ヒト胚性幹細胞の単細胞培養を用いた効率的な神経分化
Summary
ここで提示するプロトコルは、ヒト胚性幹細胞の単細胞培養の生成とその後の神経前駆細胞への分化のためのプロトコルである。プロトコルは、シンプルで堅牢でスケーラブルで、薬物スクリーニングや再生医療用途に適しています。
Abstract
ヒト胚性幹細胞(hESC)のインビトロ分化は、生物学的および分子レベルの両方で人間の発達を研究する能力を転換し、再生用途に使用する細胞を提供しました。コロニー型培養を用いたhESC培養に対する標準的なアプローチは、未分化のhESCおよび胚体(EB)を維持し、異なる胚層への分化のためのロゼット形成は非効率的で時間がかかる。ここで紹介する単細胞培養法は、コロニー型培養物の代わりにhESCを用いた方法である。この方法により、コロニー型hESCに匹敵するレベルでのhESCマーカーの発現を含む、未分化hESCの特徴を維持することができます。さらに、このプロトコルは、1週間以内にNPCを産生する単一細胞型hESCからの神経前駆細胞(NPC)生成のための効率的な方法を提示する。これらの細胞は、いくつかのNPCマーカー遺伝子を高度に発現し、ドーパミン作動性ニューロンおよびアストロサイトを含む様々な神経細胞型に分化することができる。hESC用のこの単細胞培養システムは、これらのプロセスの分子機構、特定の疾患の研究、および創薬画面の調査に役立ちます。
Introduction
ヒト胚性幹細胞(hESC)は、3つの一次生殖層に分化する可能性を有し、その後、様々な多能性前駆細胞系統に分化する。これらの系統は、その後、人体内のすべての細胞タイプを生じる.in vitro hESC培養システムは、ヒト胚発生を研究する能力を変革し、これらのプロセスが生物学的および分子レベルでどのように調節されるかについての新しい洞察を得るための貴重なツールとして機能してきました。同様に、ヒト患者から単離された体細胞のリプログラミングから生じる人工多能性幹細胞(iPSC)の研究は、様々な疾患に対する新しい洞察を提供する。また、hESC由来の前駆細胞および分化細胞は、幹細胞治療および薬物スクリーニング1、2、3、4を含む研究に有用であり得る。
hESCは、広範な自己再生能力を有する多電位細胞である神経前駆細胞(NPC)に分化するように誘導することができる。続いて、これらの細胞は、ニューロン、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイト5、6に分化することができる。NPCはまた、神経発達生物学と様々な神経疾患のインビトロ研究のための細胞システムを提供しています.しかしながら、hESCとNPCへのその分化を含む現在のコロニー型培養方法は非効率的であり、多くの場合、胚体(EB)およびロゼット形成5、7、8、9と同様に共培養を伴う。これらのプロトコルは、低い生存率と自発的な分化を示し、より時間がかかります。
ここで紹介する、容易にスケーラブルで、hESC10の高密度単一細胞型培養を使用する改良された堅牢な培養システムである。Roh-キナーゼ(ROCK)阻害剤の含有は、hESC10、11、12、13、14の単一細胞型培養中の生存効率を有意に高めることに寄与した。このカルチャシステムでは、hESC を簡単に保守および拡張できます。さらに、このプロトコルは、hESCの単一細胞型培養物からNPCを生成する効率的な方法を提示し、高純度NPCの産生を可能にする。
要約すると、hESCを用いた単一細胞型培養プロトコルは、NPCを含む様々な系統へのこれらの細胞の分化を研究する魅力的なモデルを提供する。このプロトコルは簡単にスケーラブルであり、したがって、再生療法や薬物スクリーニングを含む研究のための細胞を生成するのに適しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
様々な系統へのhESCの分化および十分な数の分化細胞の生成のためのスケーラブルで効率的な方法は、薬物スクリーニングおよび幹細胞治療のための重要な基準である。様々な単細胞通過方法が公表されており、細胞は生存を改善するためにROCK阻害剤または他の小分子の存在下で培養されるが、これらの培養方法の最終産物はコロニー型hESC17、18、19、20、21である。<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
カール・D・ボルトナー博士(NIEHS)のFACS分析への協力に感謝します。この研究は、国立環境衛生科学研究所、国立衛生研究所Z01-ES-101585の村内研究プログラムによってAMJに支援されました。
Materials
| 35 mm m-dishes | ibidi | 81156 | Cell culture dish |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104-500 | Cell detachment solution |
| Activin A | R&D system | 338-AC-050 | |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher | 17504044 | |
| B27 supplement (-Vit A) | Thermo Fisher | 12587010 | |
| BDNF | Applied Biological Materials | Z100065 | |
| bFGF | Peprotech | 100-18C | |
| Centrifuge | DAMON/ICE | 428-6759 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher | 4110 | |
| Corning hESC-qulified Matrix (Magrigel) | Corning | 354277 | Basement membrane matrix (used for most of the protocol here) |
| Cryostor CS 10 | Stemcell Technologies | 7930 | Cell freezing solution |
| Dispase | Stemcell Technologies | 7923 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 10569-010 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher | 10565-018 | |
| Dorsomorphin | Tocris | 3093 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-16A | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3007003HI | |
| FGF8 | Applied Biological Materials | Z101705 | |
| GDNF | Applied Biological Materials | Z101057 | |
| Geltrex matrix | Thermo Fisher | A1569601 | Basement membrane matrix |
| GlutaMax | Thermo Fisher | 35050061 | Glutamine supplement, 100X |
| H9 (WA09) human embryonic stem cell line | WiCell | WA09 | |
| Heregulin b-1 | Peprotech | 100-3 | |
| IGF | Peprotech | 100-11 | |
| Knockout DMEM | Thermo Fisher | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
| Laminin | Sigma Aldrich | L2020 | |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 85850 | hESC culture medium |
| N2 supplement | Thermo Fisher | 17502001 | |
| NEAA | Thermo Fisher | 11140050 | |
| Neurobasal | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma Aldrich | P3655 | |
| ROCK inhibitor | Tocris | 1254 | |
| SB431542 | Tocris | 1614 | |
| SHH | Applied Biological Materials | Z200617 | |
| Stemdiff Neural Progenitor medium | Stemcell Technologies | 5833 | NPC expansion medium |
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