ラット型異形肝移植モデルにおける動脈リコネクション後の合併症の減少

研究はげっ歯類の取り扱いと手術のガイドラインに従って行われ、研究プロトコルは大学医療ネットワーク動物ケア委員会(UHN AUP #:5840.3)によって承認され、カナダ動物ケア評議会のガイドラインに従っています。この研究では、オスのルイスラット(株LEW/SsNHsd)、生後12〜14週、体重は250〜300gである。 1. 機器のセットアップ 針ホルダーで31Gの鋭い先端を保持し、先端が切れるまで先端を繰り返し前後に曲げて鈍いL字型インジェクターを作成します。平らな金属ファイルを使用して、鈍く、注入器の端を滑らかにします。 3D プリントベースからポータル静脈 (PV) と赤外線下静脈 (IHVC) カフスをメスで切る (補足材料 1、補足材料1 、図 1、補足図 1)。注:3D設計ソフトウェアは、3Dプリンタ(表)に自動組み込み樹脂39、40(,40補助材料1-10に含まれるすべての3Dプリント材料の仕様)を使用して印刷されるカフスとホルダーを設計するために使用されます。 22 G カテーテルを両面傾斜チューブ (長さ 3.5 mm) に切り取るために、新しいメスを使用します。メスを使用して、胆管(BD)ステントの表面にそっとエッチライン(チューブの壁を切断しないでください)。これらのエッチングは、手順中にネクタイが滑るのを防ぎます。 新しいメスを使用して、24 G カテーテルを片側傾斜エッジ チューブ (長さ 2.0 mm) に切断し、新しい動脈ステントの表面にいくつかの傷を作成します。注:ステントへの圧力の適用を避けることによってBDステントの管腔の狭いまたは閉塞を防ぐ。ステントが狭窄または閉塞した場合、レシピエントの生存は胆道閉塞によって損なわれる。 2. ドナー操作 ヒートパッドを37°Cに設定し、手術プラットフォームの下に置きます。ラットのコア温度を直腸プローブで監視できるように、温度モニターをオンにします。イオブルラン麻酔装置を設置する。注意:手術中、呼吸数、心拍数、臓器/粘膜の着色、ペダル離脱反射の有無を記録して麻酔の深さを監視します。 すべての必要な器具や材料(すなわち、はさみ、鉗子、ガーゼ、ヘパリン、レトラクター、中間部パッド、綿の先端、4-0シルク、7-0シルク、8-0)で外科的にドレープされたワークスペースを配置します非吸収性無菌縫合糸、および10-0非吸収性モノフィラメント縫合糸)は、外科プラットフォームの側面に便利に配置した。 リンガーの乳酸溶液と300 IUのヘパリンナトリウムを含むすべてのソリューションを使用してワークステーションを配置します( 材料表を参照)。 動物の重量を量る。5%のイソフルラン、5 L/分の空気流、および70%FiO2 誘導で麻酔室に置くことによってドナーラットを麻酔します。ラットが意識を失うと、麻酔を3%のイソフルラン、0.5 L/分の空気流、および70%FiO2に減少させる。つまんでペダルの反応の欠如を確認してください。 腹部の皮膚を準備します。電気剃毛を使用して、腹側から毛皮を取り外します。ドナーの呼吸率が安定して深い速度になるまで注意深く観察する。 外科的にドレープされたラットを置き、腹側が天井に面するようにします。3%のイソフルラン、0.5 L /分の空気流、および70%FiO 2で麻酔スカベンジャーに鼻を置きます。 腹壁をポビドネヨウ素で準備し、中線から外に働き、続いて70%エタノールを使用します。 丸い先端の外科用はさみを使用して、シフィイドプロセスから陰部のシンフィシスへの切開を行い、その後、両側の横切り切開で暴露を改善する。