Diferenciação neural eficiente usando a cultura unicelular de células-tronco embrionárias humanas
Summary
Apresentado aqui é um protocolo para a geração de uma cultura unicelular de células-tronco embrionárias humanas e sua diferenciação subseqüente em células progenitoras neurais. O protocolo é simples, robusto, escalável e adequado para rastreamento de medicamentos e aplicações de medicina regenerativa.
Abstract
A diferenciação in vitro das células-tronco embrionárias humanas (hESCs) transformou a capacidade de estudar o desenvolvimento humano em níveis biológicos e moleculares e forneceu células para uso em aplicações regenerativas. Abordagens padrão para a cultura hESC usando cultura do tipo colônia para manter hESCs indiferenciados e corpo embrionário (EB) e formação de roseta para diferenciação em diferentes camadas germinais são ineficientes e demorados. Apresentado aqui é um método de cultura unicelular usando hESCs em vez de uma cultura do tipo colônia. Este método permite a manutenção das características de hESCs indiferenciados, incluindo a expressão de marcadores hESC em níveis comparáveis aos hESCs tipo colônia. Além disso, o protocolo apresenta um método eficiente para a geração de células progenitoras neurais (NPC) de hESCs do tipo unicelular que produz NPCs dentro de 1 semana. Estas células expressam altamente vários genes marcador NPC e pode se diferenciar em vários tipos de células neurais, incluindo neurônios dopaminérgicos e astrócitos. Este sistema de cultura unicelular para hESCs será útil na investigação dos mecanismos moleculares desses processos, estudos de certas doenças e telas de descoberta de medicamentos.
Introduction
As células-tronco embrionárias humanas (hESCs) têm o potencial de se diferenciar em três camadas germinais primárias, que se diferenciam em várias linhagens celulares progenitoras multipotentes. Estas linhagens posteriormente dão origem a todos os tipos de células do corpo humano. Os sistemas de cultura in vitro hESC transformaram a capacidade de estudar o desenvolvimento embrionário humano e serviram como uma ferramenta valiosa para obter novos insights sobre como esses processos são regulados nos níveis biológico e molecular. Da mesma forma, estudos de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) gerados a partir da reprogramação de células somáticas isoladas de pacientes humanos fornecem novos insights sobre várias doenças. Além disso, progenitor e células diferenciadas derivadas de hESCs podem ser úteis para pesquisas envolvendo terapia com células-tronco e triagem de medicamentos1,2,3,4.
hESCs podem ser induzidos a se diferenciar em células progenitoras neurais (NPCs), que são células multipotenciais com uma extensa capacidade de auto-renovação. Posteriormente, essas células podem ser diferenciadas em neurônios, astrócitos e oligodendrócitos5,6. Npcs também oferecem um sistema celular para estudos in vitro de biologia do neurodesenvolvimento e várias doenças neurológicas. No entanto, os métodos atuais de cultura do tipo colônia envolvendo hESCs e sua diferenciação em NPCs são ineficientes e muitas vezes envolvem cocultura, bem como o corpo embrionário (EB) e formação de rosetas5,7,8,9. Esses protocolos apresentam menores taxas de sobrevida e diferenciação espontânea e são mais demorados.
Apresentado aqui é um sistema de cultura melhorado e robusto que é facilmente escalável e usa cultura de alta densidade tipo unicelular de hESCs10. A inclusão do inibidor roh-kinase (ROCK) contribuiu para aumentar significativamente a eficiência de sobrevivência durante a cultura do tipo unicelular do hESC10,11,12,13,14. Neste sistema de cultura, hESCs podem ser facilmente mantidos e expandidos. Além disso, o protocolo apresenta um método eficiente para gerar NPCs a partir da cultura do tipo unicelular de hESCs, que permite a produção de NPCs altamente puros. Inibição de BMP/TGFβ/activin sinalização vias com inibidores alk eficientemente induzir diferenciação de hESCs tipo unicelular em NPCs15,16, que então pode ser induzido a se diferenciar em linhagens neurais funcionais, tais como neurônios dopaminérgicos e astúcias.
Em resumo, o protocolo de cultura do tipo unicelular usando hESCs oferece um modelo atraente para estudar a diferenciação dessas células em várias linhagens, incluindo NPCs. Este protocolo é facilmente escalável e, portanto, adequado para a geração de células para pesquisas envolvendo terapia regenerativa e triagem de medicamentos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Métodos escaláveis e eficientes para a diferenciação de hESCs em várias linhagens e a geração de número suficiente de células diferenciadas são critérios importantes para o rastreamento de medicamentos e terapia com células-tronco. Vários métodos de passagem de células únicas foram publicados, nos quais as células são cultivadas na presença de inibidor de ROCHA ou outras pequenas moléculas para melhorar a sobrevivência, mas os produtos finais desses métodos de cultura são os hESCs tipo colônia<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Carl D. Bortner (NIEHS) por sua ajuda na análise facs. Esta pesquisa contou com o apoio do Programa de Pesquisa Intramural do Instituto Nacional de Ciências da Saúde Ambiental, dos Institutos Nacionais de Saúde, Z01-ES-101585 à AMJ.
