Bestimmung der Immunzellidentität und -reinheit mittels epigenetischer quantitativer PCR
Summary
Hier beschreiben wir eine robuste Methode zur Bestimmung der Immunzellidentität und -reinheit durch epigenetische Signaturen, die mit quantitativer PCR (qPCR) nachgewiesen wurden. Die DNA-Deethylierung an einem bestimmten Ort dient als eindeutiger Identifikator für einen bestimmten Zelltyp und ermöglicht die Identifizierung von CD8+-, regulatorischen oder Th17-T-Zellen.
Abstract
Die Häufigkeiten der Population des Immunzellsubtyps können einen großen Einfluss auf die Wirksamkeit von T-Zelltherapien haben. Aktuelle Methoden, wie die Durchflusszytometrie, haben spezifische Probenanforderungen, einen hohen Probeneingang, sind geringer Durchsatz und schwer zu standardisieren, was sich nachteilig auf die Charakterisierung von Zelltherapieprodukten während ihrer Entwicklung und Herstellung.
Die hier beschriebenen Assays identifizieren und quantifizieren Immunzelltypen in einer heterogenen Zellmischung mit isolierter genomischer DNA (gDNA). DNA-Methylierungsmuster werden durch Bisulfitumwandlung aufgedeckt, ein Prozess, bei dem unmethylierte Zytosine in Uracils umgewandelt werden. Unmethylierte DNA-Regionen werden durch qPCR-Verstärkung mit Primern nachgewiesen, die auf umgewandelte Bereiche abzielen. Ein eindeutiger Lokus pro Assay wird gemessen und dient als genauer Identifikator für einen bestimmten Zelltyp. Die Assays sind robust und identifizieren CD8+-, regulatorische und Th17-T-Zellen in einer Art und Weise mit hohem Durchsatz. Diese optimierten Assays können potenziell für In-Process- und Produktfreigabetests für den Zelltherapieprozess verwendet werden.
Introduction
Die Verwendung von T-Zellen in der zellulären Immuntherapie hat in den letzten zehn Jahren deutlich zugenommen, insbesondere mit dem Aufkommen des chimären Antigenrezeptors (CAR) T-Zelltechnologie1. Während T-Zell-basierte Therapien mit großem klinischen Erfolg erfüllt wurden, sind sie heterogen und Zelleigenschaften und Identitäten können zwischen den Spendern erheblich variieren2. Die Heterogenität von T-Zellpopulationen kann erhebliche Auswirkungen auf die therapeutische Wirksamkeit haben und Schlussfolgerungen aus klinischen Studien erschweren. Aus diesem Grund ist es wichtig, die Heterogenität von T-Zellen während der Produktherstellung und -formulierung zu verstehen, um die optimalen Formulierungen von T-Zell-Immuntherapien zu bestimmen.
Im weiteren Sinne können T-Zellen in zwei Gruppen eingeteilt werden: CD4+-Hilfs-T-Zellen, die immunmodulatorische Zytokine absondern, und CD8+ zytotoxische T-Zellen, die direkt Lysezellen, die das Cognate-Antigen auf großen Histokompatibilitätskomplexen (MHC) I-Molekülen darstellen. CD4+ Hilfszellen können sich in eine Vielzahl spezifischer Teilmengen differenzieren, die einen einzigartigen Satz von Zytokinen erzeugen. Einige schlagen vor, dass ein definiertes Verhältnis von CD4+ zu CD8+ T-Zellen im Endzellprodukt die In-vivo-Wirksamkeit und Persistenz maximieren, aber die Zellherstellung erschweren könnte3. Regulatorische T-Zellen (Tregs), eine Teilmenge von CD4+ T-Zellen, sind immunsuppressiv und verringern die Aktivierung von Immunzellen. Regulatorische T-Zellen wurden in die Vermittlung von Tumortoleranz verwickelt und können, wenn sie während der Herstellung von CAR T-Zellen vorhanden sind, die Antitumor-Immunantwort von CAR-T-Zellen4,5,6hemmen. Andere CD4+-Teilmengen wie T-Helfer 17 (Th17) T-Zellen fördern die Tumorclearance und können genutzt werden, um die Wirksamkeit von T-Zell-Therapien zu erhöhen. So ist die Erhöhung der Th17 CD4+ T-Zellen von besonderem Interesse für solide Tumoreinstellungen, wo erhöhte Produktion von Interleukin 17 (IL-17) die Antitumor-Immunantwort5,7,8,9fördert. Das Verständnis der Bedeutung von Th17-Zellen in Tumorreaktionen hat zu mehr Untersuchungen zu Strategien zur Generierung dieser Zellen in vitroveranlasst 7,9. Daher sind Methoden zum Nachweis dieser T-Zell-Teilmengen entscheidend für die Optimierung von T-Zelltherapien und sollten robust, einfach, skalierbar und reproduzierbar sein.