腹壁からの出血を止めるには、焼灼のための二極性電気外科ユニットを使用します。切開後、メンテナンスイソフルランを2%、0.5 L/分の気流、および70%FiO2に減らす。注:毎秒約1呼吸の呼吸速度を達成するためにイオブルラン気化器を調整し、定期的に手術の過程で麻酔の深さを評価することを忘れないでください。 xiphoidプロセスに4-0シルクステッチを置き、縫合糸を使用して胸壁のセファルドを引き込みます。麻酔スカベンジャーを所定の位置に保持する構造の上部にシルク糸をテープで貼ります。ドナーラットの体腔を3Dプリントされたレトラクター( 補足材料3を参照)を腹部の両側に置いたままにします(レトラクタは外科プラットフォーム上の磁石に取り付けられたゴムバンドで所定の位置に保持されます)。注:蚊の鉗子はまた、xiphoidプロセスを把握し、セファラードを引き込むために使用することができます。テープを使用して蚊の鉗子を所定の位置に固定します。 リンガーの乳酸溶液で湿らせた不織布ガーゼスポンジ(4cm x 4cm)を使用して、小腸と大腸を囲みます。小さな濡れた不織布のガーゼスポンジ(2cm x 4 cm)を使用して、肝臓を静かに覆います。 小さなロールガーゼを中間部の下に置き、腹部を持ち上げ、上腹部の下静脈(SHVC)の露出を改善します。 ファルシフォーム靭帯を切る。マイクロ鉗子を使用して、左横隔膜静脈をSHVCから分離する。左横隔膜静脈を7-0シルクでリゲートし、SHVCの近くに滞在します。注:リンガーの乳酸塩で湿らせた小さな、濡れた、不織布ガーゼスポンジを使用して、シフォシドプロセスから肝臓を静かに引き込み、左横隔膜静脈を露出させます。 丸い先端のはさみで左三角形と胃肝靭帯を切ります。 小さな濡れた不織布ガーゼスポンジを使用して、左葉と中央ローブをxiphoidプロセスに向かって慎重に引き戻して、コーデートローブを露出させます。葉突葉を肝臓の残りの部分から分離する靭帯を丸い先端のはさみで解放する。 食道に近い二極電気外科ユニットを使用して、肝食道靭帯を分割し、分離する。注:小腸と大腸を腹腔の左側にそっとシフトし、濡れた不織布ガーゼで覆います。 IHVCを覆う後腹性と脂肪を解剖する。IHVCを左腎静脈まで露出させ、隔離する。 綿棒でIHVCをわずかに置き換えて露出し、双極性電気外科ユニットを使用してIHVCの右側に合流する小さな静脈を焼灼する。また、IHVCにマージする任意の腰椎静脈を焼灼します。 右上副腎(副腎)静脈を2つの7-0シルク合字の間で分割し、IHVCの近くに留まる。穏やかな牽引の下でこれらを切断することによって、その後靭帯から肝臓を解放します。 右腎動脈から右腎静脈を分離し、細かい先端の焼灼を使用して隣接する組織から.右腎静脈オリフィスを8-0で密封する非吸収性無菌合字。 PVを覆う脂肪を取り外して、PVを結合する点で幽門静脈(右胃静脈)と脾臓静脈を見つけます。7-0シルクでこれらの静脈をリゲートし、8-0でPVに最も近い側面を補強する非吸収性の無菌縫合糸口。ネクタイの間で静脈を分割します。メモ:小さなぬれたガーゼを使用して十二指腸を引き戻してPVを露出させます。脂肪がPVから切り離されるとカフの挿入が容易になり、PVカフの狭窄も防ぎます。 300 IUのヘパリンナトリウムをIHVCに注入し、1mLの注射器(31G針)を用いて1mLの通常の生理食塩水に希釈した。 BD分岐の5mm下に切開を行い、BDステントを一般的なBDに挿入します。余分なネクタイは、分岐の下に10ミリメートルである切開の下に行うことができます。ステントが固定されたら、この2つのタイ間のBDを切断します。 BDまたは適切な肝動脈(HA)をクリップしないでください。