Эффективная нейронная дифференциация с использованием одноклеточной культуры эмбриональных стволовых клеток человека
Summary
Здесь представлен протокол для генерации одноклеточной культуры эмбриональных стволовых клеток человека и их последующей дифференциации в нервные клетки-прародители. Протокол прост, надежен, масштабируем и подходит для скрининга лекарственных средств и применения регенеративной медицины.
Abstract
Дифференциация эмбриональных стволовых клеток человека (HESCs) в пробирке изменила способность изучать развитие человека как на биологическом, так и на молекулярном уровнях и предоставила клетки для использования в регенеративных целях. Стандартные подходы к культуре hESC с использованием культуры типа колонии для поддержания недифференцированных HESCs и эмбрионального тела (EB) и образования розетки для дифференциации в различные слои зародыша являются неэффективными и отнимают много времени. Здесь представлен одноклеточный метод культуры с использованием hESCs вместо культуры колонии типа. Этот метод позволяет сохранить характерные особенности недифференцированных HESCs, в том числе выражение маркеров hESC на уровнях, сопоставимых с уровнем of colony type hESC. Кроме того, протокол представляет собой эффективный метод генерации нейронных клеток-прародителей (NPC) из одноклеточного типа hESCs, который производит NPC в течение 1 недели. Эти клетки очень выразить несколько генов NPC маркер и может дифференцировать в различные типы нервных клеток, в том числе дофаминергических нейронов и астроцитов. Эта одноклеточная система культуры для HESCs будет полезна в исследовании молекулярных механизмов этих процессов, исследований некоторых заболеваний и экранов обнаружения лекарств.
Introduction
Человеческие эмбриональные стволовые клетки (HESCs) имеют потенциал, чтобы дифференцироваться в три первичных слоя зародыша, которые затем дифференцироваться в различные многопотентные линии клеток-прародителей. Эти линии впоследствии приводят к появлению всех типов клеток в организме человека. Системы культуры In vitro hESC изменили способность изучать эмбриональное развитие человека и послужили ценным инструментом для получения новых сведений о том, как эти процессы регулируются на биологическом и молекулярном уровнях. Аналогичным образом, исследования индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs), полученных в результате перепрограммирования соматических клеток, изолированных от пациентов с человеком, дают новое представление о различных заболеваниях. Кроме того, прародитель и дифференцированные клетки, полученные из HESCs может быть полезным для исследований, связанных с терапией стволовыми клетками и скринингом лекарственных средств1,2,3,4.
hESCs можно навести для того чтобы продифференцировать в нервные клетки прародителя (NPC), которые multipotential клетки с обширной емкостью самообновления. Впоследствии эти клетки могут быть дифференцированы в нейроны, астроциты и олигодендроциты5,6. NPC также предлагают клеточной системы для in vitro исследований биологии нейроразвития и различных неврологических заболеваний. Тем не менее, современные методы культуры типа колонии, включающие hESCs и их дифференциацию в NPC, неэффективны и часто связаны с кокультурой, а также эмбриональным телом(EB) и образованием розетки5,7,8. Эти протоколы демонстрируют более низкие показатели выживаемости и спонтанную дифференциацию и отнимают больше времени.
Представлено здесь улучшенная и надежная система культуры, которая легко масштабируема и использует высокую плотность одноклеточного типа культуры hESCs10. Включение ингибитора Roh-kinase (ROCK) способствовало значительному повышению эффективности выживания при культуре одноклеточного типа hESC10,11,12,13,14. В этой системе культуры, hESCs можно легко поддерживать и расширить. Кроме того, Протокол представляет собой эффективный метод для генерации NPCs из одноклеточного типа культуры hESCs, который позволяет производство высоко чистых NPCs. Ингибирование BMP / TGF/активирующих сигнальных путей с ингибиторами ALK эффективно индуцировать дифференциацию одноклеточного типа hESCs в NPCs15,16, которые затем могут быть индуцированы в функциональную линию.
Таким образом, протокол культуры одноклеточного типа с использованием hESCs предлагает привлекательную модель для изучения дифференциации этих клеток на различные линии, включая NPC. Этот протокол легко масштабируемый и поэтому подходит для генерации клеток для исследований, связанных с регенеративной терапией и скринингом лекарств.
Protocol
Representative Results
Discussion
Важными критериями скрининга и терапии стволовыми клетками являются масштабируемые и эффективные методы дифференциации ГСС на различные линии и генерации достаточного количества дифференцированных клеток. Различные одноклеточные методы прохождения были опубликованы, в которых кл?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-ра Карла Д. Бортнера (NIEHS) за его помощь в анализе FACS. Это исследование было поддержано Внештремальной исследовательской программой Национального института экологических наук, Национальных институтов здравоохранения, No01-ES-101585 в AMJ.
