Epigenetik Tabanlı Kantitatif PCR Kullanarak Bağışıklık Hücre Kimliğinin ve Saflığın Belirlenmesi

Tüm insan örnekleri, insan araştırma etiği yönergelerini izleyerek ticari bir kaynaktan elde edilebildi. 1. Genomik DNA izolasyonu NOT: Genomik DNA izolasyonu, periferik kan mononükleer hücreleri (PBMCs), saflaştırılmış T hücreleri veya diğer hematopoetik hücre tipi gibi herhangi bir hematopoetik hücreden ticari olarak kullanılabilen bir kit (Bkz. Malzeme Tablosu)kullanılarak gerçekleştirilir. Bu deneyde üç farklı insan donörün periferik kan mononükleer hücreleri (PBMCs) ve T hücreleri kullanılmıştır. 1-2 x 106 hematopoetik hücreleri konik bir tüpe yerleştirin ve santrifüj 400 x g 10 dakika boyunca yerleştirin. Supernatant’ı tamamen aspire edin. Numuneye 350 μL lysis/bağlayıcı tampon ekleyin ve 55 °C’de 10 dakika kuluçkaya yatırın. 30 s için hücre süspansiyon ve girdap 350 μL proteinaz K (20 mg /mL) 50 μL ekleyin. 50 μL DNA bağlayıcı paramanyetik boncuk ve 400 μL 0 isopropanol ekleyin ve oda sıcaklığında 3 dakika kuluçka (RT). Tüpü 2 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin ve boncukları rahatsız etmemeye özen tonuyla süpernatantı çıkarın. DNA bu adımda manyetik boncuklara bağlı. 950 μL yıkama tamponu ekleyin 1. Girdap 30 s ve tekrar adım 1.6 için. Adımı 1.7’yi tekrarlayın. 950 μL yıkama tamponu 2 ekleyin. Girdap 30 s ve tekrar adım 1.6 için. 2 dk. Tüpü manyetik bir standa 1 dakika boyunca 100 μL elüsyon tamponu ve girdap ekleyin ve gDNA içeren süpernatantı yeni bir tüpe aktarın. 260 nm, 280 nm ve 230 nm’de OD elde ederek bir florimetre kullanarak gDNA’nın saflığını ölçmek için hematopoetik hücrelerden izole edilen gDNA’nın 1 μL’sini kullanın. 260 ve 280 nm’deki optik yoğunluk (OD oranı) oranının 1.7-2.0, 260 ve 230 nm’deki OD oranının 1.5-2.4 arasında olduğundan emin olun. 2. Örnek hazırlama Bir termomiker 56 °C’ye önceden ısıtın. Tüm numuneler, kalibratörler ve referans malzeme için 2 mL’lik tüpleri etiketleyin. Rt’de numuneleri ve kalibratörü elüsyon arabelleğiyle (adım 1 için kullanılan kit ile birlikte kullanılabilir) seyreltin. Tüm deneysel numuneler için gDNA’yı toplam 142 μL hacmine seyreltin. Örneğin, 100 ng/μL’de 4 μL gDNA’yı 138 μL elüsyon tamponuna seyreltin.NOT: 400-1.200 ng gDNA teşrin için kullanılabilir. Kalibratörün 75 μL’sini toplam 142 μL hacmine seyreltin. Referans gDNA konsantrasyonunu bir spektrofotometre ile kontrol edin, BOŞ olarak TE (pH = 8.0) kullanarak. Referans gDNA’nın 1.000-1.200 ng’sini toplam 142 μL hacmine seyreltin. Örneğin, 100 ng/μL’de 10μL referans gDNA’yı 132 μL elüsyon tamponuna seyreltin. Tüpleri 56 °C’de 5 dk 900 rpm’de bir termomikte kuluçkaya yatırın. Örnekleri toplamak için tüpleri kısaca aşağı çevirin. 3. Bisülfit dönüşüm NOT: Bisülfit dönüşüm sırasında kuluçka sürelerini önerilen süreleri takip edin. Aşırı kuluçka veya az kuluçka tahkikat sonuçlarını etkileyecektir. Termomiker’i 80 °C’ye ayarlayın. Tüm tüplere 270 μL amonyum bisülfit ve 90 μL tetrahidrofurfuryl alkol (THFA) ekleyin. Girdap tamamen karıştırmak ve kısaca alt sıvı toplamak için örnekleri aşağı spin. Tüpleri 80 °C’de bir termomikte 900 rpm’de 45 dk’ya inküp atın. Bir ısı bloğu kullanıyorsanız, kuluçka sırasında 1-2 s her 4,5 dk için tüpler girdap. Kısaca örnekleri aşağı spin ve adım 4 veya 5 ile devam etmeden önce 3-5 dakika boyunca RT soğumasını bekleyin. Son hacim ~500 μL olmalıdır. 