切開時のBDの3時位置に10-0非吸収性無菌手術用モノフィラメント縫合糸を、再接続後のねじれを防ぐためのマーカーとして配置する。 適切なHAを露出し、2つの7-0シルク合字の間で胃十二指腸動脈(GDA)を分割します。左の胃動脈、脾動脈、およびセリアックの体幹を露出する。3つの動脈を遠位と離陸の近くに結び付ける。 左の胃動脈、脾動脈、およびセリアックの幹を切り、動脈の間を結ぶ。20 mLの冷たい(4°C)の乳酸溶液を21.5G針の20 mLシリンジを用いて、ゆっくりとPVに注入します。左腎静脈がIHVCと合流する地点の下に静脈を切り、フラッシュ流出を可能にする。注:針は、ヒラムから可能な限り遠く保つ必要があります。ドナー肝臓冷灌流は1〜2分の間持続するべきである。肝臓を洗い流しながら、もう一方の手を使って冷たいリンガーの乳酸を肝臓表面に噴出させます。 フラッシュ後にPVトランクを脾静脈の下に切ります。左腎静脈のすぐ上にIHVCをカット.ダイヤフラムに隣接するSHVCを切ります。 肝臓と後腹性の間の靭帯と結合組織を切断します。注意:上部の騎兵吻合を容易にするために、前壁と後部SHVC壁の十分な長さがあることを確認してください。できるだけ長さを保持するために、ダイヤフラムに隣接して切断することが重要です。 肝臓を腹部から取り除いた後、4°Cリンガーの乳酸溶液で満たされた皿に素早く入れます。冷たい温度を維持するために氷パッドの上に皿を置きます。 ドナーラットの遺骨を廃棄します, 機関のガイドラインに従って. 3. ドナーラット肝臓製剤(「バックベンチ」) 冷たいペトリ皿に、ドナーラット肝臓を水没させる十分な量の4°Cリンガーの乳酸溶液を充填します。下面が上向きになるように、皿に浮かぶドナー肝臓を慎重に回転させます。PVとIHVC(補足材料1 と 補足材料2)の袖口を皿に入れます。 PVカフを通してPVを引き、静脈の端をカフの上に折ります。7-0シルクを使用して袖口の周りにしっかりとPVを結びます。PVを4°Cリンガーの乳酸溶液の10 mLで洗い流します。 フラッシュなしで、IHVC でステップ 3.2 を繰り返します。 セリアックトランクの周りの脂肪組織を取り除きます。セリアック幹、脾動脈、および左胃動脈の分岐を切り開くことによって、より大きな動脈スリーブカフを形成する(図2A)。注:動脈ステントを共通HAに挿入することは困難です。ステントを挿入する前に、鉗子で動脈を数回伸ばしてまっすぐにします。ステントの傾斜が上向きで、動脈がねじれていないことを確認してください(図2B)。 長さ1.5mm24G動脈ステントを、動脈カフを介してドナー共通HAに入れます。8-0でステントを固定ポリプロピレン合字(図2C)を、リンガーの乳酸溶液でステントを洗い流す(図2D)。 マイクロクランプ(長さは4〜6mm)を近位IHVCに配置し、ポータル再灌流後の失血を防ぎ、空気塞栓症を回避することを目的としています。 肝臓を回転させ、その上側を露出させます.2 つの 8-0 を挿入するSHVCの側面および内側の端にポリプロピレンテーパー点縫合線。 肝臓を4°Cに保ち、ドナーに移植する準備ができているようにします。 4. 受信者の操作 上記のドナー操作のセクションを参照し、手順 2.1 から 2.4 を繰り返します。注:生後12〜14週齢の雄ルイスラットがここでは使用され、ドナーよりも重い5〜20gの重さがあります。手術中、呼吸数、心拍数、臓器/粘膜の着色、ペダル離脱反射の存在を確認して、麻酔の深さを監視します。 外科的にドレープされたラットを、腹側を上向きにして置きます。イオブルラン吸入のために麻酔スカベンジャーに鼻を置きます。