Determinazione dell'identità e della purezza delle cellule immunitarie utilizzando la PCR quantitativa basata sull'epigenetica
Summary
Qui descriviamo un metodo robusto per determinare l’identità e la purezza delle cellule immunitarie attraverso firme epigenetiche rilevate utilizzando la PCR quantitativa (qPCR). La demetilazione del DNA in un locus specifico funge da identificatore univoco per un particolare tipo di cellula e consente l’identificazione delle cellule T CD8, normative o Th17.
Abstract
Le frequenze della popolazione di sottotipi di cellule immunitarie possono avere un grande effetto sull’efficacia delle terapie con cellule T. I metodi attuali, come la citometria di flusso, hanno requisiti di campionamento specifici, un elevato input di campione, hanno una bassa produttività e sono difficili da standardizzare, che sono tutti dannosi per la caratterizzazione dei prodotti di terapia cellulare durante il loro sviluppo e Produzione.
I test descritti qui identificano e quantificano accuratamente i tipi di cellule immunitarie in una miscela eterogenea di cellule che utilizzano DNA genomico isolato (gDNA). I modelli di metilazione del DNA si rivelano attraverso la conversione bisulfita, un processo in cui le citosine non metilate vengono convertite in uracili. Le regioni del DNA non metilato vengono rilevate attraverso l’amplificazione qPCR utilizzando primer che prendono di mira le aree convertite. Un locus univoco per analisi viene misurato e funge da identificatore accurato per un tipo di cella specifico. I test sono robusti e identificano le cellule CD8, regulatory e Th17 T in modo ad alta produttività. Questi saggi ottimizzati possono essere potenzialmente utilizzati per i test di rilascio in-process e di prodotto per il processo di terapia cellulare.
Introduction
L’uso di cellule T nell’immunoterapia cellulare è aumentato in modo significativo nell’ultimo decennio, soprattutto con l’avvento del recettore dell’antigene chimerico (CAR) della tecnologia delle cellule T1. Mentre le terapie basate sulle cellule T sono state soddisfatte con grande successo clinico, sono eterogenee e le caratteristiche e le identità delle cellule possono variare in modo significativo tra i donatori2. L’eterogeneità delle popolazioni di cellule T può avere un impatto importante sull’efficacia terapeutica e complicare le conclusioni dagli studi clinici. Per questo motivo, è fondamentale comprendere l’eterogeneità delle cellule T durante la produzione e la formulazione del prodotto per determinare le formulazioni ottimali delle immunoterapie a cellule T.
In senso lato, le cellule T possono essere divise in due gruppi: le cellule T helper CD4, che secernono citochine immunomodulatori, e le cellule T citotossiche CD8, che lisizzano direttamente le cellule che presentano l’antigene cognato sulle principali molecole del complesso di istocompatibilità (MHC) I. Le cellule T helper CD4 possono differenziarsi in una miriade di sottoinsiemi specifici che producono un insieme univoco di citochine. Alcuni suggeriscono che un rapporto definito tra le cellule T CD4 e CD8 nel prodotto cellulare finale massimizza l’efficacia e la persistenza in vivo, ma potrebbe complicare la produzione cellulare3. Le cellule T regolatorie (Tregs), un sottoinsieme di cellule T CD4, sono immunosoppressive e diminuiscono l’attivazione delle cellule immunitarie. Le cellule T regolatorie sono state implicate nella mediazione della tolleranza tumorale e, se presenti durante la produzione di cellule T CAR, possono inibire la risposta immunitaria antitumorale delle cellule T CAR4,5,6. Altri sottoinsiemi di CD4, come le cellule T helper 17 (Th17) T promuovono la clearance tumorale e possono essere sfruttate per aumentare l’efficacia delle terapie con cellule T. Così, aumentando le cellule T Th17 CD4 è di particolare interesse per le impostazioni tumorali solide dove l’aumento della produzione di interleula 17 (IL-17) promuove la risposta immunitaria antitumorale5,7,8,9. Comprendere l’importanza delle cellule Th17 nelle risposte tumorali ha spinto ulteriori indagini sulle strategie per generare queste cellule in vitro7,9. Pertanto, i metodi per rilevare questi sottoinsiemi di cellule T sono fondamentali per ottimizzare le terapie con cellule T e dovrebbero essere robusti, facili, scalabili e riproducibili.