Durchflusszytometrie ist die häufigste Methode, um die Identität einer Immunzelle zu bestimmen. Die Durchflusszytometrie erfordert jedoch lebende, intakte Zellen, die am selben Tag analysiert werden müssen, an dem sie geerntet werden. Für intrazelluläre Zytokinfärbung (ICS) ist eine Proteinsekretionshemmung erforderlich, um Zytokine in den T-Zellen zu behalten. Jedoch, verschiedene Inhibitor-Verbindungen haben unterschiedliche Auswirkungen auf die Sekretion von bestimmten Zytokinen, zwingt Benutzer, spezialisierte Cocktails für den Nachweis des Zytokins von Interesse10,11zu erstellen. Darüber hinaus beruht die Genauigkeit der Durchflusszytometrie auf Antikörperklonen, die gezielt und stark an ihr Ziel binden. Die Verwendung verschiedener Antikörperklone kann zu unterschiedlichen Ergebnissen führen und zu ungenauen Schlussfolgerungen führen, was die Standardisierung der Methode erschwert12. Darüber hinaus kann die Analyse der über die Durchflusszytometrie gesammelten Daten und damit die aus den Daten gezogenen Schlussfolgerungen zwischen den Benutzern sehr unterschiedlich sein, je nach Derart, wie Gates eingestellt sind13,14. Aus diesen Gründen ist die Durchflusszytometrie nicht ideal für eine präzise Qualitätskontrolle während der Zelltherapieentwicklung.
Die Bewertung der genomischen Methylierung an bestimmten Gen-Loci ist eine alternative Methode zur Bestimmung der Zellidentität. Die Begründung für die Verwendung von DNA-Methylierung zur Identifizierung bestimmter Zelltypen wurde in mehreren Artikeln beschrieben und stützt sich auf spezifische Methylierungsmuster, die in einer gegebenen Zellpopulation15,16,17vorhanden sind. In Zielzellen enthalten bestimmte Standorte unmethylierte Nukleotide, während diese in Nicht-Zielzellen methyliert sind. Dieses Muster kann durch Dieulfitumwandlung nachgewiesen werden, ein Prozess, der ausschließlich unmethylierte Cytosinnukleotide (C) in Uracil (U) umwandelt. Primer und Sonden können für die konvertierten Standorte ausgelegt, dann verstärkt und durch qPCR16erkannt werden.
Der hier beschriebene Assay misst die Häufigkeit von Immunzellsubtypen innerhalb heterogener Populationen, indem die Anzahl der spezifischen nicht methylierten Loci im Vergleich zu einem Haushaltsgen quantifiziert wird. Kopien der nicht methylierten regulatorischen Elemente für das CD8-B-Gen werden in diesem Test im CD8-Assay, FoxP3 in Treg und IL-17 in Th17 gemessen. Diese Loci wurden identifiziert, indem die spezifische Zellpopulation von Interesse (z. B. CD8+ T-Zellen) isoliert und Bisulfitsequenzierung durchführt wurde, um Loci zu identifizieren, die nur in diesem Zelltyp15unmethyliert sind. Primer und Sonden werden gegen die einzigartig unmethylierten Loci entwickelt und Proben mittels qPCR analysiert. Aus Verdünnungen eines Standardplasmids mit hoher Kopierzahl wird eine Standardkurve bekannter Kopiernummern erstellt, die die Umwandlung eines Ct-Werts in eine Transkriptkopiennummer ermöglicht.