眼を潤滑剤でしっとりする。まずプロビドネヨウ素で腹壁を準備し、次に70%エタノールで準備します。 腹側腹壁の両側にリンゲルの乳酸溶液を皮下に5mL注入する。手術助手の補佐を使用して、腹腔内手術の前に200mg/kgピペラシリンナトリウムを筋肉内に左腹壁に注入します。さらに、右腹壁に皮下10mg/mLブピバカインの0.5mLを投与する。注:ピペラシリンナトリウムの同じ用量を1x/日で3日間投与します。 最初にプロビドネ-ヨウ素を使用して、次に70%エタノールで腹壁を再び準備します。胸骨xiphoidから陰部のシンフィシスの上に1cmの中線切開を行います。イソフルランを2%、0.5 L/分の空気流量に減少させ、切開後の麻酔の維持のためにFiO2 70%を減らします。注:蚊の鉗子は、xiphoidプロセスを把握し、セファルドを引き込むために使用することができます。テープを使用して蚊の鉗子を所定の位置に固定します。体腔は外科プラットホームに磁気的に握られるゴムバンドが付いている両側の3Dプリントされたレトラクターによって開いたままにされる( 補足材料3を参照)。 リンジャーの乳酸溶液で湿った不織布のガーゼスポンジ(4cm x 4 cm)で小腸と大腸を包みます。リンジャーの乳酸溶液で湿らせた小さな(2cm x 4cm)、濡れた不織布ガーゼスポンジを使用して、肝臓を優しく覆います。 小さな3Dプリントの支持パッド(バックホルダー; 補助材料4を参照)をラットの中間部の下に置き、スピンを曲げることによってSHVCの露出を増やします。これはラットで安全に行われ、外科医の助手によって実行される。 ファルシフォーム靭帯を切断し、小さな湿った不織布ガーゼスポンジを使用して、xiphoidプロセスを静かに引き離し、左横隔膜静脈を露出させます。マイクロ鉗子を使用して、左横隔膜静脈をSHVCから分離する。横隔膜に近い7-0シルクで左横隔膜静脈をリゲートします。 丸い先端のはさみで左三角形と胃肝靭帯を切ります。 左葉と中葉を小さな湿った不織布ガーゼスポンジでxiphoidプロセスに向かって繊細に引っ張り、コーデートローブを明らかにします。原因葉と肝臓の残りの部分を分離する靭帯を切断します。 肝食道靭帯を分割し、肝臓の近くに滞在し、双極性電気外科ユニットで任意の出血点を凝結させる。肝臓の後部の側面で靭帯を切る。 小腸と大腸を慎重に腹腔の左側に引き込み、濡れた不織布ガーゼで覆います。 IHVCの後腹性と脂肪を解剖して、IHVCを右腎静脈まで露出させ、隔離する。綿棒でIHVCをわずかに置き換え、二極電気外科ユニットを使用してIHVCの右側に合流する小さな静脈を焼灼する。同様に、IHVCに入る腰部静脈を焼灼する。 2つの7-0シルク合字の間で右の上副腎(副腎)静脈を分割します。穏やかな牽引の下でそれらを切断することによって、その後靭帯から肝臓を解放します。 リンガーの乳酸溶液で湿らせた小さな湿ったガーゼを使用して、十二指腸を後退させ、PVを露出させます。PVと幽門静脈の分岐から脂肪を取り外します。 BDを0.5cm下に分割し、遠位共通BDにBDステントを挿入します。余分なネクタイは、分岐の近くに、切開の上に配置することができます。BDを肝臓の近くでカットしますが、ネクタイに遠位します。 BDを鉗子で分離し、BDまたは適切なHAをクリッピングしないようにしてください。再接続後のねじれを防ぐためマーカーとして、BDの3時位置に10-0非吸収性モノフィラメント(例えばエチロン)ステッチを配置します。 適切な HA と共通の HA と GDA の分岐を公開します。左 HA、中央 HA、および右 HA を公開します。