JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
italiano

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

Complicazioni ridotte dopo la riconnessione arteriosa in un modello di ratto di trapianto di fegato ortotopico

Published: November 07, 2020
doi:
10.3791/60628
, , , , , , , , , , , ,
1Multi-Organ Transplant Program,University Health Network, 2Department of Immunology,University of Toronto, 3Department of Laboratory Medicine and Pathobiology,University of Toronto

Summary

L’obiettivo di questo studio è quello di modificare il modello di trapianto di fegato ortotopico per rappresentare meglio il trapianto di fegato umano e migliorare la sopravvivenza del destinatario. Il metodo presentato ristabilisce l’afflusso arterioso epatico collegando l’arteria epatica comune del fegato donatore all’arteria epatica corretta del fegato ricevente.

Abstract

Il modello di trapianto di fegato ortotopico (OLT) ratto è un potente strumento per studiare il rigetto acuto e cronico. Tuttavia, non è una rappresentazione completa del trapianto di fegato umano a causa dell’assenza di riconnessione arteriosa. Descritto qui è una procedura di trapianto modificata che include l’incorporazione della riconnessione dell’arteria epatico (HA), portando ad un netto miglioramento degli esiti dei trapianti. Con un tempo anepatico medio di 12 min e 14 s, la riconnessione HA si traduce in una migliore perfusione del fegato trapiantato e un aumento della sopravvivenza dei destinatari a lungo termine dal 37,5% all’88,2%. Questo protocollo include l’uso di polsini e supporti stampati in 3D per collegare la vena del portale e l’infrahepatic inferiore vena cava. Può essere implementato per studiare più aspetti del trapianto di fegato, dalla risposta immunitaria e l’infezione agli aspetti tecnici della procedura. Incorporando un metodo semplice e pratico per la riconnessione arteriosa utilizzando una tecnica microvascolare, questo protocollo OLT del ratto modificato imita da vicino gli aspetti del trapianto di fegato umano e servirà come un modello di ricerca prezioso e clinicamente rilevante.

Introduction

Il peso globale delle malattie epatiche continua ad aumentare, con un aumento del 30% dei decessi correlati alle malattie epatiche dal 2005 al 20131,2. Il trapianto di fegato è spesso l’unico ricorso per i pazienti con malattia epatica in fase finale. Il fegato è il secondo organo solido più frequentemente trapiantato, e il numero di trapianti di fegato eseguiti a livello globale è aumentato del 7,25% dal 2015 al 20161,2. Nonostante la sua prevalenza, i tassi di sopravvivenza post-trapianto sono diventatistagnanti 3,4,5. Il tasso di sopravvivenza del paziente a 15 anni è del 53%, e il tasso di sopravvivenza del paziente a 20 anni può essere basso come 21%3,5. Mentre ci sono nuove entusiasmanti iniziative di immunobiologia che possono portare a nuovi trattamenti e migliori risultati clinici, non c’è ancora un piccolo modello animale affidabile in cui testarli.

Il modello OLT ratto è stato ampiamente utilizzato nell’indagine del trapianto di fegato, tra cui rigetto6,7,8,9,10, tolleranza immunitaria11, trapianto ischemia-reperfusione lesione12, immunosoppressione13, e lesione biliare albero14,15,16,17. Tuttavia, uno svantaggio del modello nella sua forma attuale è la sua elevata morbilità post-operatoria e mortalità18,19. Si tratta di un grave inconveniente che è in contrasto con l’operazione umana, e compromette la capacità di trarre conclusioni clinicamente rilevanti dal modello20.

Inoltre, gran parte di questa morbilità può essere attribuita a una riconnessione dell’arteria eparica (HA) assente oimperfetta 18. Anche se un passo critico nel trapianto di fegato umano, le difficoltà tecniche tendono a compromettere la riconnessione HA nel modello OLT ratto. Di conseguenza, l’anastomosi del dotto biliare (BD) è tenue e si traduce in alti tassi di perdita di bile e necrosi BD21. Al di là dell’alta incidenza di complicanze biliarie22, l’assenza di afflusso arteriosa altera la fisiologia del fegato innesto post-trapianto23, con ipossia nel donatoreepatico innesto 24 e danni al fegato osservati in lobi infiammati19,25,26. Rat OLT senza riconnessione arteriosa tende anche a promuovere la fibrosi27. Il protocollo OLT ratto descritto di seguito affronta questi problemi incorporando un semplice passo di ricostruzione HA con un metodo OLT rattoprecedentemente pubblicato 28, con conseguente conservazione del parenchyma del fegato e tassi di sopravvivenza migliorati.

Il trapianto di fegato ha tre fasi: (1) estrazione dell’innesto epatico dal donatore, (2) preparazione dell’innesto epatico del donatore e (3) sostituzione del fegato ricevente con l’innesto epatico. La procedura prevede la manipolazione di cinque strutture anatomiche: la vena cava inferiore suprahepatica (SHVC), la vena del portale (PV), la vena cava inferiore infraepatica (IHVC), l’arteria epatica (HA) e il dotto biliare (BD).

OLT nel ratto è stato introdotto per la prima volta da Lee et al. utilizzando l’anastomosi microsutura dello SHVC, PV e IHVC, e una tecnica pull-through per il BD29. Questo modello è stato successivamente migliorato attraverso l’uso della tecnica a due polsini nel 197930. Da allora, sono state proposte diverse tecniche alternative, con la maggior parte che si concentra sull’anastomosi venosa e utilizza una tecnica a due polsini con alcunemodifiche 31. Anche se l’anastomosi HA è stata descritta in precedenza nel modello OLT del ratto utilizzando tecniche come microsutura, polsino e maniche intraluminali26,31,32,33,34, queste tecniche spesso richiedono competenze microchirurgiche altamente addestrate, alterano significativamente la fisiologia del ratto e sono ostacolate da trombosi e/o complicazioni biliarie27,35.

Inoltre, la scelta della procedura chirurgica può anche influenzare il tempo anepatico (tempo dal bloccaggio fotovoltaico alla reperfusione dell’innesto attraverso il fotovoltaico ricostituito), che è fondamentale per il successo del trapianto di fegato di ratto. In particolare, alti tassi di sopravvivenza sono osservati con tempi anepatici di 15-20 min36e 30 min è il limite superiore per ilsuccesso 37,38. Pertanto, l’obiettivo di questo metodo è quello di implementare un modello OLT del ratto chirurgico meno invasivo e più facilmente adottabile che sia in grado di ricollegare l’arteria epatica, promuovere una perfusione efficiente del fegato trapiantato, mantenere il flusso al dotto biliare ricevente e preservare la condizione fisiologica del destinatario.

In dettaglio qui sono tutti i passaggi di questo protocollo rivisto, compresa la manipolazione del tronco celiaco del fegato donatore, nonché l’uso di 1) uno stent di 1,5 mm per eseguire una connessione manica extraluminale con il destinatario corretta HA, 2) una sutura in esecuzione per la ricostruzione SHVC, 3) due polsini in plastica stampati in 3D per la ricostruzione PV e IHVC39,40, 4) una riconnessione manica microvascolare per la HA18,27,41 e 5) una tecnica di stenting BD precedentemente descritta28. Sono inclusi anche altri due passaggi: un colore freddo attraverso il fotovoltaico e un regime antibiotico che si basa sui precedenti risultati17. Questo protocollo OLT ottimizzato riduce al minimo le complicazioni perioperatorie e la morbilità e modella più da vicino la procedura operativa chirurgica impiegata nel trapianto di fegato umano.