4. CD8 ve Treg tahlilleri Bisülfit dönüşüm sonrası DNA arınmasıNOT: Bu adım, bisülfitdönüştürülmüş DNA üzerinde ticari olarak kullanılabilen DNA arıtma kiti (bkz. Malzemeler Tablosu)kullanılarak gerçekleştirilir. Reaktiflerin kullanmadan önce RT’ye ısıtıldığından emin olun. Arınmaya başlamadan önce, 30 s. Şişelerde listelenen hacimleri izleyerek yıkama tamponlarına etanol ve izopropanol ekleyerek DNA izolasyonu paramanyetik boncuklarının homojen bir karışımını oluşturun ve 65 °C’ye kadar bir ısı bloğu ayarlayın. RT’de, adım 3.4’ten itibaren her tüpe 870 μL lizis/bağlayıcı tampon ve 105 μL DNA bağlayıcı paramanyetik boncuk ekleyin. Girdap tamamen karıştırmak ve kısaca tüpler aşağı spin. Tamamen karıştırmak için 2-propanol ve girdap 570 μL ekleyin. Bir thermomixer veya standart dönen karıştırıcı 50 rpm 7 dakika IÇIN RT tüpler inkübasyon. Kısaca tüpleraşağı dön. Tüpleri manyetik rafa yerleştirin ve 5 dakika kuluçkaya yatırın. Örnekler hala manyetik raftayken, boncukları rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın.NOT: DNA boncuklara bağlıdır. Tüpleri manyetik raftan çıkarın ve 900 μL yıkama tamponu 1 ekleyin. Girdap tüpler tamamen boncuklar resuspend ve daha sonra kısaca tüpler aşağı spin. Tüpleri manyetik rafa geri döndürün ve 3 dakika kuluçkaya yatırın. Örnekler hala manyetik raftayken, boncukları rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın. Yıkama yıkar (4.1.7-4.1.9), yıkama tamponu 1 ile bir kez, sonra iki kez yıkama tampon 2 ile tekrarlayın. Supernatant çıkardıktan sonra, kısaca tüpler aşağı spin ve 3 dakika için manyetik raf dönmek. Tüm artık yıkama tamponu 2 çıkarın ve tüpleri manyetik raftan çıkarın. 65 °C’de tüp kapakları açık boncukları 15 dk kurulayın. Her tüpe 60 μL elüsyon tamponu ekleyin ve 1400 rpm’de 7 dakika BOYUNCA RT’de kuluçkaya yatırın. Alternatif olarak, bir köpük adaptörü kullanarak orta hızda girdap. Kısaca tüpler aşağı spin ve 2 dakika için manyetik raf üzerine yerleştirin. Boncukları rahatsız etmeden 55 μL’lik yeni bir tüpe aktarın. Eluat, bisülfitli DNA içerir. DNA konsantrasyonu ölçümü gerekli değildir. QPCR’ı kur ve çalıştır QPCR makinesini ve yazılımını çalıştıran bilgisayarı açın. Yazılım kullanıcı arabiriminde yeni bir deneme oluşturun ve denemeyi çalıştırmak için hangi bloğun kullanıldığını seçin. Deneme türü olarak Standart Eğri’yi seçin. Varsa, hangi algılama kimyasını kullanmak istediğinizi seçin. Bu titret, TaqMan reaktiflerinikullanır. Aksi takdirde, pasif başvuru olarak ROX’u seçin. Varsa, Standartolarak çalıştırılanan enstrümanın özelliklerini seçin. Deneysel tasarımınızı hedefleri (örneğin, GAPDH veya CD8 ile FAM muhabir olarak) ve floresan olmayan bir sorgulayıcı atayarak tanımlayın. Standartlar, örnekler ve denetimler için örnek adlar atayın. Daha sonra, qPCR plakasına göre her iyi pozisyon atayın. Her kuyu, CD8 veya GAPDH gibi bir hedef ve örnek bir ad gerektirir. Her örnek üç etekli olarak çalıştırılır ve aletin plaka düzenine yansıtılmalıdır. Her standart görev Standart atamave Tablo 1’egöre son kopya numaralarını belirtin. Örnekler, kalibratör atayın ve Bilinmeyengörevi başvurun. NTC veya Nolarak hiçbir şablon denetimi için kuyular belirleyin. Lambda DNA’sının (10 ng/μL) seri seyreltmelerini standart olarak kullanılacak şekilde hazırlayın (Bkz. Tablo 1). QPCR ana karışık kokteyller, hedef hücre tipi için bir ve GAPDH için bir hazırlayın (Tablo 2’yebakınız). Tüm numuneleri, standartları ve NTC kontrolünü üç etekli olarak çalıştırın.NOT: GAPDH toplam hücre sayısını ölçmek için kullanılır ve hedef amplifikasyona paralel olarak çalıştırılır. CD8 B geni için metillenmemiş düzenleyici elementlerin kopyaları CD8 testinde, FoxP3 Treg’de ve IL-17 Th17’de ölçülür. QPCR için 96 kuyu plakası kullanın. Önce 3 μL şablon DNA’yı kuyulara yükleyin. Daha sonra, ana karışımın 7 μL’sini yükleyin. Plakayı bir qPCR