Um die Assay-Leistung zu bewerten, sind Kontrollproben erforderlich, einschließlich einer Referenz-gDNA und eines Kalibrator-Plasmids. Das Referenzgenommaterial ist eine gepoolte Blutprobe von mehreren Spendern mit bekannten Immunzellfrequenzen und wird für eine Qualitätskontrolle (QC) Assay-Leistungsprüfung verwendet. Die Kalibratorprobe ist ein synthetisiertes Plasmid, das die Gensequenzen CD8, FoxP3 und GAPDH in einem Äquimolar-Verhältnis enthält. Es wird als Maß für die Bisulfitumwandlungseffizienz verwendet, da Bisulfit-Umwandlungen innerhalb verschiedener genomischer Regionen in der Effizienz variieren. Das Verhältnis des Ziels zu GAPDH innerhalb des Kalibrators beträgt 1, aber aufgrund der Unterschiede der Bisulfitumwandlungseffizienz kann das Verhältnis variieren. Dieser Kalibrierungsfaktor wird auf die CD8- und Treg-Assays angewendet. FoxP3, das im Treg-Assay verwendete Gen, befindet sich auf dem X-Chromosom. Da dieser Test nur unmethylierte Kopien von FoxP3 misst und nur eine Kopie von FoxP3 in Tregs unmethyliert ist, ist dieser Assay sexagnostisch und kann sowohl mit männlichen als auch mit weiblichen Proben18verwendet werden. Der Th17-Assay verwendet keine Kalibratorprobe oder GAPDH als Housekeeping-Gen. Stattdessen wird ein weiterer Primersatz enthalten, der auf die in Nicht-Th17-Zellen vorhandenen methylierten Loci abzielt, und die Gesamtzahl der Zellen wird durch die Summe der methylierten und nicht methylierten Kopien von IL-17 reflektiert. Die aus der qPCR erhaltenen Daten werden in eine voreingestellte Analysevorlage eingegeben, die Qualitätskontrollen der Daten durchführt und den Prozentsatz der Zielzelle innerhalb der Startgrundgesamtheit berechnet. Dies ermöglicht eine automatisierte und unvoreingenommene Datenanalyse, wodurch die Subjektivität der Benutzer entfernt und die Standardisierungsfunktionen verbessert werden.
Dieser Test verwendet gDNA, die durch ein Leukapherese-Verfahren mit kultivierten oder festen Zellen oder gefrorenen Zellpellets isoliert werden kann. Die geringe Probenanforderung, Flexibilität im Probenausgangsmaterial, hohe Genauigkeit und standardisierte Analyse schließen die Mitflusszytometrie verbundenen Grenzen und sind ideal für Die Qualitätskontrolle während der Zelltherapie-Prozessentwicklung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mit dem Aufkommen neuer Immuntherapeutika sind standardisierte Methoden zur Erkennung der Identität und Reinheit von Immunzellen erforderlich. Bewertungsmethoden für Prozess- und Releasetests, die robust, validiert und skalierbar sind, müssen noch etabliert werden und stellen eine große Herausforderung für die Kommerzialisierung zellbasierter Therapien dar. Während die Durchflusszytometrie derzeit die häufigste Methode zur Immunzell-Phänotypisierung ist, erschweren hohe Probenqualitäts- und Quantitätsanforderungen den regelmäßigen Einsatz. Darüber hinaus wird die Implementierung der Durchflusszytometrie in einer Good Manufacturing Practice (GMP)-Umgebung durch bedienerabhängige Gating-Strategien und die Anforderung von Referenzstandards für jeden verwendeten Marker13,14eingeschränkt. Obwohl sich gezeigt hat, dass automatisiertes Gating die Robustheit des Assays verbessert, ist es noch keine etablierte Strategie zur Qualitätskontrolle. Während Genexpressionsprofiling auch verwendet werden kann, um die Identität und Reinheit des Zelltherapieprodukts zu charakterisieren, sind die Daten semiquantitativ und arbeitsintensiv. Darüber hinaus sind RNA und microRNA relativ weniger stabil als DNA und können zum Mangel an robusten und reproduzierbaren Ergebnissen beitragen. Die Nutzung des epigenetischen DNA-Methylierungsstatus eines bestimmten Ortes bietet somit eine stabile, einfach durchzuführende, robuste und skalierbare Methode zur Identifizierung und Quantifizierung eines Zelltyps.