Protocol

Lo studio è stato eseguito secondo le linee guida di gestione e chirurgia dei roditori, e il protocollo di studio è stato approvato dall’University Health Network Animal Care Committee (UHN AUP : 5840.3) e segue le linee guida del Canadian Council of Animal Care. Lo studio utilizza ratti maschi Lewis (ceppo LEW/SsNHsd), 12-14 settimane di età, del peso compreso tra 250-300 g. 1. Configurazione dell’attrezzatura Tenere una punta affilata di 31 G con un supporto ad ago e creare un iniettore smussato a forma di L flettendo ripetutamente la punta avanti e indietro fino a quando la punta si spezza. Utilizzando un file di metallo piatto, smussare e lisciare l’estremità dell’iniettore. Tagliare la vena del portale (PV) e i polsini infrahepatici inferiori vena cava (IHVC) dalla base stampata in 3D con un bisturi (Materiale supplementare 1, Materiale supplementare 2, Figura 1, Figura supplementare 1).NOTA: un software di progettazione 3D viene utilizzato per progettare i polsini e i supporti, che vengono stampati su una stampante 3D(Tabella dei Materiali)utilizzando la resina autoclavable39,40 (specifiche per tutto il materiale stampato in 3D incluso nel Materiale supplementare 1-10). Utilizzare un nuovo bisturi per tagliare il catetere da 22 G in un tubo obliquo a due lati (3,5 mm di lunghezza). Utilizzando il bisturi, incidere delicatamente le linee sulla superficie dello stent del dotto biliare (BD) (non tagliare attraverso la parete del tubo). Queste incisioni impediranno che i legami scivolino durante la procedura. Utilizzare un nuovo bisturi per tagliare il catetere 24 G in un tubo a spigolo inclinato unilaterale (2,0 mm di lunghezza) e creare diversi graffi sulla superficie del nuovo stent arterioso.NOTA: prevenire il restringimento o l’occlusione del lume dello stent BD evitando l’applicazione di pressione allo stent. Se lo stent è ristretto o occluso, la sopravvivenza del destinatario sarà compromessa da un’ostruzione biliaria. 2. Operazione del donatore Impostare un cuscinetto termico a 37 gradi centigradi e posizionarlo sotto la piattaforma chirurgica. Accendere il monitor della temperatura in modo che la temperatura interna del ratto possa essere monitorata tramite sonda rettale. Impostare l’apparato di anestesia isoflurane.NOTA: Durante l’intervento chirurgico, monitorare la profondità dell’anestesia notando la frequenza respiratoria, la frequenza cardiaca, la colorazione delle membrane organi/mucose e la presenza di eventuali riflessi di ritiro del pedale. Disporre lo spazio di lavoro con tutti gli strumenti e i materiali necessari (ad esempio, forbici, forbici, garze, eparla, retrattili, cuscinetto centrale, punte di cotone, seta 4-0, 7-0 seta, 8-0 sutura sterile non assorbibile, e 10-0 sutura monofilamento non assorbibile) posto comodamente ai lati della piattaforma chirurgica. Disporre la postazione di lavoro con tutte le soluzioni, compresa la soluzione di lattato di Ringer e 300 IU di epatina di sodio (vedere Tabella dei materiali). Pesare l’animale. Anestetizzare il ratto donatore inserendolo nella camera anestetica con il 5% di isoflurane, 5 L/min di flusso d’aria e 70% FiO2 per l’induzione. Quando il ratto perde conoscenza, diminuire l’anestesia al 3% isoflurane, 0,5 L/min flusso d’aria, e 70% FiO2. Controllare la mancanza di risposta del pedale pizzicando il dito del piedi. Preparare la pelle dell’addome. Utilizzando un rasoio elettrico, rimuovere la pelliccia dal lato ventrale. Osservare attentamente il tasso di respirazione del donatore fino a raggiungere un tasso stabile e profondo. Posare il ratto drappeggiato chirurgicamente in modo che il suo lato ventrale sia rivolto verso il soffitto. Mettere il naso in uno spazzino di anestesia con 3% isoflurane, 0,5 L/min flusso d’aria e 70% FiO2. Preparare la parete addominale con povidone-iodio, lavorando dalla linea mediana verso l’esterno, seguita da 70% etanolo. Fai un’incisione dal processo xifoide alla si fitisi pubica usando una forbice chirurgica con punta rotonda, quindi migliora l’esposizione con un’incisione trasversale bilaterale. Fermare qualsiasi sanguinamento dalla parete addominale utilizzando un’unità elettrochirurgica bipolare per cautery. Dopo l’incisione, diminuire la manutenzione isoflurane al 2%, 0,5 L/min flusso d’aria, e 70% FiO2.NOTA: Regolare il vaporizzatore isoflurane per ottenere una velocità respiratoria di circa un respiro al secondo e ricordarsi di valutare regolarmente la profondità dell’anestesia durante il corso dell’operazione. Posizionare un punto di seta 4-0 nel processo xifoide e utilizzare la sutura per ritrarre il cefalo della parete toracica. Nastro il filo di seta alla parte superiore della struttura che tiene lo scavenger di anestesia in posizione. Tenere aperta la cavità del corpo del ratto donatore con retrattili stampati in 3D (vedi Materiale supplementare 3) posizionati su entrambi i lati dell’addome (i retrattili sono tenuti in posizione con elastici attaccati ai magneti sulla piattaforma chirurgica).NOTA: Le forcepi di zanzara possono anche essere utilizzate per afferrare il processo xifoide e ritrarre il cefalo. Fissare le force misura della zanzara in posizione utilizzando il nastro adesivo. Utilizzare una spugna di garza non tessuta (4 cm x 4 cm) smorzata dalla soluzione di lattato di Ringer per racchiudere l’intestino piccolo e grande. Utilizzare una spugna di garza piccola, bagnata e non tessuta (2 cm x 4 cm) per coprire delicatamente il fegato. Posizionare una piccola garza laminata sotto la sezione centrale per sollevare l’addome e migliorare l’esposizione della vena cava inferiore suprahepatica (SHVC). Tagliare il legamento falciforme. Separare la vena diaframmatica sinistra dallo SHVC utilizzando micro-forza. Ligate la vena diaframmatica sinistra con 7-0 di seta, rimanendo vicino allo SHVC.NOTA: Utilizzare la spugna di garza piccola, umida e non tessuta, smorzata con il lattato di Ringer e posta sul fegato, per ritrarre delicatamente il fegato dal processo xifoide ed esporre la vena diaframmatica sinistra. Tagliare il triangolare sinistro e i legamenti gastro-epatico con forbici rotonde. Esporre il lobo caudate tirando con attenzione i lobi sinistro e medio verso il processo xifoide utilizzando una piccola spugna di garza bagnata e non intrecciata. Rilasciare il legamento che separa il lobo caudato dal resto del fegato con una forbice con punta rotonda. Dividere e separare il legamento esofageo utilizzando un’unità elettrochirurgica bipolare vicino all’esofago.NOTA: Spostare delicatamente l’intestino piccolo e grande sul lato sinistro della cavità addominale e coprirli con garza bagnata e non tessuta. Disiezionare il retroperitoneo e il grasso che copre l’IHVC. Esporre e isolare l’IHVC fino alla vena renale sinistra. Spostare leggermente l’IHVC con un tampone di cotone per esporre e poi cauterizzare eventuali piccole vene che si fondono nella parte destra dell’IHVC, utilizzando l’unità elettrochirurgica bipolare. Cauterizzare anche eventuali vene lombari che si fondono nell’IHVC. Dividere la vena suprarenale (surrenale) destra tra due legature di seta 7-0, rimanendo vicino all’IHVC. Liberare il fegato dai legamenti posteri tagliando questi sotto trazione delicata. Isolare la vena renale destra dall’arteria renale destra e dal tessuto vicino utilizzando un cautery a punta fine. Sigillare l’orifizio vena renale destro con un 8-0 legatura sterile non assorbibile. Staccare il grasso che copre il fotovoltaico per individuare la vena pilorica (vena gastrica destra) e la vena splenica nei punti in cui si fondono il fotovoltaico. Ligate queste vene con 7-0 di seta, rafforzando il lato più vicino al PV con un 8-0 punto di sutura sterile non assorbibile. Dividere le vene tra le cravatte.NOTA: Esporre il fotovoltaico utilizzando una piccola garza bagnata per ri-attingere il duodenum. L’inserimento del bracciale è più facile se il grasso viene staccato dal fotovoltaico, che previene anche la stenosi del bracciale fotovoltaico. Iniettare 300 IU di sodio di eparla nell’IHVC, diluito a 1 mL di salina normale, utilizzando una siringa da 1 mL (31 G ago). Fare un’incisione 5 mm sotto la biforcazione BD e inserire lo stent BD nel BD comune. Fissare lo stent con una legatura di seta 7-0 1 mm sopra l’incisione. Una cravatta in più può essere fatta sotto l’incisione, che è 10 mm sotto la biforcazione. Una volta che lo stent è fissato, tagliare il BD tra questi due legami. Non ritagliare mai il BD o l’arteria epatico corretta (HA). Posizionare un punto di sutura di sutura