filmle kapatın ve qPCR aletine yerleştirmeden önce plakayı kısa bir süre aşağı doğru çevirin. Tablo 3’tegösterildiği gibi qPCR çalıştırın. Çalışma tamamlandıktan sonra qPCR verilerini .txt veya .xlsx dosyası olarak dışa aktarın. Ct Ortalamasını, Ct Standart Sapmasını ve Kopya Numarasını hesaplamak için CD8 tahlilleri ve Treg tahlilleri (Bkz. Malzemeler Tablosu)için Analiz Şablonlarını kullanarak verileri analiz edin. İlk plazmid Kopya Numarası/3 μL Birim Dilüent DNA [1] 3 μL başına Son Kopya Numarası Etiket 31250 1000 μL – 31250 STD#1 31250 200 μL 800 μL 6250 STD#2 6250 200 μL 800 μL 1250 STD#3 1250 200 μL 800 μL 250 STD#4 250 200 μL 800 μL 50 STD#5 1250 30 μL 1200 μL 30 STD#6 [2] [1] TE’de 10 ng/μL Lambda DNA (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) [2] STD#6’yı hazırlamak için STD#3’u kullanın Tablo 1: Standart seyreltmelerin hazırlanması. 31250-30 nüsha lık 4 günlük seyreltme standartları tabloya göre seyreltici olarak TE/lambda DNA kullanılarak hazırlanmıştır. Cd8 ve GAPDH için de aynı standart seyreltmeler kullanılmıştır. Standartlar -20 °C’de saklandı. Reaktif Tutar Lambda DNA (TE’de 50 ng/μL, pH8.0) 1 μL TaqMan tsay 0,5 μL Su, Nükleaz içermez 0,5 μL Ana Karışım 5 μL Toplam 7 μL Tablo 2: QPCR kokteylinin hazırlanması. QPCR ana karışımını, şablon DNA’sını tabloya göre hariç olmak üzere, CD8 ve GAPDH için birer tane olmak üzere iki ayrı tüp halinde hazırlayın. Adım Zaman Temp Döngü Kuluçka öncesi 35 dk 95°C 1X Amplifikasyon 15 sn 95°C 50X 1 dk 61°C Cooldown 5 sn 42°C 1X Tablo 3: CD8 ve Treg tsay için qPCR çalışma parametreleri. QPCR tabloda belirtilen parametrelere göre çalıştırıldı. 5. Th17 tsur Bisülfit dönüşüm sonrası DNA arınması Bölüm 4.1’de açıklandığı gibi arınma adımlarını gerçekleştirin. Numuneleri uzaklaştırmak için her tüpe 25 μL elüsyon tamponu ekleyin ve 1400 rpm’de 7 dakika BOYUNCA RT’de kuluçkaya yatırın. Alternatif olarak, bir köpük adaptörü kullanarak orta hızda girdap. Kısaca tüpler aşağı spin ve 2 dakika için bir manyetik raf üzerinde yerleştirin. Boncukları rahatsız etmeden 20 μL’lik yeni bir tüpe aktarın. Eluat, bisülfitli DNA içerir. DNA preamplifikasyonuNOT: QPCR19ile doğru niceleme için düşük bolluk hedefleri için DNA preamplifikasyonu önerilir. Th17 metilasyon tayı bu nedenle preamplifikasyon gerektirecek şekilde tasarlanmıştır. 2 μL’lik bisülfit dönüştürülmüş DNA’yı PCR şerit tüplerine aktarın. 2 μL su ile bir NTC tüp oluşturun. Tüm numuneler için preamplifikasyon ana karışımını oluşturun (bkz. Tablo 4). Her tüpe ana karışımın 23 l’sini ekleyin. Tüpleri kaplayın, girdap, ve kısaca tüpler aşağı spin. Isıtmalı bir kapak kullanarak bir termocycler üzerinde preamplifikasyon protokolü çalıştırın. (Tablo 5). Koşu tamamlandıktan sonra, kısaca tüpler aşağı spin. Güçlendirilmiş DNA’nın 2 μL’sini yeni tüplere aktarın ve numuneleri 1:40’da seyrelterek 78°L su ekleyin. qPCR kurmak ve çalıştırmak QPCR’ı kurmak ve çalıştırmak için bölüm 4.2’yi izleyin. Ct Ortalamasını, Ct Standart Sapmasını ve Kopya Numarasını hesaplamak için Th17 tahlilinin analiz şablonunu kullanarak verileri analiz edin (bkz. Malzeme Tablosu). Reaktif Tutar Su, Nükleaz içermez 9,5 μL Sıcak Başlangıç PCR Master Mix 12,5 μL Th17 PCR Astar 1 μL Toplam 23 μL Tablo 4: Th17 testi için DNA’yı önceden yükseltin. Ön amplifikasyon reaksiyon ana karışımı tabloya göre hazırlanmıştır. Adım Zaman Temp Döngü Kuluçka öncesi 35 dk 95°C 1X Denatürasyon 1 dk 95°C 12 X Tavlama 45 sn 55°C Uzama 30 sn 72°C Son uzama 10 dk 72°C 1X Tutun Belirsiz 4°C Tablo 5: Th17 DNA’sını önceden nemleyin. Th17 DNA’sı gerçek qPCR’dan önce 12 döngü boyunca önceden yükseltildi.