Der Nachweis von Methylierungsmustern zu Phänotypzellen beruht auf drei kritischen Schritten: Erstens erfordert der Assay die Verwendung von gDNA, die nach den beschriebenen Methoden isoliert wird. Hochwertige DNA ist erforderlich und wenn nicht verwendet, Bisulfit Umwandlung kann betroffen sein23,24. Wenn DNA von geringer Qualität gewonnen wird, wird eine weitere Reinigung empfohlen, um die Testzuverlässigkeit zu gewährleisten. Zweitens ist eine erfolgreiche Bisulfitumwandlung des unmethylierten Cytosins in Uracil erforderlich. Der kritischste Schritt bei der Bisulfitumwandlung ist die DNA-Denaturierung23,25. Hochtemperatur-Denaturierung mit Ammoniumbisulfit, im Gegensatz zu Natriumbisulfit, erhöht die Umwandlungseffizienz und Konsistenz und ist das empfohlene Verfahren für diese Assays25,26. Der Anwender muss sicherstellen, dass die Reaktion bei 80 °C erfolgt und dass das Probenmischen häufig erfolgt. Aus diesen Gründen wird ein digitaler Thermomixer empfohlen (siehe Materialtabelle). Drittens muss während der qPCR-Vorbereitung die richtige Pipettiertechnik befolgt werden. Während der qPCR-Reaktion sind drei technische Replikationen erforderlich, um die Mindestinformationen für die Veröffentlichung quantitativer Echtzeit-PCR-Experimente (MIQE) einzuhalten27. Die Einbeziehung weiterer technischer Repliken ist akzeptabel, aber nicht erforderlich. Unsachgemäße Pipettiertechnik und/oder ohne technische Replikationen führen zu unzuverlässigen qPCR-Ergebnissen.
Wenn die kritischen Schritte befolgt werden und die gewünschten Ergebnisse immer noch nicht erzielt werden, können mehrere Steuerelemente innerhalb des Assays genutzt werden, um das Problem zu ermitteln. Die richtige Bisulfitumwandlung ist der wichtigste Schritt in diesem Test. Eine unsachgemäße Bisulfitkonvertierung würde durch einen fehlgeschlagenen Kalibrierungsfaktor und/oder Referenzwerte hervorgehoben, die von der Analysevorlage berechnet werden. Wenn die Bisulfitumwandlung falsch durchgeführt wurde (z. B. wenn die Reaktion bei RT durchgeführt wurde), würde es während qPCR keine Verstärkung geben. Außerdem wäre keine Verstärkung zu sehen, wenn während der qPCR-Reaktionsvorbereitung ein Fehler gemacht wurde (z. B. wenn der qPCR-Mastermix nicht hinzugefügt wurde). Diese beiden Probleme können durch die Untersuchung der Standardproben getrennt werden. Eine Verstärkung in den Standardproben, nicht jedoch die Referenz-, Kalibrator- und Versuchsproben, würde darauf hindeuten, dass die Bisulfitumwandlung nicht korrekt durchgeführt wurde. Keine Verstärkung in einer der Proben würde darauf hindeuten, dass die qPCR nicht korrekt durchgeführt wurde.