chirurgica sterile non assorbibile 10-0 nella posizione a 3 ore nel BD all’incisione come marcatore per evitare torsioni dopo la riconnessione. Esporre l’HA corretta e dividere l’arteria gastroduodenale (GDA) tra due legature di seta 7-0. Esporre l’arteria gastrica sinistra, l’arteria splenica e il tronco celiaco. Legare le tre arterie sia distally e vicino ai loro decolli. Tagliare l’arteria gastrica sinistra, l’arteria splenica e il tronco celiaco tra le cravatte dell’arteria. Iniettare lentamente 20 mL di soluzione di lattatura di Ringer fredda (4 gradi centigradi) nel fotovoltaico, utilizzando una siringa da 20 mL con un ago da 21,5 G. Tagliare la vena cava sotto il punto in cui la vena renale sinistra si fonde con l’IHVC per consentire il deflusso di lavaggio.NOTA: L’ago deve essere conservato il più lontano possibile dall’hilum. La perfusione fredda del fegato del donatore dovrebbe durare tra 1-2 min. Durante lo lavaggio del fegato, utilizzare l’altra mano per spruzzare lattato di Ringer freddo sulla superficie del fegato. Tagliare il tronco fotovoltaico sotto la vena di milza dopo lo sciacquone. Tagliare l’IHVC appena sopra la vena renale sinistra. Tagliare lo SHVC direttamente adiacente al diaframma. Tagliare i legamenti e il tessuto connettivo tra il fegato e il retroperitoneo.NOTA: Assicurarsi che vi siano lunghezze sufficienti delle pareti SHVC anteriore e posteriore per facilitare l’anastomosi cavale superiore. È fondamentale tagliare immediatamente adiacente al diaframma per mantenere la massima lunghezza possibile. Dopo che il fegato è stato rimosso dall’addome, posizionarlo rapidamente in un piatto riempito con la soluzione di lattato di 4 gradi centigradi. Posizionare il piatto sopra una piattaforma di ghiaccio per mantenere una temperatura fredda. Scartare i resti del ratto donatore, seguendo le linee guida istituzionali. 3. Preparazione del fegato del ratto donatore (“panca posteriore”) Riempire il piatto Petri freddo con un volume sufficiente di soluzione di lattato di 4 gradi centigradi per sommergere il fegato del ratto donatore. Ruotare con attenzione il fegato donatore galleggiante nel piatto con attenzione in modo che la superficie inferiore faccia verso l’alto. Mettere nel piatto i polsini per il fotovoltaico e LHVC (materiale supplementare1 e materiale supplementare 2). Tirare il PV attraverso il bracciale fotovoltaico e piegare l’estremità della vena sopra il bracciale. Legare il fotovoltaico in modo sicuro intorno al bracciale usando la seta 7-0. Sciacquare il fotovoltaico con una soluzione di lattazione da 10 mL di 4 gradi centigradi. Ripetere il passaggio 3.2 con l’IHVC, senza lo sciacquone. Rimuovere il tessuto adiposo intorno al tronco celiaco. Formare un polsino a manicotto arteriosa più grande tagliando aperta la biforcazione del tronco celiaco, dell’arteria splenica e dell’arteria gastrica sinistra (Figura 2A).NOTA: è difficile inserire lo stent arteriosa nell’hate comune. Allungare e raddrizzare l’arteria con le forcette più volte prima di inserire lo stent. Assicurarsi che lo smusso dello stent sia verso l’alto e che l’arteria non sia attorcigliata (Figura 2B). Mettere lo stent arteriosa di 1,5 mm di lunghezza 24 G nell’HA comune del donatore tramite il bracciale arteriosa. Fissare lo stent con un 8-0 legatura in polipropilene (Figura 2C) e lavare lo stent con la soluzione di lattatura di Ringer (Figura 2D). Posizionare un micro-clamp (4-6 mm di lunghezza) sul prossimale IHVC, che ha lo scopo di prevenire la perdita di sangue dopo la ricorsiva del portale ed evitare l’embolia dell’aria. Ruotare il fegato ed esporre il suo lato superiore. Inserire due 8-0 suture a punta di cono in polipropilene sui bordi laterali e mediali dello SHVC. Tenere il fegato a 4 gradi centigradi in modo che sia pronto per il trapianto nel donatore. 4. Operazione del destinatario Fare riferimento alla sezione relativa all’operazione del donatore sopra riportata e ripetere i passaggi 2.1-2.4.NOTA: Qui vengono utilizzati ratti maschi di Lewis di età compresa tra 12 e 14 settimane, con un peso di 5-20 g più pesante dei donatori. Durante l’intervento chirurgico, monitorare la profondità dell’anestesia notando la frequenza respiratoria, la frequenza cardiaca, la colorazione degli organi/mucose e la presenza di eventuali riflessi di ritiro del pedale. Posare il ratto drappeggiato chirurgicamente con il suo lato ventrale rivolto verso l’alto. Posizionare il naso nello spazzino di anestesia per l’inalazione di isoflurane. Inumidire gli occhi con lubrificante optalamico. Preparare la parete addominale con providone-iodio prima, poi con 70% di etanolo. Iniettare 5 mL della soluzione di lattato di Ringer sottocutaneamente su entrambi i lati inferiori della parete addominale ventrale. Utilizzare l’assistente chirurgico per iniettare 0,5 mL di 200 mg/kg piperacillin sodio intramuscolare nella parete addominale sinistra prima della laparotomia. Inoltre, somministrare 0,5 mL di 10 mg/mL bupivacaina sottocutaneamente nella parete addominale destra.NOTA: Somministrare la stessa dose di piperacillin sodio 1x/giorno per 3 giorni post-operatori. Preparare di nuovo la parete addominale con providone-iodio prima e poi con il 70% di etanolo. Fai un’incisione della linea mediana dallo xifoide sternale a 1 cm sopra la si fitite pubica. Diminuire l’isoflurane al 2%, 0,5 L/min flusso d’aria, e FiO2 70% per la manutenzione dell’anestesia dopo aver fatto l’incisione.NOTA: Le punture di zanzara possono essere utilizzate per afferrare il processo xifoide e ritrarre il cefalo. Fissare le force misura della zanzara in posizione utilizzando il nastro adesivo. La cavità del corpo è tenuta aperta da retrattili stampati in 3D (vedi Materiale supplementare 3) su entrambi i lati con elastici tenuti magneticamente alla piattaforma chirurgica. Avvolgere l’intestino piccolo e grande con una spugna di garza bagnata e non intrecciata (4 cm x 4 cm) smorzata con la soluzione di lattato di Ringer. Utilizzare una piccola spugna di garza bagnata e non intrecciata smorzata con la soluzione di lattato di Ringer per coprire delicatamente il fegato. Posizionare un piccolo supporto stampato in 3D (supporto posteriore; vedere Materiale supplementare 4) sotto la sezione centrale del ratto per aumentare l’esposizione dello SHVC flettendo la rotazione. Questo può essere eseguito in modo sicuro nei ratti e viene eseguito da un assistente chirurgo. Tagliare il legamento falciforme e utilizzare la piccola spugna di garza non tessuta bagnata per ritrarre delicatamente il fegato dal processo xifoide ed esporre la vena diaframmatica sinistra. Separare la vena diaframmatica sinistra dallo SHVC utilizzando micro-forza. Ligate la vena diaframmatica sinistra con 7-0 di seta vicino al diaframma. Tagliare il triangolare sinistro e i legamenti gastro-epatico con forbici rotonde. Tirare delicatamente i lobi sinistro e medio verso il processo xifoide con una piccola spugna di garza non intrecciata bagnata per rivelare il lobo caudato. Recidere il legamento che separa il lobo caudato dal resto del fegato. Dividere il legamento epato-esofageo e coagulare eventuali punti di sanguinamento con l’unità elettrochirurgica bipolare, rimanendo vicino al fegato. Tagliare i legamenti all’aspetto posteriore del fegato. Ritrarre con attenzione l’intestino piccolo e grande sul lato sinistro della cavità addominale e coprirli con garza bagnata e non tessuta. Dizionare il retroperitoneo e il grasso sull’IHVC per esporre e isolare l’IHVC fino alla vena renale destra. Spostare leggermente l’IHVC con un tampone di cotone e cauterizzare eventuali piccole vene che si fondono nella parte destra dell’IHVC, utilizzando l’unità elettrochirurgica bipolare. Allo stesso modo, cauterizzare tutte le vene lombari che entrano nel IHVC. Dividere la vena suprarenale (surrenale) destra tra due legature di seta 7-0. Liberare il fegato dai legamenti posteri tagliandoli sotto trazione delicata. Utilizzare una piccola garza bagnata smorzata con la soluzione di lattato di Ringer per ritrarre il duodenum ed esporre il fotovoltaico. Staccare il grasso dalla biforcazione della vena fotovoltanica e pilorica. Dividere il BD 0,5 cm sotto la sua biforcazione ilare e inserire uno stent BD nel BD comune distale. Fissare lo stent in posizione con una legatura 7-0 circa 0,2 mm sotto l’incisione. Una cravatta in più può essere posizionata sopra l’incisione, vicino alla biforcazione. Tagliare il BD vicino al fegato ma distale alla cravatta. Separare il BD con le force e le force e le force e le force