Materials
| 35 mm m-dishes | ibidi | 81156 | Cell culture dish |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104-500 | Cell detachment solution |
| Activin A | R&D system | 338-AC-050 | |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher | 17504044 | |
| B27 supplement (-Vit A) | Thermo Fisher | 12587010 | |
| BDNF | Applied Biological Materials | Z100065 | |
| bFGF | Peprotech | 100-18C | |
| Centrifuge | DAMON/ICE | 428-6759 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher | 4110 | |
| Corning hESC-qulified Matrix (Magrigel) | Corning | 354277 | Basement membrane matrix (used for most of the protocol here) |
| Cryostor CS 10 | Stemcell Technologies | 7930 | Cell freezing solution |
| Dispase | Stemcell Technologies | 7923 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 10569-010 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher | 10565-018 | |
| Dorsomorphin | Tocris | 3093 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-16A | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3007003HI | |
| FGF8 | Applied Biological Materials | Z101705 | |
| GDNF | Applied Biological Materials | Z101057 | |
| Geltrex matrix | Thermo Fisher | A1569601 | Basement membrane matrix |
| GlutaMax | Thermo Fisher | 35050061 | Glutamine supplement, 100X |
| H9 (WA09) human embryonic stem cell line | WiCell | WA09 | |
| Heregulin b-1 | Peprotech | 100-3 | |
| IGF | Peprotech | 100-11 | |
| Knockout DMEM | Thermo Fisher | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
| Laminin | Sigma Aldrich | L2020 | |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 85850 | hESC culture medium |
| N2 supplement | Thermo Fisher | 17502001 | |
| NEAA | Thermo Fisher | 11140050 | |
| Neurobasal | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma Aldrich | P3655 | |
| ROCK inhibitor | Tocris | 1254 | |
| SB431542 | Tocris | 1614 | |
| SHH | Applied Biological Materials | Z200617 | |
| Stemdiff Neural Progenitor medium | Stemcell Technologies | 5833 | NPC expansion medium |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Rosler, E. S., et al. Long-term culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions. Developmental Dynamics. 229 (2), 259-274 (2004).
- Mallon, B. S., Park, K. Y., Chen, K. G., Hamilton, R. S., McKay, R. D. Toward xeno-free culture of human embryonic stem cells. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 38 (7), 1063-1075 (2006).
- Hoffman, L. M., Carpenter, M. K. Characterization and culture of human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 23 (6), 699-708 (2005).
- Yan, Y., et al. Efficient and rapid derivation of primitive neural stem cells and generation of brain subtype neurons from human pluripotent stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 2 (11), 862-870 (2013).
- Goncalves, J. T., Schafer, S. T., Gage, F. H. Adult Neurogenesis in the Hippocampus: From Stem Cells to Behavior. Cell. 167 (4), 897-914 (2016).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- International Stem Cell Initiative. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nature Biotechnology. 25 (7), 803-816 (2007).
- Hartung, O., Huo, H., Daley, G. Q., Schlaeger, T. M. Clump passaging and expansion of human embryonic and induced pluripotent stem cells on mouse embryonic fibroblast feeder cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 14 (1), 10 (2010).
- Chen, K. G., et al. Non-colony type monolayer culture of human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 9 (3), 237-248 (2012).
- Chen, G., Hou, Z., Gulbranson, D. R., Thomson, J. A. Actin-myosin contractility is responsible for the reduced viability of dissociated human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 240-248 (2010).
- Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2009).
- Ohgushi, M., et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).
- Pakzad, M., et al. Presence of a ROCK inhibitor in extracellular matrix supports more undifferentiated growth of feeder-free human embryonic and induced pluripotent stem cells upon passaging. Stem Cell Reviews and Reports. 6 (1), 96-107 (2010).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Jeon, K., et al. GLIS3 Transcriptionally Activates WNT Genes to Promote Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into Posterior Neural Progenitors. Stem Cells. 37 (2), 202-215 (2019).
- Emre, N., et al. The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers. PLoS ONE. 5 (8), e12148 (2010).
- Hanna, J., et al. Human embryonic stem cells with biological and epigenetic characteristics similar to those of mouse ESCs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (20), 9222-9227 (2010).
- Saha, K., et al. Surface-engineered substrates for improved human pluripotent stem cell culture under fully defined conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (46), 18714-18719 (2011).
- Tsutsui, H., et al. An optimized small molecule inhibitor cocktail supports long-term maintenance of human embryonic stem cells. Nature Communications. 2, 167 (2011).
- Xu, Y., et al. Revealing a core signaling regulatory mechanism for pluripotent stem cell survival and self-renewal by small molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8129-8134 (2010).
- Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PLoS ONE. 3 (2), e1565 (2008).
- Kim, D. S., et al. Highly pure and expandable PSA-NCAM-positive neural precursors from human ESC and iPSC-derived neural rosettes. PLoS ONE. 7 (7), e39715 (2012).
- Sun, Y., Hu, J., Zhou, L., Pollard, S. M., Smith, A. Interplay between FGF2 and BMP controls the self-renewal, dormancy and differentiation of rat neural stem cells. Journal of Cell Science. 124 (Pt 11), 1867-1877 (2011).
- Zhou, J. M., Chu, J. X., Chen, X. J. An improved protocol that induces human embryonic stem cells to differentiate into neural cells in vitro. Cell Biology International. 32 (1), 80-85 (2008).
- Smith, J. R., et al. Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm. Developmental Biology. 313 (1), 107-117 (2008).