La citometria di flusso è il metodo più comune per determinare l’identità di una cellula immunitaria. Tuttavia, la citometria di flusso richiede cellule vive e intatte che devono essere analizzate lo stesso giorno in cui vengono raccolte. Per la colorazione citochina intracellulare (ICS), l’inibizione della secrezione proteica è necessaria per trattenere le citochine all’interno delle cellule T. Tuttavia, diversi composti inibitori hanno effetti differenziali sulla secrezione di citochine specifiche, costringendo gli utenti a creare cocktail specializzati per il rilevamento della citochina di interesse10,11. Inoltre, la fedeltà della citometria di flusso si basa su cloni di anticorpi che si legano specificamente e potentemente al loro obiettivo. L’uso di diversi cloni di anticorpi può causare risultati variabili e portare a conclusioni imprecise, rendendo il metodo difficile da standardizzare12. Inoltre, l’analisi dei dati raccolti tramite la citometria di flusso, e quindi le conclusioni tratte dai dati, possono variare notevolmente tra gli utenti in base a come i cancelli sono impostati13,14. Per questi motivi, la citometria di flusso non è ideale per un controllo di qualità preciso durante lo sviluppo della terapia cellulare.
La valutazione della metilazione genomica in specifici loci genici è un metodo alternativo per determinare l’identità cellulare. La logica per l’utilizzo della metilazione del DNA per identificare tipi di cellule specifici è stata descritta in più articoli e si basa su specifici modelli di metilazione presenti in una determinata popolazione cellulare15,16,17. Nelle cellule bersaglio, alcuni siti contengono nucleotidi non metilati, mentre nelle cellule non bersaglio questi siti sono metilati. Questo modello può essere rilevato attraverso la conversione bisulfita, un processo che converte esclusivamente nucleotidi citosini non metilati (C) in uracil (U). Primer e sonde possono essere progettati contro i siti convertiti, quindi amplificati e rilevati attraverso qPCR16.
Il saggio qui descritto misura la frequenza dei sottotipi di cellule immunitarie all’interno di popolazioni eterogenee quantificando il numero di loci unmetilati specifici rispetto a un gene di pulizia. Copie degli elementi regolatori non metilati per il gene CD8 B sono misurate nel test CD8, FoxP3 a Treg e IL-17 in Th17 in questo test. Questi loci sono stati identificati isolando la popolazione cellulare specifica di interesse (ad esempio, cellule T CD8) ed eseguendo il sequenziamento bisulfite per identificare i loci che non sono metilati solo in quella cellula di tipo15. Primer e sonde sono sviluppati contro i loci straordinariamente non metilati e i campioni vengono analizzati tramite qPCR. Una curva standard di numeri di copia noti viene creata da diluizioni di un plasmide standard con numero di copia elevato, consentendo la conversione di un valore Ct in un numero di copia della trascrizione.
Per valutare le prestazioni del test, sono necessari campioni di controllo, tra cui un gDNA di riferimento e un plasmide calibratore. Il materiale genomico di riferimento è un campione di sangue raggruppato da donatori multipli con frequenze note di cellule immunitarie e viene utilizzato per un controllo delle prestazioni di analisi di controllo di qualità (QC). Il campione di calibratore è un plasmide sintetizzato che contiene le sequenze geniche CD8, FoxP3 e GAPDH in un rapporto equimolare. Viene utilizzato come misura dell’efficienza di conversione bisulfita, perché le conversioni bisulfite all’interno di diverse regioni genomiche varieranno in efficienza. Il rapporto tra l’obiettivo e GAPDH all’interno del calibratore è 1, ma a causa delle differenze di efficienza di conversione bisulfite, il rapporto può variare. Questo fattore di calibrazione viene applicato ai saggi CD8 e Treg. FoxP3, il gene usato nel saggio Treg, si trova sul cromosoma X. Poiché questo test misura solo copie non metilate di FoxP3, e solo una copia di FoxP3 è non metilata in Tregs, questo test è indipendente dal sesso e può essere utilizzato con campioni sia maschili che femminili18. L’analizzatore Th17 non utilizza un campione di calibratore o GAPDH come gene di pulizia. Invece, è incluso un altro set di primer che si rivolge ai loci metilati presenti nelle cellule non Th17 e il numero totale di cellule è riflesso dalla somma delle copie metilate e non metilate di IL-17. I dati ottenuti dal qPCR vengono inseriti in un modello di analisi preimpostato che esegue controlli di qualità sui dati e calcola la percentuale della cella di destinazione all’interno della popolazione iniziale. Ciò fornisce un’analisi dei dati automatizzata e imparziale, rimuovendo così la soggettività dell’utente e migliorando le capacità di standardizzazione.