e le unità BD o l’HA corretta. Posizionare un punto monofilamento non assorbibile 10-0 (ad esempio, ethilon) nella posizione a 3 ore nel BD come marcatore per evitare torsioni dopo la riconnessione. Esporre l’HA corretta e la biforcazione del comune HA e GDA. Esporre l’HA sinistra, l’HA centrale e l’HA destra. Legare le tre arterie distale alla biforcazione CHA e tagliare le arterie vicino al fegato, sopra le cravatte. Mettere un lungo pezzo sottile di garza dietro lo SHVC. Posizionare un supporto IHVC stampato in 3D o “maniglia” (Cava 150g 2.1; vedere Materiale supplementare 5) dietro l’IHVC e cucire le estremità della “maniglia” stampata in 3D utilizzando la sutura monofilamento 10-0 non assorbibile(Figura 3A). Posizionare un porta fotovoltaico stampato in 3D o “maniglia” (Porta 1.4.1-vedere Materiale supplementare 6) dietro il fotovoltaico, direttamente inferiore al fegato, e cucire le estremità della “maniglia” stampata in 3D insieme utilizzando 10-0 sutura monofilamento non assorbibile. Legare liberamente una legatura di seta 7-0 sotto entrambi i supporti stampati in 3D (IHVC e PV) (Figura 3A). Bloccare l’IHVC appena sopra la vena renale destra, che dovrebbe essere ancora sotto il supporto caval stampato in 3D. Bloccare il fotovoltaico appena sopra la vena pilorica, che dovrebbe essere al di sotto del supporto fotovoltaico stampato in 3D. Registrare l’ora anepatico, che inizia a questo punto. Diminuire a 0,5% isoflurane, 0,5 L/min flusso d’aria, e 70% FiO2 per la manutenzione dell’anestesia. Sciacquare 2 mL della soluzione di lattato di Ringer da 37 gradi centigradi tramite la biforcazione del fotovoltaico utilizzando una siringa da 3 mL con un ago da 27 G attaccato. Bloccare lo SHVC sopra il fegato con un morsetto Kitzmiller. Tagliare sotto lo stesso morsetto, rimanendo il più vicino possibile al fegato. Tagliare sopra i supporti stampati in 3D sia per il fotovoltaico che per IHVC (Figura 3A). Rimuovere il fegato del destinatario. Orientare con attenzione il fegato del donatore e posizionarlo nella cavità corporea del ricevente in modo tale che l’anastomosi cavale superiore possa essere creata. Utilizzare un 8-0 sutura in polipropilene per unire lo SHVC del donatore con lo SHVC del ricevente vicino al diaframma. Primo, posto soggiorno suture di 8-0 polipropilene agli aspetti sinistro e destro del donatore e del ricevente SHVC. Quindi, legarli all’esterno del muro della vena. Utilizzare il sinistro 8-0 polipropilene per cucire la parete posteriore dello SHVC da sinistra a destra e legare a destra 8-0 Polipropilene. Utilizzare il sinistro 8-0 polipropilene per cucire la parete anteriore dell’anastomosi SHVC da sinistra a destra, lasciando gli ultimi due terzi della linea di sutura allentati. Sciacquare utilizzando 20 mL di lattato di Ringer tra i punti sciolti, assicurandosi di estrarre eventuali bolle d’aria. Stringere i punti sciolti e fare una cravatta all’esterno dello SHVC. Tagliare il restante 8-0 sutura in polipropilene.NOTA: la clip tiene in posizione lo SHVC del ricevente, rendendo più facile cucire insieme lo SHVC del donatore e del ricevente. Registrare la durata dell’anastomosi SHVC. A questo punto, le maniglie porta sono attaccate all’apparato del braccio del supporto (braccio di supporto McGil , supporto mini braccio LAB , braccio di supporto parte morbida 1.3; vedere materiale supplementare 7, materiale supplementare 8e materiale supplementare 9, rispettivamente), direttamente inferiore al fegato. Questo apparato è supportato da una base portante stampata in 3D (base 3.1; vedere Materiale supplementare 10). Inserire il bracciale fotovoltaico (Materiale supplementare 1) del donatore nel fotovoltaico del ricevente e stringere la cravatta di seta 7-0. Sciacquare il fotovoltaico del donatore e del ricevente con la soluzione di lattato di Ringer riscaldata a 37 gradi centigradi prima della connessione. Rimuovere il morsetto atraumatico dallo SHVC (in primo luogo), quindi la clip microvascolare per il PV (secondo). Ri-perfuse il fegato con sangue caldo; a questo punto, il tempo di fase anepatico è terminato. Registra questa volta. Versare 10 mL di soluzione di lattato calda ringer sulla parte superiore del fegato per riscaldare. Rimuovere i supporti stampati in 3D con forbici rotonde (tagliare il punto di fissaggio). Inserire il bracciale IHVC del donatore (Materiale supplementare 2) nel ricevente IHVC e fissare con una cravatta di seta 7-0. Rimuovere prima la clip IHVC del donatore, quindi la clip del destinatario (Figura 3B). La cava è attaccata all’apparecchio portante e alla base del supporto come descritto sopra, Rimuovere i supporti della stampante 3D (porta e cava) con forbici rotonde (tagliare il punto di fissaggio; Figura 3C), con conseguente connessione IHVC (Figura 3D). Esaminare attentamente l’area intorno al fegato per eventuali emorragie. Instil 3 mL di 37 c.C.C.S.A. soluzione di lattazione all’interno della cavità del corpo. Anastomosi arteriosa: tagliare la porzione del tronco celiaco dal donatore che si estende oltre lo stent. Bloccare l’HA corretta del destinatario e tagliare la cravatta alla fine. Tagliare qualsiasi tessuto supplementare che circonda il vaso (Figura 4A). Con la soluzione di lattato di Ringer, sciacquare i lumen delle estremità del donatore e del recipiente. Tirare il destinatario ha corretta nella manica dello stent HA donatore per realizzare l’anastomosi HA. Posizionare un ethilon 10-0 attraverso l’aspetto sinistro dell’HA (donatore), 2,5 mm sopra l’orifizio distale dello stent (dall’esterno all’interno), quindi uscire attraverso l’estremità dello stent, con 10-0 ethilon (lunghezza 4 cm) guidato da un ago curvo(Figura 4B). Trasfiggere il destinatario corretta HA 0,5 mm sotto l’orifizio del recipiente, posizionando il punto prima (dall’interno all’esterno) sul lato sinistro del vaso, quindi (dall’esterno all’interno) al lato destro dell’arteria. Posizionare la sutura attraverso la parete destra dell’HA (donatore) dall’interno all’esterno, ad una distanza dall’orifizio stent identico al punto originale. Tirare verso l’alto sulle due estremità del monofilamento non assorbibile 10-0, che infilerà il destinatario corretta HA su e nello stent HA (Figura 4C).NOTA: Osservare per il pompaggio di sangue. Un’opzione è quella di tagliare il donatore GDA per confermare che il sangue sta pompando attraverso l’anastomosi. Assicurarsi di ri-legare l’arteria prima di passare alla fase successiva della procedura se il GDA è reciso. Legare il 10-0 monofilamento non assorbibile con se stesso, sopra il donatore HA (Figura 4D). L’anastomosi arteriosa è ora completa. Anastomosi biliare: posizionare una cravatta liberamente intorno al BD destinatario e stent (Figura 5A), quindi rimuovere lo stent BD. Lavare il BD del ricevente e del donatore prima che la connessione biliaria sia completa. Inserire lo stent BD del donatore nel dotto biliare del ricevente (Figura 5B) e stringere la cravatta precedentemente posizionata intorno al BD del ricevente (Figura 5C). Riportare l’intestino alla cavità del corpo. Instillare 2 mL della soluzione di lattato di Ringer da 37 gradi centigradi nella cavità per lavarla. Immergere parte della soluzione con garza. Assicurarsi che l’intestino sia tornato nella loro posizione originale prima di cucire il peritoneo parietale e la pelle con 5-0 monocrilo. Chiudere l’incisione in due strati con 5-0 monocrilo. Iniettare 0,5 mL di bupivacaina dello 0,5% intorno al peritoneo parietale cucito e ripetere questo una volta che la pelle è cucita insieme. Delicatamente tamponare il ratto destinatario in un tovagliolo di carta durante il trasferimento alla gabbia. Consentire all’animale libero accesso all’acqua e al cibo dal momento del risveglio. Tenere una coperta calda che circola in acqua sotto la metà della gabbia per 24-38 h. Un ratto è designato in una gabbia durante l’immediato periodo post-operatorio. 5. Assistenza post-operatoria Immergere i pellet di cibo in acqua e metterli in un piatto Petri sul pavimento della gabbia. Monitorare la frequenza cardiaca, la frequenza respiratoria e il colore della pelle del ratto. Amministrare la piperacilina nei giorni post-operatori 1, 2 e 3. Somministrare la buprenorfina sottocutaneamente e monitorare eventuali segni di dolore come eventuali cambiamenti comportamentali, letargia, pelliccia non scopata, depressione, mutilazione, o perdita di appetito per i primi 72 h.NOTA: Il dolore viene valutato almeno 2 volte al giorno per 3 giorni dopo il trapianto, quindi almeno 1 volte al giorno in poi.