CHA分岐部に遠位する3つの動脈を結び、肝臓に近い動脈を切断します, ネクタイの上に. SHVCの後ろに長い薄いガーゼを入れてください。 IHVC の後ろに 3D プリントされた IHVC ホルダーまたは「ハンドル」(Cava 150g 2.1;補足資料 5を参照) を配置し、10-0 非吸収性モノフィラメンタチュア縫合を使用して 3D プリントされた「ハンドル」の端を縫い合わせます (図 3A)。 3DプリントされたPVホルダーまたは「ハンドル」(ポルタ1.4.1- 補足材料6)をPVの後ろに置き、肝臓に直接劣り、10-0非吸収性モノフィラメント縫合糸を使用して3Dプリントされた「ハンドル」の端を縫い合わせます。 7-0シルクの合字を3Dプリントホルダー(IHVCとPV)の下にゆるやかに結びます(図3A)。 3Dプリントされた騎兵ホルダーのすぐ下にあるはずの右腎静脈のすぐ上にIHVCをクランプします。 3DプリントされたPVホルダーのすぐ下にあるはずの幽門静脈のすぐ上にPVをクランプします。この時点で始まるアンヘパティック時間を記録します。麻酔の維持のために0.5%イソフルラン、0.5 L/分の空気流、および70%FiO2 に減少させる。 3mLの注射器を用いてPVの分岐を介して37°Cリンガーの乳酸溶液の2mLを27G針を取り付けたフラッシュ。 キッツミラークランプで肝臓の上にSHVCをクランプします。同じクランプの下にカット, 可能な限り肝臓の近くに滞在. PV と IHVC の両方の 3D プリントされたホルダーの上に切り取ります (図 3A)。受信者の肝臓を取り除く。ドナー肝臓を慎重に向け、上部の騎兵吻合を作成できるように、レシピエントの体内に配置します。 8-0 を使用するポリプロピレンランニング縫合糸は、ダイヤフラム近くの受取人のSHVCとドナーのSHVCに参加する。まず、8-0の場所の縫合糸ドナーとレシピエントSHVCの左右の側面にポリプロピレン。次に、これらを静脈壁の外側に結びます。 左の8-0を使用する左から右にSHVCの後壁をステッチし、右8-0に結ぶポリプロピレンポリプロピレン。左の8-0を使用するポリプロピレンは、左から右にSHVC吻合の前壁をステッチし、縫合線の最後の3分の2を緩く残す。任意の気泡を抽出することを確認しながら、緩いステッチの間にリンガーの乳酸の20 mLを使用してフラッシュ。 ゆるいステッチを締め、SHVCの外側にネクタイを作ります。残りの8-0をカットポリプロピレン縫合。注: クリップは、受信者の SHVC を所定の位置に保持し、ドナーと受信者の SHVC を一緒に縫い合わせるのが容易になります。SHVC 吻当の持続時間を記録します。この時点で、ポルタハンドルはホルダーアーム装置(ホルダーアームマクギル+ホルダーミニアームLAB+ホルダーアームソフトパーツ1.3;補足材料7、補足材料8、補足材料9をそれぞれ参照)に取り付けられ、肝臓に直接劣る。この装置は、3D プリントホルダーベース(ホルダーベース 3.1;補足材料 10を参照)でサポートされています。 PVカフ(補足材料1)をドナーから受け手PVに挿入し、7-0シルクのネクタイを締めます。ドナーとレシピエントのPVをリンジャーの乳酸溶液で、接続前に37°Cに温めます。 SHVCから外傷性クランプを取り外し(最初に)、次にPV(第2)の微小血管クリップを取り外します。温かい血液で肝臓を再浸透;この時点で、無肝相時間は終了した。この時間を記録します。 肝臓の上に10mLの温かいリンジャーの乳酸溶液を注ぎ、温めます。丸い先端のはさみで3Dプリントされたホルダーを取り外します(固定ステッチをカットします)。 