Questo saggio utilizza gDNA, che può essere isolato da una procedura di leukapheresis utilizzando celle coltivate o fisse, o pellet cellulari congelati. Il basso fabbisogno di campioni, la flessibilità nel materiale di partenza del campione, l’alta precisione e l’analisi standardizzata affrontano i limiti associati alla citometria di flusso e sono ideali per scopi di controllo della qualità durante lo sviluppo del processo di terapia cellulare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Con l’avvento di nuove immunoterapie, vi è la necessità di metodi standardizzati per rilevare l’identità e la purezza delle cellule immunitarie. I metodi di valutazione per i test in-process e di rilascio che sono robusti, convalidati e scalabili rimangono da stabilire e rappresentano una grande sfida per la commercializzazione delle terapie basate sulle cellule. Mentre la citometria del flusso è attualmente il metodo più comune per la fenotipizzazione delle cellule immunitarie, l’elevata qualità del campione e i requisiti di quantità rendono difficile l’uso regolare. Inoltre, l’implementazione della citometria di flusso in un ambiente di buone pratiche di produzione (GMP) è limitata dalle strategie di gating dipendenti dall’operatore e dal requisito degli standard di riferimento per ogni marcatore utilizzato13,14. Anche se il gating automatizzato ha dimostrato di migliorare la robustezza di analisi, non è ancora una strategia di controllo della qualità consolidata. Mentre la profilazione dell’espressione genica può anche essere utilizzata per caratterizzare l’identità e la purezza del prodotto di terapia cellulare, i dati sono semiquantitativi e laboriosi. Inoltre, l’RNA e il microRNA sono relativamente meno stabili del DNA e possono contribuire alla mancanza di risultati robusti e riproducibili. Pertanto, l’utilizzo dello stato di metilazione del DNA epigenetico di un locus specifico fornisce un metodo stabile, facile da eseguire, robusto e scalabile per identificare e quantificare un tipo di cellula di interesse.
Il rilevamento di modelli di metilazione nelle cellule fenotipiche si basa su tre fasi critiche: in primo luogo, il saggio richiede l’uso di gDNA, che è isolato secondo i metodi descritti. È necessario il DNA di alta qualità e, se non utilizzato, la conversione bisulfita può essereinfluenzata 23,24. Se si ottiene DNA di bassa qualità, si raccomanda un’ulteriore purificazione per garantire l’affidabilità del saggio. In secondo luogo, è necessaria la conversione bisulfita di successo della citosina non metilata in uracil. Il passo più critico nella conversione bisulfita è la denaturazione del DNA23,25. La denaturazione ad alta temperatura con l’ammoniaca bisulfite, al contrario del bisulfite di sodio, aumenta l’efficienza e la consistenza della conversione ed è il processo raccomandato per questi saggi25,26. Gli utenti devono assicurarsi che la reazione si verifichi a 80 gradi centigradi e che la miscelazione del campione venga eseguita frequentemente. Per questi motivi, si consiglia un termomixer digitale (vedere Tabella dei materiali). In terzo luogo, la tecnica di pipettaggio corretta deve essere seguita durante la preparazione qPCR. Durante la reazione qPCR sono necessarie tre repliche tecniche per aderire alle informazioni minime per la pubblicazione delle linee guida MIQE (Quantitative Real-Time PCR experiments)27. L’inclusione di repliche più tecniche è accettabile ma non necessaria. La tecnica di pipettaggio impropria e/o non includendo repliche tecniche porterà a risultati qPCR inaffidabili.
Se i passaggi critici vengono seguiti e i risultati desiderati non vengono ancora ottenuti, è possibile utilizzare più controlli all’interno dell’analisi per individuare il problema. Una corretta conversione bisulfita è il passo più cruciale in questo saggio. La conversione bisulfita non corretta potrebbe essere evidenziata da un fattore di calibrazione non riuscito e/o dai valori di riferimento calcolati dal modello di analisi. Se la conversione bisulfite è stata eseguita in modo non corretto (ad esempio, se la reazione è stata effettuata a RT), non ci sarebbe alcuna amplificazione durante qPCR. Inoltre, non si vedrebbe alcun errore se si verificasse un errore durante la preparazione della reazione qPCR (ad esempio, se il master mix qPCR non fosse stato aggiunto). Questi due problemi possono essere separati esaminando i campioni standard. L’amplificazione nei campioni standard, ma non il riferimento, il calibratore e i campioni sperimentali, indicherebbe che la conversione bisulfite non è stata eseguita correttamente. Nessuna amplificazione in nessuno dei campioni indicherebbe che il qPCR non è stato eseguito correttamente.
Mentre questo analisi affronta il rigoroso requisito del campione e la variabilità dell’analisi associata ad altri metodi di fenotipizzazione, in particolare la citometria di flusso, ci sono limitazioni che devono essere notate. Questo saggio è destinato a un singolo locus utilizzato come identificatore univoco per la cella di destinazione, che proibisce l’analisi multiplexed comunemente eseguita con citometria di flusso. Questo rende difficile identificare tipi di cellule complesse come Th17. Tuttavia, l’uso di modelli di metilazione in un singolo locus ha dimostrato di essere un marcatore fenotipipico accurato di più cellule ed è stato utilizzato in più studi clinici15,16. Ciò è vero soprattutto in Tregs, dove la valutazione delle firme di metilazione FOXP3 è un metodo accurato e inequivocabile per rilevare i veri Treg dalle cellule di espressione transitoria di FOXP328. La perdita dell’analisi multiplex è compensata dalla precisione dei loci interrogati. Le iterazioni future del saggio potrebbero includere più coloranti qPCR e quenchers per consentire il rilevamento di loci multipli in una reazione qPCR.