Representative Results

Mentre istituisce un modello OLT per rattomosi anastomosi non HA utilizzando un protocollo28descritto in precedenza, il nostro team ha osservato rispettivamente il 50% e il 37,5% di tassi di sopravvivenza a 21 giorni e 60 giorni dopo l’operazione. Anche se alti tassi di sopravvivenza a lungo termine senza anastomosi HA sono stati segnalati da alcunigruppi 28, questi primi risultati evidenziano gli inconvenienti di non avere afflusso arteriosa. Al contrario, la procedura ottimizzata di riconnessione HA ha aumentato significativamente la sopravvivenza a lungo termine dal 37,5% all’88,2% (p – 0,015)(Figura 6). L’analisi idrato di un sottoinsieme rappresentativo di animali trapiantati senza riconnessione HA (nei giorni 6 e 13 post-operazione) ha mostrato segni di lesione epatica ipossica con necrosi centrilobulare(Figura 7). La necrosi epatica estesa è stata associata a livelli tremendamente elevati di aminotransferasi alanina (ALT) e aminotransferasi aspartata (AST) in questi animali (Figura 7). Al contrario, i ratti trapiantati con riconnessione HA non hanno mostrato segni di lesioni epatiche e l’analisi sittologica ha rivelato una normale struttura di parenchima epatico con acini, lobuli organizzati (ad esempio, vena centrale e triadi portale con vena epatica), arterie e dotto biliare(Figura 7). Anche se il tempo anepatico medio nel corso di 23 operazioni separate era accettabile (12 min e 14 s [± 78 s]), è ancora possibile che la sopravvivenza nel modello di riconnessione non HA possa alla fine essere migliorata con una maggiore pratica. Tuttavia, vale la pena notare che tre dei quattro animali trapiantati senza riconnessione HA (che sono stati seguiti per la sopravvivenza a lungo termine) sono stati eutanasia a causa di disagio nei giorni 56, 96, e 111 post-operazione. Inoltre, l’analisi irologica dei fegati ha rivelato cambiamenti reattivi dopo lesioni ipossiche al fegato, tra cui marcata proliferazione del dotto biliare, fibrosi periportale e infiammazione, e parenchyma epatico distorto (Figura supplementare 2). La presenza di caratteristiche morfologiche di lesioni epatiche ipossiche confermano i risultati che la riconnessione HA è importante per una perfusione epatica efficiente e una funzione normale. Figura 1: rappresentazione schematica del design del bracciale stampato in 3D per la vena del portale e l’infraepatico inferiore vena cava. La prima cravatta è stretta nella scanalatura (ii) più vicina alla maniglia (iii), mentre la seconda cravatta viene stretta nella scanalatura (i) più lontana dalla maniglia. I diametri esterni sono (iv) 2,38 mm per la vena del portale (PV) e 2,15 mm per la vena cava inferiore (IHVC). I diametri interni sono (v) 1,74 mm per il fotovoltaico e 1,38 mm per l’IHVC. Le lunghezze sono (vi) 2,60 mm per il fotovoltaico e 2,15 mm per l’IHVC (le specifiche esatte per tutti i materiali stampati in 3D sono disponibili in Materiali supplementari). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Inserimento di stent dell’arteria epatico in innesto. (A) L’estremità di apertura del tronco celiaco (i) viene allargata tagliando l’arteria splenica all’arteria gastrica sinistra, che espone la biforcazione dell’HA comune. (ii) Lo stent BD è legato prima dell’estrazione del fegato di ratto donatore. (iii) Il bracciale fotovoltaico e il bracciale (iv) IHVC sono inseriti e legati piegando le estremità dei vasi sopra il bracciale. (B) (i) Per inserire lo stent HA, l’HA comune esposto viene allungato più volte con le forcepi. (C) (i) Lo stent HA è collocato in modo sicuro nella COMUNE HA e legato con 8-0 prolene. (D) (i) Lo stent HA viene lavato con (ii) soluzione di lattato (BD – dotto biliare, IHVC – infraepatico inferiore vena cava, HA – arteria epatico). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Connessione vena inferiore infrahepatica utilizzando il supporto stampato in 3D. (A) Il (i) PV è collegato utilizzando la stessa tecnica della connessione IHVC. L’innesto è (ii) bloccato sopra il bracciale IHVC (iii). L’apertura IHVC del destinatario è (iv) suturata ai lati dell’apertura su un supporto stampato in 3D per mantenerla aperta. Una seta sciolta (v) 7-0 è legata intorno al destinatario IHVC. (B) Il bracciale dell’innesto IHVC è (i) inserito all’interno del destinatario IHVC. La cravatta allentata è ora serrata. (C) Il morsetto viene rimosso e (i) il supporto stampato in 3D viene staccato con le forbici. (D) Un ulteriore (i) 7-0 seta è legato intorno alla connessione se non sicuro, ma in genere una cravatta è sufficiente (PV – vena del portale, IHVC – infrahepatic inferiore vena cava). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Connessione della manica microvascolare dell’arteria eparica. (A) (i) Lo stent BD non è collegato al destinatario. (ii) Lo stent HA è posto nell’innesto, che è collegato alla corretta HA del destinatario (iv). (iii) Il fotovoltaico è collegato. (B) 10-0 ethilon con un ago curvo (i) viene disegnato attraverso lo stent HA ai lati dell’estremità di apertura HA del destinatario. (C) L’ethilon 10-0 viene tirato indietro attraverso lo stent HA; pertanto, l’HA corretta del destinatario viene tirato attraverso lo stent come una manica. (D) (i) Un pareggio con 10-0 ethilon viene effettuato una volta che l’HA corretta del destinatario viene tirato nello stent alla porzione che per prima attraversa lo stent HA. (E) Qui è mostrato uno schema dell’anastomosi HA descritto in (B), (C) e (D) (BD – dotto biliare, HA – arteria epatica, PV – vena del portale). L’estremità di apertura del tronco celiaco viene allargata tagliando l’arteria splenica all’arteria gastrica sinistra. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: connessione dotto bile utilizzando due stent. (A) (i) Lo stent innesto BD viene inserito nel BD ricevente con l’aiuto dello stent (ii) vagamente legato all’apertura del BD del destinatario. (iii) Il PV viene collegato prima della connessione BD, che si trova dietro il BD. (B) Lo stent alla fine del BD del destinatario viene rimosso e utilizzato come apertura allargata a (i) inserire il BD. (C) La cravatta che sta fissando liberamente lo stent del destinatario viene ora utilizzata per legare la connessione, e (i) un altro 7-0 di seta viene utilizzato per mantenere saldamente lo stent in posizione per evitare scivolamenti o torsioni dello stent. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6: Sopravvivenza percentuale trapianto. Trapianto di fegato di ratto ortotopico senza riconnessione HA (n n ) e con riconnessione HA (n – 17). Gli animali sono seguiti da vicino dopo il trapianto per segni di insufficienza epatica e/o infezione per almeno 60 giorni. I ratti che non mostravano complicazioni dopo l’intervento chirurgico erano considerati sopravvissuti (0,015 dollari, come calcolato dalla stima di Kaplan-Meier [test di grado lungo]). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 7: Valutazione ipattopatologica del fegato. Sezioni rappresentative di ematossilina ed eosin-macchiate in animali (A) senza e (B) con riconnessione dell’arteria epatica (HA) nei giorni 6 e 13 dopo il trapianto di fegato (LTx). (C) Parenchyma epatico normale che mostra triade portale (vena portale, arteria, e dotto biliare), lobuli tra cui vena centrale, e acini. Gli eparociti accanto alla triade del portale sono gli eparitociti della zona 1; gli eparociti accanto alla vena centrale all’interno dei lobuli sono epariti della zona 3; e gli eparociti tra le zone 1 e 3 sono eparatociti della zona 2 (ALT – alanina aminotransferasi, AST – aminotransferasi aspartate, CV – vena centrale). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura supplementare 1: dimensioni di stent e bracciale. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura supplementare 2: Valutazione ipattopatologica del fegato che mostra l’interruzione del parenchyma del fegato. Sezioni rappresentative di ematossilina ed eosin-macchiate in animali senza riconnessione HA nei giorni 54, 96 e 111 dopo LTx. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Materiale supplementare 1: Bracciale Porta 200g – supporto 2.0. Si prega di fare clic qui per visualizzare questo file (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare). Materiale supplementare 2: Cuff Cava 200g – supporto 2.0. Si prega di fare clic qui per visualizzare questo file (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare). Materiale supplementare 3: Retrattore del fegato 200g. Si prega di fare clic qui per visualizzare questo file (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare). Materiale supplementare 4: Supporto posteriore – 1.2. Si prega di fare clic qui per visualizzare questo file (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare). Materiale supplementare 5: Cava 150g – 2.1. Si prega di fare clic qui per visualizzare questo file (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare). Materiale supplementare 6: Porta 1.4.1. Si prega di fare clic qui per visualizzare questo file (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare). Materiale supplementare 7: braccio di supporto McGil. Si prega di fare clic qui per visualizzare questo file (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare). Materiale supplementare 8: Titolare mini braccio LAB. Si prega di fare clic qui per visualizzare questo file (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare). Materiale supplementare 9: Supporto e braccio morbido parte 1.3. Si prega di fare clic qui per visualizzare questo file (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare). Materiale supplementare 10: base del supporto – 3.1. Si prega di fare clic qui per visualizzare questo file (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).