Während dieser Test die strengen Stichprobenanforderungen und Analysevariabilitäten im Zusammenhang mit anderen Phänotypisierungsmethoden, insbesondere der Durchflusszytometrie, berücksichtigt, müssen Einschränkungen beachtet werden. Dieser Test zielt auf einen einzelnen Ort ab, der als eindeutiger Bezeichner für die Zielzelle verwendet wird, wodurch die Multiplexanalyse, die häufig mit Flusszytometrie durchgeführt wird, verboten wird. Dies macht die Identifizierung komplexer Zelltypen wie Th17 schwierig. Jedoch, die Verwendung von Methylierungsmuster an einem einzigen Ort hat sich als ein genauer phätotypischer Marker von mehreren Zellen und wurde in mehreren klinischen Studien15,16verwendet. Dies gilt insbesondere für Tregs, wo die Bewertung von FOXP3-Methylierungssignaturen eine genaue und eindeutige Methode zum Nachweis echter Tregs aus vorübergehend FOXP3-Exzesszellen28ist. Der Verlust der Multiplex-Analyse wird durch die Genauigkeit der verhörten Loci kompensiert. Zukünftige Iterationen des Assays könnten mehrere qPCR-Farbstoffe und Quencher enthalten, um die Erkennung mehrerer Loci in einer qPCR-Reaktion zu ermöglichen.
Dieser Test kann als alternative Methode für die Durchflusszytometrie bei der Bestimmung des Zellphänotyps und der Identität verwendet werden. Es sei darauf hingewiesen, dass dieser Test nicht die genauen Werte liefert, die die Zytometrie durchfließen (Abbildungen 1-3). Dies ist zum Teil auf die Variabilität der Datenanalyse im Zusammenhang mit der Durchflusszytometrie zurückzuführen. Je nach Gating-Strategie können die Ergebnisse der Durchflusszytometrie erheblich variieren. Dies ist insbesondere der Fall, wenn komplexe Färbeprotokolle verwendet werden, um intrazelluläre Ziele wie IL-17 zu betrachten, wo der Variationskoeffizient (CV) bis zu 15%14betragen kann. Zwischen mehreren Benutzern hatte der vorgestellte Test konsistent einen Lebenslauf von <15%, was die Robustheit des Assays und verbesserte Standardisierungsfunktionen unterstützte. Die größten Unterschiede zwischen epigenetischer und durchflusszytometriebasierter Phänotypisierung sind zu beobachten, wenn eine Zellstimulation erforderlich ist (Abbildung 3). Der Nachweis von Th17-Zellen über Durchflusszytometrie wurde mit einem gemeinsamen Protokoll zur T-Zellstimulation und intrazellulären Zytokinfärbung29,30,31durchgeführt. Die Unterschiede, die bei der Th17-Phänotypisierung zwischen epigenetischer Messung und Durchflusszytometrie beobachtet wurden, könnten auf die Kinetik der IL-17-Produktion zurückzuführen sein. Während die Methylierungssignaturen stabil sind, braucht die Proteinproduktion Zeit und muss in ausreichenden Mengen vorhanden sein, um von fluoreszierenden Antikörpern nachgewiesen zu werden20,32. Die 6 h Inkubation mit Protein-Transport-Inhibitor und Zellstimulationscocktail muss möglicherweise erweitert werden, um den Gehalt an Th17-Zellen zu sehen, die über epigenetische Phänotypisierungsmethoden nachgewiesen werden. Weitere Studien sind erforderlich, um den genauen Grund zu bestimmen, warum die Werte nicht übereinstimmen, und die genaueste Phänotypisierungsmethode zu bestimmen.