Questo test può essere utilizzato come metodo alternativo per la citometria di flusso nel determinare il fenotipo e l’identità delle cellule. Va notato che questo saggio non produce i valori esatti che la citometria del flusso fa(Figura 1-3). Ciò è dovuto in parte alla variabilità dell’analisi dei dati associata alla citometria di flusso. A seconda della strategia di gating, i risultati della citometria di flusso possono variare in modo significativo. Ciò è particolarmente vero quando si utilizzano protocolli di colorazione complessi per esaminare obiettivi intracellulari, come IL-17, dove il coefficiente di variazione (CV) può essere alto come 15%14. Tra più utenti, il saggio presentato aveva costantemente un CV di <15%, che supportava la robustezza dell'analisi e migliori capacità di standardizzazione. Le maggiori differenze tra la fenotipizzazione epigenetica e quella a flusso si osserva quando è richiesta la stimolazione cellulare (Figura 3). La rilevazione delle cellule Th17 tramite citometria di flusso è stata effettuata utilizzando un protocollo comune per la stimolazione delle cellule T e la colorazione citochina intracellulare29,30,31. Le differenze osservate nella fenotipizzazione Th17 tra la misurazione epigenetica e la citometria di flusso potrebbero essere dovute alla cinetica della produzione di IL-17. Mentre le firme di metilazione sono costanti, la produzione di proteine richiede tempo e deve essere presente in quantità sufficienti per essere rilevata dagli anticorpi fluorescenti20,32. L’incubazione di 6 h con inibitore del trasporto proteico e cocktail di stimolazione cellulare potrebbe essere necessario estendere per vedere il livello di cellule Th17 rilevato tramite metodi di fenotipizzazione a base epigenetica. Sono necessari ulteriori studi per determinare il motivo preciso per cui i valori non corrispondono e determinare il metodo di fenotipizzazione più accurato.
In questa relazione, in dettaglio come identificare e quantificare i tipi di cellule immunitarie in una miscela eterogenea di cellule in modo semplice e robusto. I test sono progettati e ottimizzati per un potenziale utilizzo per test in-process e rilascio di terapie basate sulle cellule. I saggi descritti soddisfano il requisito per le materie prime altamente qualificate da utilizzare nelle applicazioni di terapia cellulare. Affrontando le carenze della citometria di flusso e di altri metodi molecolari come stabilità, requisiti di campionamento, stimolazione preventiva, permeabilizzazione cellulare per la colorazione intracellulare e soggettività dell’analisi dei dati, i saggi descritti sono in linea con l’obiettivo della commercializzazione di terapie basate sulle cellule.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il progetto è stato finanziato dalla sovvenzione intramurale scientifica Thermo Fisher.
Materials
| 2.0 ml Eppendorf Safe-Lock Tubes | Eppendorf | 22363344 | |
| Analysis template for CD8 assay | Click Here | ||
| Analysis template for Th17 assay | Click Here | ||
| Analysis template for Treg assay | Click Here | ||
| Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer, blue/red/violet6/yellow | Thermo Fisher Scientific | A29004 | |
| CTS PureQuant CD8+ T-Cell Assay | Thermo Fisher Scientific | A43674 | |
| CTS PureQuant Th17 Assay | Thermo Fisher Scientific | A43676 | |
| CTS PureQuant Treg Assay | Thermo Fisher Scientific | A43675 | |
| Dynabeads SILANE Genomic DNA Kit | Thermo Fisher Scientific | 37012D | Used for genomic DNA isolation and purification after bisulfite conversion. Contains elution buffer to dilute samples. |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Used as a magnetic rack during DNA isolation and purification |
| eBioscience Essential Human T cell Phenotyping Kit | Thermo Fisher Scientific | A42923 | |
| eBioscience Essential Human Th1/Th17 Phenotyping Kit | Thermo Fisher Scientific | A42927 | |
| eBioscience Essential Human Treg Phenotyping Kit | Thermo Fisher Scientific | A42925 | |
| Eppendorf SmartBlock 2 mL | Eppendorf | 5362000035 | |
| Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
| HulaMixer Sample Mixer | Thermo Fisher Scientific | 15920D | Recommended sample mixer |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ND 1000 | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | Applied Biosystems | AM12450 | |
| QuantStudio 12S Flex | Applied Biosystems | 4470661 | |
| TE, pH 8.0, RNase-free | Thermo Fisher Scientific | AM9849 | |
| Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | H2KT17113 |
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