Discussion

I modelli di trapianto di fegato di piccolo animale sono importanti per comprendere l’immunità dei trapianti e identificare nuove strategieterapeutiche 32. Il modello ideale di trapianto di fegato animale piccolo replica tutti i passaggi della procedura umana, compresa l’astatomosi arteriosa. Può essere difficile interpretare i risultati del modello OLT ratto, come la maggior parte delle versioni non incorporano un passo ANastomosi HA, che porta a tassi più elevati di complicazioni e morbilità42. Alcune procedure di ricostruzione hanno utilizzato l’arteria renale, che richiede la rimozione del rene27. Questo protocollo evita la rimozione degli organi, in quanto è al di là di ciò che accade nella procedura umana.

Le ricostruzioni arteriose possono essere eseguite anche manipolando il ratto aorta31. Tuttavia, questi metodi richiedono un’ampia dissezione e il bloccaggio dell’aorta. Se il tempo di morsetto è prolungato, il ratto ricevente avrà scarsi risultati legati all’ischemia distale43. Nell’uomo, una tecnica chirurgica LT coinvolge la legatura e la divisione dell’arteria gastroduodenale ricevente (GDA). Tuttavia, le caratteristiche fisiologiche e anatomiche dei roditori rendono il trapianto con questa tecnica più fisiologicamente impegnativo e può portare a complicazioni (cioè necrosi del pancreas e dotto biliare35 e perdita di bile44). La riconnessione arteriosa in questo protocollo ha lo scopo di aggirare questa sfida, mantenere il flusso sanguigno del condotto e migliorare l’esito del destinatario.

L’uso di una manica e di una tecnica di stenting per la ricostruzione del ratto HA è stato descritto in precedenza27. In questa tecnica, uno stent viene utilizzato come guida, e l’arteria viene ricostruita dal tronco celiaco donatore all’HA comune ricevente. Il destinatario ha detto comune viene quindi sezionato e il GDA destinatario è legato27. Di conseguenza, l’afflusso di sangue alla parte inferiore del BD ricevente e alla testa del pancreas può diventare compromessa. Si ritiene che la circolazione collaterale in questa zona spesso fornisce un flusso sanguigno inadeguato al dotto biliare. Ad esempio, questo protocollo blocca il GDA destinatario prima con una clip microvascolare, quindi divide il BD del destinatario. Con il GDA bloccato, il BD diviso non sanguina. Dopo aver rimosso il morsetto GDA, si osserva un sanguinamento rapido dal BD. Questo protocollo, che mantiene un buon flusso al dotto biliare destinatario diviso, protegge la fisiologia del tessuto epatico ricevente fornendo un’adeguata perfusione di sangue epatico e prevenendo lesioni epatiche ipossiche post-OLT.

Sul lato donatore, lo stent HA viene inserito nel tronco celiaco durante la preparazione dell’innesto con facilità creando un cerotto dal tronco celiaco, dall’arteria gastrica sinistra e dall’arteria splenica. Lo stent può essere inserito attraverso l’ampia apertura, che è meno difficile che cercare di inserire lo stent nel solo tronco celiaco. Si è scoperto che 24 G è una dimensione ideale da utilizzare per lo stent HA. La lunghezza dello stent deve essere lunga 1,0-1,5 mm, perché funge da cancello aperto per consentire all’HA corretta del ricevente di essere prontamente tirato nell’HA comune del donatore. Con un’attenta attenzione a dove è collocata la sutura di ethilon 10-0, il sangue che scorre attraverso questa connessione non toccherà mai direttamente lo stent e l’HA corretta del destinatario lo proteggerà dall’interno, riducendo il rischio di complicazioni. È importante sottolineare che l’HA del donatore non viene mai bloccato per evitare il vasospasmo. Il successo della ricostruzione arteriosa viene valutato lasciando aperto il GDA donatore. Una volta completata la ricostruzione, l’anastomosi di successo si traduce in un buon flusso sanguigno dal donatore GDA.

In questo protocollo, simile ad altri, la riconnessione SHVC è il passo più lento e, in ultima analisi, determina la durata della fase anepaziale. Con l’aumentare della durata del tempo anepatico, il rischio di lesioni ischemiche e disfunzione epatica aumenta45. Un altro componente critico dei modelli di ratto OLT sono le dimensioni dell’innesto, degli stent e dei polsini. Se l’innesto è troppo piccolo, l’innesto può ruotare o capovolgere, ostacolando le connessioni vascolari. La dimensione degli stent e polsini può richiedere regolazioni in base all’età, sesso, peso, e ceppo del ratto. La dimensione dei polsini utilizzati qui è stata scelta come descritto inprecedenza 28, ed è stata utilizzata una dimensione del polsino che controllava per le dimensioni del ratto. Non c’erano segni di angoscia o complicazioni (ad esempio, congestione epatica, edema, asciti o splenomegaly) durante il periodo di follow-up (ad oggi: mediana – 133 giorni dopo l’operazione, minimo 115 giorni dopo l’operazione, massimo 161 giorni dopo l’operazione). Ulteriori studi per determinare le dimensioni adatte di fotovoltaico e IHVC per vari ceppi di ratto che rappresentano sia l’età che il sesso sono giustificati.

Questo protocollo OLT ratto modificato utilizza polsini stampati in 3D per il PV e IHVC, come descritto inprecedenza 39,40. I metodi esistenti per collegare il fotovoltaico e l’IHVC includono una tecnica di microsezione32, la tecnicadel bracciale 46e la tecnica della stecca temporanea di microsutura47. È stata scelta la tecnica del bracciale stampato in 3D, in quanto consente di standardizzare le dimensioni del bracciale in base al ceppo del ratto ed è facile da preparare e utilizzare. Grandi quantità di polsini con le stesse dimensioni possono essere stampati contemporaneamente. La superficie esterna del bracciale ha due scanalature per aiutare con fissaggio cravatte e prevenire lo scivolamento. Una coda è anche incorporata nel design del bracciale per consentire una più facile manipolazione del bracciale. Nel complesso, si ritiene che l’incorporazione di polsini stampati in 3D porti ad alti tassi di successo e riproducibilità della procedura OLT riducendo il tempo anepatico. È determinato che questa tecnica accorcia anche la curva di apprendimento chirurgico.

