Efficiënte Neurale differentiatie met behulp van eencellige cultuur van menselijke embryonale stamcellen
Summary
Hier gepresenteerd is een protocol voor het genereren van een eencellige cultuur van menselijke embryonale stamcellen en hun daaropvolgende differentiatie in neurale voorlopercellen. Het protocol is eenvoudig, robuust, schaalbaar en geschikt voor geneesmiddelen screening en toepassingen voor regeneratieve geneeskunde.
Abstract
In vitro differentiatie van menselijke embryonale stamcellen (hESCs) heeft het vermogen om menselijke ontwikkeling te bestuderen op zowel biologische als moleculaire niveaus getransformeerd en cellen verstrekt voor gebruik in regeneratieve toepassingen. Standaard benaderingen voor de hESC cultuur met behulp van kolonie type cultuur te handhaven ongedifferentieerde hESCs en embryo id lichaam (EB) en rozet vorming voor differentiatie in verschillende kiem lagen zijn inefficiënt en tijdrovend. Gepresenteerd hier is een eencellige cultuur methode met behulp van hESCs in plaats van een kolonie-type cultuur. Deze methode maakt het mogelijk om de karakteristieke kenmerken van ongedifferentieerde hESCs te onderhouden, inclusief expressie van hESC-markers op niveaus die vergelijkbaar zijn met hESCs van het kolonie type. Bovendien, het protocol presenteert een efficiënte methode voor neurale voorlopercellen (NPC) generatie van eencellige type hESCs die Npc’s binnen 1 week produceert. Deze cellen uitdrukken sterk verschillende NPC marker genen en kunnen differentiëren in verschillende neurale celtypen, waaronder Dopaminerge neuronen en astrocyten. Dit eencellige cultuur systeem voor hESCs zal nuttig zijn bij het onderzoeken van de moleculaire mechanismen van deze processen, studies van bepaalde ziekten en Drug Discovery-schermen.
Introduction
Menselijke embryonale stamcellen (hESCs) hebben het potentieel om te differentiëren in de drie primaire kiem lagen, die vervolgens differentiëren in verschillende multipotente voorlopercellen. Deze kilometerstanden geven vervolgens aanleiding tot alle celtypen in het menselijk lichaam. In vitro cultuur systemen van hESC hebben het vermogen om menselijke embryonale ontwikkeling te bestuderen getransformeerd en hebben gediend als waardevol hulpmiddel voor het verkrijgen van nieuwe inzichten in hoe deze processen op het biologische en moleculaire niveau worden gereguleerd. Evenzo, studies van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) gegenereerd uit herprogrammering somatische cellen geïsoleerd van menselijke patiënten bieden nieuwe inzichten in verschillende ziekten. Bovendien kunnen voorlopercellen en gedifferentieerde cellen die zijn afgeleid van hescs nuttig zijn voor onderzoek waarbij stamceltherapie en geneesmiddelen screening1,2,3,4worden behandeld.
hESCs kunnen worden geïnduceerd om te differentiëren in neurale voorlopercellen (Npc’s), die multipotential cellen met een uitgebreide zelfvernieuwings capaciteit zijn. Vervolgens kunnen deze cellen worden gedifferentieerd in neuronen, astrocyten, en oligodendrocyten5,6. Npc’s bieden ook een cellulaire systeem voor in vitro studies van neuro ontwikkelingsbiologie en verschillende neurologische aandoeningen. Echter, huidige kolonie type cultuur methoden met hescs en hun differentiatie in npc’s zijn inefficiënt en vaak betrekken cocultuur, alsmede embryoid lichaam (EB) en rozet vorming5,7,8,9. Deze protocollen vertonen lagere overlevingspercentages en spontane differentiatie en zijn meer tijdrovend.
Gepresenteerd hier is een verbeterde en robuuste cultuur systeem dat is gemakkelijk schaalbaar en maakt gebruik van hoge dichtheid eencellige type cultuur van hESCs10. De opname van ROH-kinase (Rock) remmer droeg bij aan een significant verbeterde overlevings efficiëntie tijdens het type eencellige cultuur van hesc10,11,12,13,14. In dit cultuur systeem kunnen hESCs gemakkelijk worden onderhouden en uitgebreid. Daarnaast presenteert het protocol een efficiënte methode om npc’s te genereren van de eencellige type cultuur van hescs, waardoor de productie van zeer zuivere NPCs. remming van BMP/tgfβ/activin signalering trajecten met alk remmers efficiënt induceren differentiatie van eencellige type hescs in npc’s15,16, die vervolgens kan worden geïnduceerd om te differentiëren in functionele neurale lijnen, zoals Dopaminerge neuronen en astrocyten.
Samengevat, het eencellige type cultuur protocol met behulp van hESCs biedt een aantrekkelijk model om de differentiatie van deze cellen te bestuderen in verschillende kilometerstanden, waaronder Npc’s. Dit protocol is gemakkelijk schaalbaar en daarom geschikt voor het genereren van cellen voor onderzoek waarbij regeneratieve therapie en geneesmiddelen screening worden betrokken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Schaalbare en efficiënte methoden voor de differentiatie van hESCs in verschillende kilometerstanden en het genereren van voldoende aantallen gedifferentieerde cellen zijn belangrijke criteria voor geneesmiddelen screening en stamceltherapie. Verschillende methoden voor het passeren van één cel zijn gepubliceerd, waarin cellen worden gekweekt in de aanwezigheid van rotsremmer of andere kleine moleculen om de overleving te verbeteren, maar de eindproducten van deze cultuur methoden zijn kolonie type hescs<sup class="xr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Dr. Carl D. Bortner (NIEHS) voor zijn hulp bij de FACS analyse. Dit onderzoek werd gesteund door het intramurale onderzoeksprogramma van het National Institute of Environmental Health Sciences, de National Institutes of Health, Z01-ES-101585 to AMJ.