Materials
| 35 mm m-dishes | ibidi | 81156 | Cell culture dish |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104-500 | Cell detachment solution |
| Activin A | R&D system | 338-AC-050 | |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher | 17504044 | |
| B27 supplement (-Vit A) | Thermo Fisher | 12587010 | |
| BDNF | Applied Biological Materials | Z100065 | |
| bFGF | Peprotech | 100-18C | |
| Centrifuge | DAMON/ICE | 428-6759 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher | 4110 | |
| Corning hESC-qulified Matrix (Magrigel) | Corning | 354277 | Basement membrane matrix (used for most of the protocol here) |
| Cryostor CS 10 | Stemcell Technologies | 7930 | Cell freezing solution |
| Dispase | Stemcell Technologies | 7923 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 10569-010 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher | 10565-018 | |
| Dorsomorphin | Tocris | 3093 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-16A | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3007003HI | |
| FGF8 | Applied Biological Materials | Z101705 | |
| GDNF | Applied Biological Materials | Z101057 | |
| Geltrex matrix | Thermo Fisher | A1569601 | Basement membrane matrix |
| GlutaMax | Thermo Fisher | 35050061 | Glutamine supplement, 100X |
| H9 (WA09) human embryonic stem cell line | WiCell | WA09 | |
| Heregulin b-1 | Peprotech | 100-3 | |
| IGF | Peprotech | 100-11 | |
| Knockout DMEM | Thermo Fisher | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
| Laminin | Sigma Aldrich | L2020 | |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 85850 | hESC culture medium |
| N2 supplement | Thermo Fisher | 17502001 | |
| NEAA | Thermo Fisher | 11140050 | |
| Neurobasal | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma Aldrich | P3655 | |
| ROCK inhibitor | Tocris | 1254 | |
| SB431542 | Tocris | 1614 | |
| SHH | Applied Biological Materials | Z200617 | |
| Stemdiff Neural Progenitor medium | Stemcell Technologies | 5833 | NPC expansion medium |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Rosler, E. S., et al. Long-term culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions. Developmental Dynamics. 229 (2), 259-274 (2004).
- Mallon, B. S., Park, K. Y., Chen, K. G., Hamilton, R. S., McKay, R. D. Toward xeno-free culture of human embryonic stem cells. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 38 (7), 1063-1075 (2006).
- Hoffman, L. M., Carpenter, M. K. Characterization and culture of human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 23 (6), 699-708 (2005).
- Yan, Y., et al. Efficient and rapid derivation of primitive neural stem cells and generation of brain subtype neurons from human pluripotent stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 2 (11), 862-870 (2013).
- Goncalves, J. T., Schafer, S. T., Gage, F. H. Adult Neurogenesis in the Hippocampus: From Stem Cells to Behavior. Cell. 167 (4), 897-914 (2016).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- International Stem Cell Initiative. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nature Biotechnology. 25 (7), 803-816 (2007).
- Hartung, O., Huo, H., Daley, G. Q., Schlaeger, T. M. Clump passaging and expansion of human embryonic and induced pluripotent stem cells on mouse embryonic fibroblast feeder cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 14 (1), 10 (2010).
- Chen, K. G., et al. Non-colony type monolayer culture of human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 9 (3), 237-248 (2012).
- Chen, G., Hou, Z., Gulbranson, D. R., Thomson, J. A. Actin-myosin contractility is responsible for the reduced viability of dissociated human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 240-248 (2010).
- Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2009).
- Ohgushi, M., et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).
- Pakzad, M., et al. Presence of a ROCK inhibitor in extracellular matrix supports more undifferentiated growth of feeder-free human embryonic and induced pluripotent stem cells upon passaging. Stem Cell Reviews and Reports. 6 (1), 96-107 (2010).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Jeon, K., et al. GLIS3 Transcriptionally Activates WNT Genes to Promote Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into Posterior Neural Progenitors. Stem Cells. 37 (2), 202-215 (2019).
- Emre, N., et al. The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers. PLoS ONE. 5 (8), e12148 (2010).
- Hanna, J., et al. Human embryonic stem cells with biological and epigenetic characteristics similar to those of mouse ESCs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (20), 9222-9227 (2010).
- Saha, K., et al. Surface-engineered substrates for improved human pluripotent stem cell culture under fully defined conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (46), 18714-18719 (2011).
- Tsutsui, H., et al. An optimized small molecule inhibitor cocktail supports long-term maintenance of human embryonic stem cells. Nature Communications. 2, 167 (2011).
- Xu, Y., et al. Revealing a core signaling regulatory mechanism for pluripotent stem cell survival and self-renewal by small molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8129-8134 (2010).
- Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PLoS ONE. 3 (2), e1565 (2008).
- Kim, D. S., et al. Highly pure and expandable PSA-NCAM-positive neural precursors from human ESC and iPSC-derived neural rosettes. PLoS ONE. 7 (7), e39715 (2012).
- Sun, Y., Hu, J., Zhou, L., Pollard, S. M., Smith, A. Interplay between FGF2 and BMP controls the self-renewal, dormancy and differentiation of rat neural stem cells. Journal of Cell Science. 124 (Pt 11), 1867-1877 (2011).
- Zhou, J. M., Chu, J. X., Chen, X. J. An improved protocol that induces human embryonic stem cells to differentiate into neural cells in vitro. Cell Biology International. 32 (1), 80-85 (2008).
- Smith, J. R., et al. Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm. Developmental Biology. 313 (1), 107-117 (2008).