In conclusione, il protocollo descritto ha stabilito un modello che è più simile al trapianto di fegato umano incorporando una fase di riconnessione arteriosa. Questo protocollo può essere adattato per studiare molti aspetti immunologici e chirurgici del trapianto di fegato e può servire da modello per testare nuovi interventi terapeutici rilevanti per il trapianto.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questa ricerca è stata finanziata attraverso fondi del programma di trapianto Multi-Organ presso l’UHN e il sostegno della Toronto General e della Toronto Western Foundation.

Materials

10-0 Ethilon Ethicon 2830G 10-0 Ethilon Black 1X5" BV100-4 Taper
10mL Syringe BD B302995 Luer-Lok Tip, Sterile, Disposable
1mL Syringe BD B309628 Luer-Lok Tip, Sterile, Disposable
20mL Syringe BD B301031 Luer-Lok Tip, Sterile, Disposable
3D Printed Cuff for IHVC Custom
3D Printed Cuff for PV Custom
3D Printed Holder for IHVC Custom
3D Printed Holder for PV Custom
3mL Syringe BD B309657 Luer-Lok Tip, Sterile, Disposable
4-0 Sofsilk Coviden GS-835 Wx coded braided silk, 30", Suture 1-Needle 26 mm Length 1/2 Circle Taper Point Needle
5-0 Monocryl Ethicon Y433H Undyed Monofilament 1X27" TF
5mL Syringe BD B309646 Luer-Lok Tip, Sterile, Disposable
7-0 Silk Teleflex Medical 103-S Black
8-0 Prolene Ethicon 2775G 8-0 Prolene Blue 1X24" BV130-5 EVP Double Armed
Barraquer Micro Needle Holder Without Catch Aesculap Surgical Instruments FD231R Curved 120 mm, 4 3/4″
Barraquer Needle Holder, Extra Fine Jaws 8.0mm, Curved With Out Lock Rumex International Co. 8-025T Small Size, Titanium
Barraquer Needle Holder, Fine Jaws 12.0mm, Curved With Out Lock Rumex International Co. 8-021T Small Size, Titanium
BD Insyte Autoguard BC 22 GA x 1.00 IN BD Angiocath / Autoguard 382523 22 G x 1.00" (0.9 mm x 25 mm) Wingless catheter, 37 mL/min
BDPrecisionGlide Single-use Needles: Regular Bevel – Regular Wall. BD B305106 PrecisionGlide stainless-steel needles with translucent, color-coded, polypropylene hubs. 22 G
BD Precisionglide Syringe Needle 21G BD 305167 Gauge 21, length 1.5 inch, hypodermic needle
BD Precisionglide Syringe Needle 30G BD 305128 Gauge 30, length 1 inch, hypodermic needle
Betadine Solution by Purdue Products LP Purdue Products Lp 67618-150-17 10% povidone–iodine topical solution USP
Bupivacaine Injection BP 0.5% SteriMax Inc. DIN:02443694 0.5% (100mg/20mL)
Curved Tying Forceps Duckworth & Kent 2-501E 6mm tying platforms, straight shafts, flat handle, length 88mm
DC Temperature Controller FHC Inc. 40-90-8D
DK Iris Scissors (Curved) Duckworth & Kent 1-211B Blunt tips, cut length 4mm, tip to pivot length 11mm, round handle, length 107mm
Ethanol, 200 proof (100%), USP, Decon Labs Decon Labs, Inc. 2716 Dilute to 70% with d2H2O
Fine Adjustable Wire Retractor Fine Science Tools 17004-05 Maximum spread: 3.5cm, Depth 5cm
Harvard Apparatus Isoflurane Funnel-Fill Vaporizer Harvard Appartus Limited 34-1040SV
Heparin LEO(heparin sodium) LEO Pharma Inc. DIN:00453811 10,000 i.u./10 mL
Ice-Pak Cryopak FIP88016 4.00 in. x 7.00 in., thickness 1.50 inch
Isoflurane United States Pharmacopeia (USP) 99.9% Piramal Healthcare Limited DIN: 02231929 250 mL, Inhalation Anesthetic, NDC 66794-017-25
Khaw Transconjunctival Adjustable Suture Control Forceps Duckworth & Kent 2-502N 5mm highly polished tying platforms, straight shafts, flat handle, length 84mm
Lactate Ringer's Injected USP, 1000mL Baxter Co. DIN: 00061085 JB2324
McPherson Tying Forceps Duckworth & Kent 2-500E 6mm tying platforms, straight shafts, flat handle, length 90mm
Metzenbaum Scissors – 14.5 cm Fine Science Tools 14024-14 Straight Sharp/Blunt
Micro Kitzmiller Clamp Scanlan 3003-630 Jaw length 23mm, Length 11cm
Microscope-Leica M525 F20 Leica Microsystems No catalog number
Non-woven Gauze Sponges Fisherbrand 22-028-556
Olsen-Hegar with Suture Cutter Fine Science Tools 12002-14 15 mm cutting edge, 2mm jaw surface – 14cm
OptixCare Eye Lube, 25gm OptixCare ES-KE8O-69U1 Formerly Optixcare Surgical Eye Lubricant
Piperacillin sodium salt Sigma-Aldrich P8396 Penicillin analog
Puritan 3" Standard Cotton Swab w/Wooden Handle Puritan Medical Products Company LLC 803-WC Regular Cotton Tipped Applicator with Wooden Handle
Round Handled Needle Holder Straight w/ Lock Fine Science Tools 12075-12 Round handles allow easy fingertip adjustments – 12.5cm
Shea Scissors Curved Blunt Fine Science Tools 14105-12 Transplant scissors with light and delicate pattern – 12cm
Stainless Steel Micro Serrefines Curved – 4mm Fine Science Tools 18055-06 Jaw length 4mm, Jaw width 0.75mm, Total length 16mm, Jaw pressure 125g
Stainless Steel Micro Serrefines Curved – 6mm Fine Science Tools 18055-05 Jaw length 6mm, Jaw width 1mm, Total length 17mm, Jaw pressure 100g
Stainless Steel Micro Serrefines Straight – 6mm Fine Science Tools 18055-03 Jaw length 6mm, Jaw width 1mm, Total length 15mm, Jaw pressure 100g
Surgical Platform Custom, magnetic
SurgiVet Vaporstick Anesthesia Machine General Anesthetic Services, Inc V7015
T/Pump Localized Therapy Stryker TP700 Series
Vacuum-Pressure Pump Barnant Co. 400-1901
Vannas Scissors with Microserrations Straight Fine Science Tools 15070-08 Cutting edge: 5mm, Tip diameter: 0.1mm – 8.5cm
Vetergesic Buprenorphine Ceva Animal Health Ltd NAC No.:12380352 0.324 mg/ml buprenorphine hydochloride Solution for Injection for Dogs and Cats
Vetroson V-10 Bipolar Electrosurgical Unit Summit Hill Laboratories No catalog number
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S. Burden of liver diseases in the world. Journal of Hepatology. 70 (1), 151-171 (2019).
  2. Dopazo, C., et al. Analysis of adult 20-year survivors after liver transplantation. Hepatology International. 9 (3), 461-470 (2015).
  3. Schoening, W. N., et al. Twenty-year longitudinal follow-up after orthotopic liver transplantation: a single-center experience of 313 consecutive cases. American Journal of Transplantation. 13 (9), 2384-2394 (2013).
  4. Pischke, S., et al. Factors associated with long-term survival after liver transplantation: A retrospective cohort study. World Journal of Hepatology. 9 (8), 427-435 (2017).
  5. Hamdani, S., et al. Delayed and short course of rapamycin prevents organ rejection after allogeneic liver transplantation in rats. World Journal of Gastroenterology. 23 (38), 6962-6972 (2017).
  6. Endo, K., et al. Pretransplant replacement of donor liver grafts with recipient Kupffer cells attenuates liver graft rejection in rats. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 30 (5), 944-951 (2015).
  7. Zhao, Z., et al. IL-34 Inhibits Acute Rejection of Rat Liver Transplantation by Inducing Kupffer Cell M2 Polarization. Transplantation. 102 (6), e265-e274 (2018).
  8. Nagakawa, Y., et al. Over-expression of AIF-1 in liver allografts and peripheral blood correlates with acute rejection after transplantation in rats. American Journal of Transplantation. 4 (12), 1949-1957 (2004).
  9. Gao, L. H., Zeng, L. X., Chen, H. M., Wan, R. H. Cytomegalovirus infection accelerates the process of chronic rejection in rat liver transplantation. Transplantation Proceedings. 45 (6), 2536-2538 (2013).
  10. Wu, Y., et al. Effects of combined genes of CTLA4Ig and IDO in post-liver transplantation immune tolerance of rats. Annals of Hepatology. 15 (5), 729-737 (2016).