Materials
| 35 mm m-dishes | ibidi | 81156 | Cell culture dish |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104-500 | Cell detachment solution |
| Activin A | R&D system | 338-AC-050 | |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher | 17504044 | |
| B27 supplement (-Vit A) | Thermo Fisher | 12587010 | |
| BDNF | Applied Biological Materials | Z100065 | |
| bFGF | Peprotech | 100-18C | |
| Centrifuge | DAMON/ICE | 428-6759 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher | 4110 | |
| Corning hESC-qulified Matrix (Magrigel) | Corning | 354277 | Basement membrane matrix (used for most of the protocol here) |
| Cryostor CS 10 | Stemcell Technologies | 7930 | Cell freezing solution |
| Dispase | Stemcell Technologies | 7923 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 10569-010 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher | 10565-018 | |
| Dorsomorphin | Tocris | 3093 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-16A | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3007003HI | |
| FGF8 | Applied Biological Materials | Z101705 | |
| GDNF | Applied Biological Materials | Z101057 | |
| Geltrex matrix | Thermo Fisher | A1569601 | Basement membrane matrix |
| GlutaMax | Thermo Fisher | 35050061 | Glutamine supplement, 100X |
| H9 (WA09) human embryonic stem cell line | WiCell | WA09 | |
| Heregulin b-1 | Peprotech | 100-3 | |
| IGF | Peprotech | 100-11 | |
| Knockout DMEM | Thermo Fisher | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
| Laminin | Sigma Aldrich | L2020 | |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 85850 | hESC culture medium |
| N2 supplement | Thermo Fisher | 17502001 | |
| NEAA | Thermo Fisher | 11140050 | |
| Neurobasal | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma Aldrich | P3655 | |
| ROCK inhibitor | Tocris | 1254 | |
| SB431542 | Tocris | 1614 | |
| SHH | Applied Biological Materials | Z200617 | |
| Stemdiff Neural Progenitor medium | Stemcell Technologies | 5833 | NPC expansion medium |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Rosler, E. S., et al. Long-term culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions. Developmental Dynamics. 229 (2), 259-274 (2004).
- Mallon, B. S., Park, K. Y., Chen, K. G., Hamilton, R. S., McKay, R. D. Toward xeno-free culture of human embryonic stem cells. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 38 (7), 1063-1075 (2006).
- Hoffman, L. M., Carpenter, M. K. Characterization and culture of human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 23 (6), 699-708 (2005).
- Yan, Y., et al. Efficient and rapid derivation of primitive neural stem cells and generation of brain subtype neurons from human pluripotent stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 2 (11), 862-870 (2013).
- Goncalves, J. T., Schafer, S. T., Gage, F. H. Adult Neurogenesis in the Hippocampus: From Stem Cells to Behavior. Cell. 167 (4), 897-914 (2016).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- International Stem Cell Initiative. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nature Biotechnology. 25 (7), 803-816 (2007).
- Hartung, O., Huo, H., Daley, G. Q., Schlaeger, T. M. Clump passaging and expansion of human embryonic and induced pluripotent stem cells on mouse embryonic fibroblast feeder cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 14 (1), 10 (2010).
- Chen, K. G., et al. Non-colony type monolayer culture of human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 9 (3), 237-248 (2012).
- Chen, G., Hou, Z., Gulbranson, D. R., Thomson, J. A. Actin-myosin contractility is responsible for the reduced viability of dissociated human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 240-248 (2010).
- Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2009).
- Ohgushi, M., et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).
- Pakzad, M., et al. Presence of a ROCK inhibitor in extracellular matrix supports more undifferentiated growth of feeder-free human embryonic and induced pluripotent stem cells upon passaging. Stem Cell Reviews and Reports. 6 (1), 96-107 (2010).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Jeon, K., et al. GLIS3 Transcriptionally Activates WNT Genes to Promote Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into Posterior Neural Progenitors. Stem Cells. 37 (2), 202-215 (2019).
- Emre, N., et al. The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers. PLoS ONE. 5 (8), e12148 (2010).
- Hanna, J., et al. Human embryonic stem cells with biological and epigenetic characteristics similar to those of mouse ESCs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (20), 9222-9227 (2010).
- Saha, K., et al. Surface-engineered substrates for improved human pluripotent stem cell culture under fully defined conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (46), 18714-18719 (2011).
- Tsutsui, H., et al. An optimized small molecule inhibitor cocktail supports long-term maintenance of human embryonic stem cells. Nature Communications. 2, 167 (2011).
- Xu, Y., et al. Revealing a core signaling regulatory mechanism for pluripotent stem cell survival and self-renewal by small molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8129-8134 (2010).
- Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PLoS ONE. 3 (2), e1565 (2008).
- Kim, D. S., et al. Highly pure and expandable PSA-NCAM-positive neural precursors from human ESC and iPSC-derived neural rosettes. PLoS ONE. 7 (7), e39715 (2012).
- Sun, Y., Hu, J., Zhou, L., Pollard, S. M., Smith, A. Interplay between FGF2 and BMP controls the self-renewal, dormancy and differentiation of rat neural stem cells. Journal of Cell Science. 124 (Pt 11), 1867-1877 (2011).
- Zhou, J. M., Chu, J. X., Chen, X. J. An improved protocol that induces human embryonic stem cells to differentiate into neural cells in vitro. Cell Biology International. 32 (1), 80-85 (2008).
- Smith, J. R., et al. Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm. Developmental Biology. 313 (1), 107-117 (2008).