In diesem Bericht beschreiben wir, wie Immunzelltypen in einer heterogenen Zellmischung auf einfache und robuste Weise identifiziert und quantifiziert werden können. Die Assays sind für den möglichen Einsatz für In-Process- und Release-Tests von zellbasierten Therapeutika konzipiert und optimiert. Die beschriebenen Assays erfüllen die Anforderung, dass hochqualifizierte Rohstoffe in Zelltherapieanwendungen eingesetzt werden müssen. Durch die Behebung der Mängel der Durchflusszytometrie und anderer molekularer Methoden wie Stabilität, Probenanforderungen, vorherige Stimulation, zelluläre Permeabilisierung für intrazelluläre Färbung und Subjektivität der Datenanalyse sind die beschriebenen Assays mit den Zielen der Kommerzialisierung zellbasierter Therapien.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Das Projekt wurde durch thermo Fisher Scientific Intramural Grant finanziert.
Materials
| 2.0 ml Eppendorf Safe-Lock Tubes | Eppendorf | 22363344 | |
| Analysis template for CD8 assay | Click Here | ||
| Analysis template for Th17 assay | Click Here | ||
| Analysis template for Treg assay | Click Here | ||
| Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer, blue/red/violet6/yellow | Thermo Fisher Scientific | A29004 | |
| CTS PureQuant CD8+ T-Cell Assay | Thermo Fisher Scientific | A43674 | |
| CTS PureQuant Th17 Assay | Thermo Fisher Scientific | A43676 | |
| CTS PureQuant Treg Assay | Thermo Fisher Scientific | A43675 | |
| Dynabeads SILANE Genomic DNA Kit | Thermo Fisher Scientific | 37012D | Used for genomic DNA isolation and purification after bisulfite conversion. Contains elution buffer to dilute samples. |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Used as a magnetic rack during DNA isolation and purification |
| eBioscience Essential Human T cell Phenotyping Kit | Thermo Fisher Scientific | A42923 | |
| eBioscience Essential Human Th1/Th17 Phenotyping Kit | Thermo Fisher Scientific | A42927 | |
| eBioscience Essential Human Treg Phenotyping Kit | Thermo Fisher Scientific | A42925 | |
| Eppendorf SmartBlock 2 mL | Eppendorf | 5362000035 | |
| Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
| HulaMixer Sample Mixer | Thermo Fisher Scientific | 15920D | Recommended sample mixer |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ND 1000 | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | Applied Biosystems | AM12450 | |
| QuantStudio 12S Flex | Applied Biosystems | 4470661 | |
| TE, pH 8.0, RNase-free | Thermo Fisher Scientific | AM9849 | |
| Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | H2KT17113 |
References
- Hartmann, J., Schüßler-Lenz, M., Bondanza, A., Buchholz, C. J. Clinical development of CAR T cells-challenges and opportunities in translating innovative treatment concepts. EMBO Molecular Medicine. 9, 1183-1197 (2017).
- Graham, C., Jozwik, A., Pepper, A., Benjamin, R. Allogeneic CAR-T Cells: More than Ease of Access?. Cells. 7, E155 (2018).
- Turtle, C. J., et al. CD19 CAR-T cells of defined CD4+:CD8+ composition in adult B cell ALL patients. Journal of Clinical Investigation. 126, 2123-2138 (2016).
- Akalin, I., et al. Effects of Chimeric Antigen Receptor (CAR) Expression on Regulatory T Cells. Molecular Therapy. 17, S25 (2009).
- Knochelmann, H. M., et al. CAR T Cells in Solid Tumors: Blueprints for Building Effective Therapies. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
- Chen, M. L., et al. Regulatory T cells suppress tumor-specific CD8 T cell cytotoxicity through TGF-β signals in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102, 419-424 (2005).
- Muranski, P., et al. Tumor-specific Th17-polarized cells eradicate large established melanoma. Blood. 112, 362-373 (2008).
- Majchrzak, K., et al. Exploiting IL-17-producing CD4+ and CD8+ T cells to improve cancer immunotherapy in the clinic. Cancer Immunology, Immunotherapy. 65, 247-259 (2016).
- Guedan, S., et al. ICOS-based chimeric antigen receptors program bipolar TH17/TH1 cells. Blood. 124, 1070-1080 (2014).