  11. He, X. S., et al. Influence of warm ischemia injury on hepatic functional status and survival of liver graft in rats. Hepatobiliary and Pancreatic Diseases International. 2 (4), 504-508 (2003).
  12. Tamura, A., et al. Combination effect of tacrolimus and FTY720 in liver transplantation in rats. Transplantation Proceedings. 31 (7), 2785-2786 (1999).
  13. Wang, Z., et al. RhGH attenuates ischemia injury of intrahepatic bile ducts relating to liver transplantation. Journal of Surgical Research. 171 (1), 300-310 (2011).
  14. Jiang, J. W., et al. Chronic bile duct hyperplasia is a chronic graft dysfunction following liver transplantation. World Journal of Gastroenterology. 18 (10), 1038-1047 (2012).
  15. Tang, Y., et al. S-Adenosylmethionine attenuates bile duct early warm ischemia reperfusion injury after rat liver transplantation. Molecular Immunology. 95, 83-90 (2018).
  16. Nosaka, T., Bowers, J. L., Cay, O., Clouse, M. E. Biliary complications after orthotopic liver transplantation in rats. Surgery Today. 29 (9), 963-965 (1999).
  17. Howden, B., Jablonski, P., Grossman, H., Marshall, V. C. The importance of the hepatic artery in rat liver transplantation. Transplantation. 47 (3), 428-431 (1989).
  18. Post, S., et al. The impact of arterialization on hepatic microcirculation and leukocyte accumulation after liver transplantation in the rat. Transplantation. 54 (5), 789-794 (1992).
  19. Hori, T., et al. Impact of hepatic arterial reconstruction on orthotopic liver transplantation in the rat. Journal of Investigative Surgery. 25 (4), 242-252 (2012).
  20. Zhou, S., et al. New method of stent-facilitated arterial reconstruction for orthotopic mouse liver transplantation. Journal of Surgical Research. 187 (1), 297-301 (2014).
  21. Noack, K., Bronk, S. F., Kato, A., Gores, G. J. The greater vulnerability of bile duct cells to reoxygenation injury than to anoxia. Implications for the pathogenesis of biliary strictures after liver transplantation. Transplantation. 56 (3), 495-500 (1993).
  22. Imamura, H., Rocheleau, B., Cote, J., Huet, P. M. Long-term consequence of rat orthotopic liver transplantation with and without hepatic arterial reconstruction: a clinical, pathological, and hemodynamic study. Hepatology. 26 (1), 198-205 (1997).
  23. Reck, T., et al. Impact of arterialization on hepatic oxygen supply, tissue energy phosphates, and outcome after liver transplantation in the rat. Transplantation. 62 (5), 582-587 (1996).
  24. Zhao, D., Wheatley, A. M. Orthotopic liver transplantation in the rat: comparison of models with and without rearterialization of the graft. European Surgical Research. 25 (5), 294-302 (1993).
  25. Chaland, P., et al. Orthotopic liver transplantation with hepatic artery anastomoses. Hemodynamics and response to hemorrhage in conscious rats. Transplantation. 49 (4), 675-678 (1990).
  26. Liu, X., He, C., Huang, T., Gu, J. Development of a New Technique for Reconstruction of Hepatic Artery during Liver Transplantation in Sprague-Dawley Rat. PLoS One. 10 (12), e0145662 (2015).
  27. Oldani, G., Lacotte, S., Morel, P., Mentha, G., Toso, C. Orthotopic liver transplantation in rats. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  28. Lee, S., Charters, A. C., Chandler, J. G., Orloff, M. J. A technique for orthotopic liver transplantation in the rat. Transplantation. 16 (6), 664-669 (1973).
  29. Kamada, N., Calne, R. Y. Orthotopic liver transplantation in the rat. Technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage. Transplantation. 28 (1), 47-50 (1979).
  30. Kashfi, A., et al. A review of various techniques of orthotopic liver transplantation in the rat. Transplantation Proceedings. 37 (1), 185-188 (2005).
  31. Chong, A. S., Alegre, M. L., Miller, M. L., Fairchild, R. L. Lessons and limits of mouse models. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 3 (12), a015495 (2013).
  32. Hasuike, Y., et al. A simple method for orthotopic liver transplantation with arterial reconstruction in rats. Transplantation. 45 (4), 830-832 (1988).
  33. Hickman, R., Engelbrecht, G. H., Duminy, F. J. A technique for liver transplantation in the rat. Transplantation. 48 (6), 1080 (1989).
  34. Steffen, R., Ferguson, D. M., Krom, R. A. A new method for orthotopic rat liver transplantation with arterial cuff anastomosis to the recipient common hepatic artery. Transplantation. 48 (1), 166-168 (1989).
  35. Shi, Y., et al. Magnetic ring anastomosis of suprahepatic vena cava: novel technique for liver transplantation in rat. Transplant International. 28 (1), 89-94 (2015).
  36. Dippe, B. E., et al. An improved model for rat liver transplantation including arterial reconstruction and simplified microvascular suture techniques. Journal of Investigative Surgery. 5 (4), 361-373 (1992).
  37. Kobayashi, E., Kamada, N., Goto, S., Miyata, M. Protocol for the technique of orthotopic liver transplantation in the rat. Microsurgery. 14 (8), 541-546 (1993).
  38. Oldani, G., et al. Efficient nonarterialized mouse liver transplantation using 3-dimensional-printed instruments. Liver Transplation. 22 (12), 1688-1696 (2016).
  39. Oldani, G., et al. Manufacturing devices and instruments for easier rat liver transplantation. Journal of Visualized Experiments. (75), e50380 (2013).
  40. Li, J., et al. Modified sleeve anastomosis for reconstruction of the hepatic artery in rat liver transplantation. Microsurgery. 22 (2), 62-68 (2002).
  41. Li, G. L., et al. High incidence of biliary complications in rat liver transplantation: can we avoid it?. World Journal of Gastroenterology. 17 (26), 3140-3144 (2011).
  42. Zammert, M., Gelman, S. The pathophysiology of aortic cross-clamping. Best Practice and Research: Clinical Anaesthesiology. 30 (3), 257-269 (2016).
  43. Gao, W., Lemasters, J. J., Thurman, R. G. Development of a new method for hepatic rearterialization in rat orthotopic liver transplantation. Reduction of liver injury and improvement of surgical outcome by arterialization. Transplantation. 56 (1), 19-24 (1993).
  44. Ijtsma, A. J., et al. The clinical relevance of the anhepatic phase during liver transplantation. Liver Transplation. 15 (9), 1050-1055 (2009).
  45. Miyata, M., Fischer, J. H., Fuhs, M., Isselhard, W., Kasai, Y. A simple method for orthotopic liver transplantation in the rat. Cuff technique for three vascular anastomoses. Transplantation. 30 (5), 335-338 (1980).
  46. Marni, A., Ferrero, M. E. A four-technique comparative study of orthotopic liver transplantation in the rat. American Journal of Surgery. 156 (3 Pt 1), 209-213 (1988).

Tags

Rat Orthotopic Liver TransplantationLiver Transplantation ModelArterial ReconnectionReduced ComplicationsMicrosurgeryBile Duct StentHepatic ArteryPortal VeinDonor LiverRecipient Survival

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Chen, X., Sekhon, M., Ma, X., Manuel, J., Chung, S., He, E., Bartczak, A., Fischer, S., Thoeni, C., Oldani, G., Perciani, C. T., MacParland, S., McGilvray, I. Reduced Complications after Arterial Reconnection in a Rat Model of Orthotopic Liver Transplantation. J. Vis. Exp. (165), e60628, doi:10.3791/60628 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image