ||
| 16% formaldehyde, methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 2 mL | Several commercial brands available | ||
| 24 x 50 mm glass coverslips | Corning | 2980-245 | |
| 24 x 60 mm glasscoverslips | VWR International | 16004-312 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | 363696 | |
| Autoclave bag | Several commercial brands available | Used to make plastic coverslips. | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605-100 | Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water. |
| Cell Strainer, 100 µm | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed | Biotium | 203775-500uL | Use at 1:1000 |
| Chicken anti-zfSycp1 | Generated by Burgess lab | N/A | Use at 1:100 |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C0130-500MG | |
| Coplin jar | Several commercial brands available | ||
| DNase I, grade II from bovine pancreas | Roche Diagnostics | 10104159001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | MT10014CV | |
| Dumont No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | Two are required for dissecting the testes. |
| Eppendorf Tubes, 5 mL | VWR International | 89429-308 | |
| Formamide | Fisher Scientific | BP228-100 | |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11039 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11042 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-hDMC1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8973 | Does not work in our hands |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | Use at 1:1000 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Use at 1:1000 |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023-10mL | |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393-100KU | |
| Humidity chamber | Fisher Scientific | 50-112-3683 | |
| Hybridization Oven | VWR International | 230401V (Model 5420) | |
| Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | Model Classic C25 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Kimwipes | Kimerbly-Clark Professional | 34155 | Used for the humidity chamber |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Microscope | Several commercial brands available | Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient. | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse anti-hamsterSCP3 | Abcam | ab97672 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hMLH1 | BD Biosciences | 550838 | Does not work in our hands |
| Mouse anti-hRPA | Sigma-Alrich | MABE285 | Does not work in our hands |
| Na2HPO4 · 7 H2O | Fisher Scientific | S373-500 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Photo-Flo 200 solution | Electron Microscopy Sciences | 74257 | |
| Plastic transfer pipettes | Several commercial brands available | ||
| PNA TelC-Alexa647 | PNA Bio Inc | F1013 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| PNA TelC-Cy3 | PNA Bio Inc | F1002 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36970 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | ThermoFisher Scientific | P36971 | |
| Rabbit anti-hRPA | Bethyl | A300-244A | Use at 1:300 |
| Rabbit anti-hSCP3 | Abcam | ab150292 | Use at 1:200 |
| Rabbit anti-hRad51 | GeneTex | GTX100469 | Use at 1:300 |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Supercut Scissors, 30° angle, 10 cm | Fisher Scientific | 50-822-353 | Can also use any pair of small scissors. |
| Sylgard kit | Fisher Scientific | NC9897184 | Prepare as per manufacturer's instructions. |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight. |
| Trypsin | Worthington Biochemical | LS003708 | |
| Trypsin inhibitor from chicken egg white | Sigma-Aldrich | T9253-500MG | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 170-6531 | Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. |
| Vannas Spring Scissors – 4 mm (micro scissors) | Fine Science Tools | 15018-10 |
References
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