- Vicetti Miguel, R. D., Maryak, S. A., Cherpes, T. L. Brefeldin A, but not monensin, enables flow cytometric detection of interleukin-4 within peripheral T cells responding to ex vivo stimulation with Chlamydia trachomatis. Journal of Immunological Methods. 384, 191-195 (2012).
- Lovelace, P., Maecker, H. T. Multiparameter Intracellular Cytokine Staining. Methods in Molecular Biology. 699, 165-178 (2011).
- Presicce, P., Moreno-Fernandez, M. E., Lages, C. S., Orsborn, K. I., Chougnet, C. A. Association of two clones allows for optimal detection of human FOXP3. Cytometry A. 77, 571-579 (2010).
- Pachón, G., Caragol, I., Petriz, J. Subjectivity and flow cytometric variability. Nature Reviews Immunology. 12, 396 (2012).
- Westera, L., et al. Centrally Determined Standardization of Flow Cytometry Methods Reduces Interlaboratory Variation in a Prospective Multicenter Study. Clinical and Translational Gastroenterology. 8, e126 (2017).
- Baron, U., et al. Epigenetic immune cell counting in human blood samples for immunodiagnostics. Science Translational Medicine. 10, (2018).
- Kleen, T. O., Yuan, J. Quantitative real-time PCR assisted cell counting (qPACC) for epigenetic – based immune cell quantification in blood and tissue. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3, 46 (2015).
- Rapko, S., et al. DNA methylation analysis as novel tool for quality control in regenerative medicine. Tissue Engineering. 13, 2271-2280 (2007).
- Wieczorek, G., et al. Quantitative DNA Methylation Analysis of FOXP3 as a New Method for Counting Regulatory T Cells in Peripheral Blood and Solid Tissue. Cancer Research. 69, 599-608 (2009).
- Andersson, D., et al. Properties of targeted preamplification in DNA and cDNA quantification. Expert Review of Molecular Diagnosis. 15, 1085-1100 (2015).
- Jung, T., Schauer, U., Heusser, C., Neumann, C., Rieger, C. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 159, 197-207 (1993).
- Armbruster, D. A., Pry, T. Limit of Blank, Limit of Detection and Limit of Quantitation. Clinical Biochemistry Reviews. 29, S49-S52 (2008).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55, 611-622 (2009).
- Li, Y., Tollefsbol, T. O. DNA methylation detection: Bisulfite genomic sequencing analysis. Methods in Molecular Biology. 791, 11-21 (2011).
- Warnecke, P. M., et al. Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing. Methods. 27, 101-107 (2002).
- Genereux, D. P., Johnson, W. C., Burden, A. F., Stöger, R., Laird, C. D. Errors in the bisulfite conversion of DNA: modulating inappropriate- and failed-conversion frequencies. Nucleic Acids Research. 36, e150 (2008).
- Darst, R. P., Pardo, C. E., Ai, L., Brown, K. D., Kladde, M. P. Bisulfite Sequencing of DNA. Current Protocols in Molecular Biology. 91, 7.9.1-7.9.7 (2010).
- Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines. Methods. 50, S1-S5 (2010).
- Baron, U., et al. DNA demethylation in the human FOXP3 locus discriminates regulatory T cells from activated FOXP3(+) conventional T cells. European Journal of Immunology. 37, 2378-2389 (2007).
- Yao, Z., et al. Human IL-17: a novel cytokine derived from T cells. Journal of Immunology. 155, 5483-5486 (1995).
- Lockhart, E., Green, A. M., Flynn, J. L. IL-17 production is dominated by gammadelta T cells rather than CD4 T cells during Mycobacterium tuberculosis infection. Journal of Immunology. 177, 4662-4669 (2006).
- Liang, S. C., et al. Interleukin (IL)-22 and IL-17 are coexpressed by Th17 cells and cooperatively enhance expression of antimicrobial peptides. Journal of Experimental Medicine. 203, 2271-2279 (2006).
- Olsen, I., Sollid, L. M. Pitfalls in determining the cytokine profile of human T cells. Journal of Immunological Methods. 390, 106-112 (2013).