ドナー IHVC カフ (補足材料 2) を受け取る IHVC に挿入し、7-0 シルクタイで固定します。最初にドナー IHVC クリップを取り外し、次に受信者のクリップを取り外します (図 3B)。カバは、上述のようにホルダー装置とホルダーベースに取り付けられ、 丸い先端のはさみ(固定ステッチを切る)で3Dプリンタホルダー(ポルタとカバ)を取り外します。図3C)を接続したIHVC(図3D)Dを生成する。 慎重に出血のために肝臓の周りの領域を調べます.37°Cリンガーの乳酸溶液を体腔内に3mLインスティル。 動脈吻合: ステントを越えて伸びるドナーからセリアック幹の部分を切断する。 受取人の適切なHAをクランプし、最後にネクタイを切断します。血管を取り囲む余分な組織を切り落とす(図4A)。リンガーの乳酸溶液を使用して、ドナーとレシピエントの両方の容器の内腔を洗い流します。 受取人の適切なHAをドナーHAステントのスリーブに引き込み、HA吻当を達成します。(ドナー)HAの左側面を通って10-0エチロンを置き、ステントの遠位オリフィスの上に2.5mm(外側から内側へ)、その後、湾曲した針で導かれる10-0エチロン(4cmの長さ)でステントの端を通って出て行く(図4B)。 受取人に適切なHA 0.5mmを容器オリフィスの下にトランスフィックスし、最初にステッチを(内側から外側へ)血管の左側に、次に(外側から内側へ)動脈の右側に置きます。 (ドナー)HAの右壁を通って縫合を内側から外側に、元のステッチと同じステントオリフィスから離れた位置に置きます。10-0 非吸収性モノフィラメントの両端を引き上げ、受信者の適切な HA を HA ステントに滑り込ませます (図 4C)。注:血液のポンピングを観察してください。1つの選択肢は、血液が吻合を通してポンピングしていることを確認するためにドナーGDAを切断することです。GDAが切断された場合は、手順の次のステップに進む前に、動脈を再結合してください。 10-0非吸収性モノフィラメントをドナーHA(図4D)に結び付ける。動脈吻動はこれで完成です。 胆道吻合: 受け手の BD とステントの周囲にゆるやかにネクタイを置き(図 5A)、BD ステントを取り外します。A胆道接続が完了する前に、レシピエントとドナーの両方のBDをフラッシュします。 ドナーのBDステントを受け手の胆管(図5B)に挿入し、以前に受取人BDの周りに置かれたネクタイを締めます(図5C)。 腸を体腔に戻します。37°Cリンガーの乳酸溶液を2mLを空洞に入れ、洗浄する。溶液の一部をガーゼで浸します。 5-0モノクリルで頭頂部腹膜と皮膚を縫い上げる前に、腸が元の位置に戻っていることを確認してください。 5-0モノクリルで2層の切開を閉じます。縫い付けられた頭頂部の周りに0.5%ブピバカインの0.5mLを注入し、皮膚が一緒に縫い合わされたらこれを繰り返します。 ケージに移すときに、受け手のネズミをペーパータオルにそっと振り込みます。目覚めの時から水と食べ物への動物の自由なアクセスを許可します。暖かい水循環毛布をケージの半分の下に24〜38時間保管してください。1つのラットは、即時術後の期間中に1つのケージに指定されます。 5. 術後ケア 食品ペレットを水に浸し、ケージの床のペトリ皿に入れます。 ラットの心拍数、呼吸数、皮膚の色を監視します。 術後1日、2日、3日目にピペラシリンを投与する。ブプレノルフィンを皮下に投与し、行動の変化、無気力、手入れの行きのない毛皮、うつ病、突然変異、または最初の72時間の食欲不振などの痛みの徴候を監視する。注:痛みは移植後3日間、少なくとも1日2倍、その後少なくとも1日1倍以降に評価されます。