Differenziazione neurale efficiente utilizzando la coltura a cella singola di cellule staminali embrionali umane
Summary
Presentato qui è un protocollo per la generazione di una coltura unicellulare di cellule staminali embrionali umane e la loro successiva differenziazione in cellule progenitrici neurali. Il protocollo è semplice, robusto, scalabile e adatto per lo screening farmacologico e le applicazioni di medicina rigenerativa.
Abstract
La differenziazione in vitro delle cellule staminali embrionali umane (HESC) ha trasformato la capacità di studiare lo sviluppo umano su livelli biologici e molecolari e ha fornito cellule da utilizzare in applicazioni rigenerative. Gli approcci standard per la coltura hESC che utilizzano la coltura del tipo di colonia per mantenere hESC indifferenziati e corpo embrionale (EB) e formazione di rosetta per la differenziazione in diversi strati germinali sono inefficienti e dispendiosi in termini di tempo. Di seguito è presentato un metodo di coltura a cella singola che utilizza hESC anziché una cultura di tipo colonia. Questo metodo consente il mantenimento delle caratteristiche degli HESC indifferenziati, inclusa l’espressione di marcatori hESC a livelli paragonabili a quelli del tipo di colonia hESC. Inoltre, il protocollo presenta un metodo efficiente per la generazione di cellule progenitrici neurali (NPC) da hESC di tipo una singola cellula che produce NPC entro 1 settimana. Queste cellule esprimono altamente diversi geni marcatori NPC e possono differenziarsi in vari tipi di cellule neurali, tra cui neuroni dopaminergici e astrociti. Questo sistema di coltura a cella singola per gli HESC sarà utile per studiare i meccanismi molecolari di questi processi, gli studi di alcune malattie e gli schermi di scoperta di farmaci.
Introduction
Le cellule staminali embrionali umane (HESC) hanno il potenziale per differenziarsi nei tre strati germinali primari, che poi si differenziano in vari linee di cellule progenitrici multipotenti. Questi lignaggi successivamente danno origine a tutti i tipi di cellule nel corpo umano. I sistemi di coltura in vitro hESC hanno trasformato la capacità di studiare lo sviluppo embrionale umano e sono serviti come un valido strumento per ottenere nuove conoscenze su come questi processi sono regolati a livello biologico e molecolare. Allo stesso modo, gli studi sulle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) generate dalla riprogrammazione di cellule somatiche isolate da pazienti umani forniscono nuove informazioni su varie malattie. Inoltre, le cellule progenitrici e differenziate derivate dagli HESC possono essere utili per la ricerca che coinvolge la terapia con cellule staminali e lo screening farmacologico1,2,3,4.
Gli hESC possono essere indotti a differenziarsi in cellule progenitrici neurali (NPC), che sono cellule multipotenziale con un’ampia capacità di auto-rinnovamento. Successivamente, queste cellule possono essere differenziate in neuroni, astrociti e oligodendrociti5,6. I PNG offrono anche un sistema cellulare per studi in vitro sulla biologia del neurosviluppo e varie malattie neurologiche. Tuttavia, gli attuali metodi di coltura del tipo di colonia che coinvolgono gli HESC e la loro differenziazione nei PNG sono inefficienti e spesso coinvolgono la cocultura così come il corpo embrionale (EB) e la formazione di rosetta5,7,8,9. Questi protocolli presentano tassi di sopravvivenza più bassi e differenziazione spontanea e richiedono più tempo.
Presentato qui è un sistema di coltura migliorato e robusto che è facilmente scalabile e utilizza la coltura di tipo a cella singola ad alta densità di hESCs10. L’inclusione dell’inibitore della chinasi Roh (ROCK) ha contribuito a migliorare significativamente l’efficienza di sopravvivenza durante la coltura a tipo di singola cellula di hESC10,11,12,13,14. In questo sistema di coltura, gli hESC possono essere facilmente mantenuti ed espansi. Inoltre, il protocollo presenta un metodo efficiente per generare NPC dalla coltura di tipo a cella singola degli hESC, che permette la produzione di percorsi di segnalazione altamente puri di NPC. Inibizione di BMP/TGF/activin con inibitori ALK inducono in modo efficiente la differenziazione degli hESC di tipo monocellulare in NPC15,16, che possono poi essere indotti a differenziarsi in lignaggi neurali funzionali, come i neuroni dopaminergici e gli astrociti.
In sintesi, il protocollo di coltura di tipo unicellulare che utilizza hESC offre un modello interessante per studiare la differenziazione di queste cellule in varie linee, tra cui i PNG. Questo protocollo è facilmente scalabile e quindi adatto per la generazione di cellule per la ricerca che coinvolge la terapia rigenerativa e lo screening farmacologico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metodi scalabili ed efficienti per la differenziazione degli HESC in vari lignaggi e la generazione di un numero sufficiente di cellule differenziate sono criteri importanti per lo screening farmacologico e la terapia con cellule staminali. Sono stati pubblicati vari metodi di passaggio di una singola cellula, in cui le cellule sono coltivate in presenza di inibitore ROCK o altre piccole molecole per migliorare la sopravvivenza, ma i prodotti finali di questi metodi di coltura sono tipo colonia hESC17</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dr. Carl D. Bortner (NIEHS) per la sua assistenza con l’analisi FACS. Questa ricerca è stata sostenuta dal Programma di Ricerca Intramurale dell’Istituto Nazionale di Scienze della Salute Ambientale, dai National Institutes of Health, da 01-ES-101585 all’AMJ.
Materials
| 35 mm m-dishes | ibidi | 81156 | Cell culture dish |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104-500 | Cell detachment solution |
| Activin A | R&D system | 338-AC-050 | |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher | 17504044 | |
| B27 supplement (-Vit A) | Thermo Fisher | 12587010 | |
| BDNF | Applied Biological Materials | Z100065 | |
| bFGF | Peprotech | 100-18C | |
| Centrifuge | DAMON/ICE | 428-6759 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher | 4110 | |
| Corning hESC-qulified Matrix (Magrigel) | Corning | 354277 | Basement membrane matrix (used for most of the protocol here) |
| Cryostor CS 10 | Stemcell Technologies | 7930 | Cell freezing solution |
| Dispase | Stemcell Technologies | 7923 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 10569-010 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher | 10565-018 | |
| Dorsomorphin | Tocris | 3093 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-16A | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3007003HI | |
| FGF8 | Applied Biological Materials | Z101705 | |
| GDNF | Applied Biological Materials | Z101057 | |
| Geltrex matrix | Thermo Fisher | A1569601 | Basement membrane matrix |
| GlutaMax | Thermo Fisher | 35050061 | Glutamine supplement, 100X |
| H9 (WA09) human embryonic stem cell line | WiCell | WA09 | |
| Heregulin b-1 | Peprotech | 100-3 | |
| IGF | Peprotech | 100-11 | |
| Knockout DMEM | Thermo Fisher | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
| Laminin | Sigma Aldrich | L2020 | |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 85850 | hESC culture medium |
| N2 supplement | Thermo Fisher | 17502001 | |
| NEAA | Thermo Fisher | 11140050 | |
| Neurobasal | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma Aldrich | P3655 | |
| ROCK inhibitor | Tocris | 1254 | |
| SB431542 | Tocris | 1614 | |
| SHH | Applied Biological Materials | Z200617 | |
| Stemdiff Neural Progenitor medium | Stemcell Technologies | 5833 | NPC expansion medium |
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