エピジェネティックベースの定量PCRを用いた免疫細胞の同一性と純度の測定

すべてのヒトサンプルは、人間の研究倫理に関するガイドラインに従って商業的な情報源から得られた。 1. ゲノムDNA分離 注:ゲノムDNA単離は、末梢血単核細胞(PBMCs)、精製T細胞、その他の造血細胞型などの造血細胞から市販のキット(材料表を参照)を使用して行われます。本実験では、3種類のヒトドナー由来の末梢血単核細胞(PBMcCs)およびT細胞を用いた。 1-2 x 106造血細胞を円錐形の管に入れ、遠心分離機を400 x gで10分間置きます。 上清を完全に吸引する。 350 μLのリシス/結合バッファーをサンプルに加え、55°Cで10分間インキュベートします。 プロテナーゼK(20 mg/mL)を30秒の細胞懸濁液と渦の350μLに50μL添加します。 50 μLのDNA結合常磁性ビーズと400μLのイソプロパノールを100%イソプロパノールを加え、室温(RT)で3分間インキュベートします。 2分間の磁気ラックにチューブを置き、ビーズを邪魔しないように注意して上清を取り外します。DNAはこのステップで磁気ビーズに結合されます。 950 μLの洗浄バッファ1を加えます。30 sの渦とステップ1.6を繰り返します。 手順 1.7 を繰り返します。 950 μLの洗浄バッファ2を加えます。30 sの渦とステップ1.6を繰り返します。 100 μLの溶出バッファーとボルテックスを2分間マグネットスタンドに1分間置き、gDNAを含む上清を新しいチューブに移します。 造血細胞から分離されたgDNAの1μLを使用して、260nm、280nm、および230nmでODを得ることによってフルオリメーターを用いて分光光測定法によってgDNAの純度を測定します。260 nm と 280 nm の光密度 (OD 比) の比が 1.7 ~ 2.0 で、OD 比が 260 ~ 230 nm の場合は 1.5 ~ 2.4 の間であることを確認します。 2. サンプル調製 サーモミキサーを56°Cに予熱します。 すべてのサンプル、キャリブレーター、および基準材料に対して、ラベル 2 mL チューブ。 サンプルとキャリブレーターを、RTで溶出バッファー(ステップ1で使用するキットで入手可能)で希釈します。 すべての実験サンプルについて、gDNAを142μLの総体積に希釈します。例えば、100 ng/μLで4μLのgDNAを138μLの溶出バッファーに希釈します。注:400-1,200 ng gDNAをアッセイに使用できます。 75 μLのキャリブレーターを総容量142μLに希釈します。 TE (pH = 8.0) をブランクとして使用して、参照 gDNA 濃度を分光光度計で確認します。 基準gDNAの1,000-1,200ngを総体積142μLに希釈します。例えば、100 ng/μLで10μLの参照gDNAを132μLの溶出バッファーに希釈します。 チューブを56°Cで900rpmで5分間、サーモミキサーでインキュベートします。サンプルを収集するためにチューブを簡単にスピンダウンします。 3. 亜硫酸水素変換 注: 亜硫酸塩変換中のインキュベーション時間が推奨時間に従っていることを確認してください。オーバーインキュベーションまたはアンダーインキュベーションは、アッセイの結果に影響を与えます。 サーモミキサーを80°Cにセットします。 270 μLの亜硫酸アンモニウムと90μLのテトラヒドロフルフリルアルコール(THFA)を全てのチューブに加えます。渦は完全に混合し、一時的に下部に液体を集めるためにサンプルをスピンダウンします。 チューブを80°Cで900rpmで45分間サーモミキサーでインキュベートします。ヒートブロックを使用する場合は、インキュベーション中に4.5分ごとに1〜2sのチューブをボルテックスします。 サンプルを簡単にスピンダウンし、ステップ4または5に進む前に3〜5分間RTまで冷却します。最終ボリュームは、500 μL程度にする必要があります。 4. CD8 と Treg アッセイ 亜硫酸水素変換後のDNA精製注:このステップは、亜硫酸水素塩変換DNAに関する市販のDNA精製キット(材料表を参照)を使用して行われます。試薬を使用する前にRTに温めしてください。 精製を開始する前に、30sの渦をボルテックスしてDNA単離常磁性ビーズの均質混合物を作成し、ボトルに記載されている量に従って洗浄バッファーにエタノールとイソプロパノールを加え、ヒートブロックを65°Cに設定します。 RTでは、ステップ3.4から各チューブに870μLのリシス/結合バッファーと105μLのDNA結合常磁性ビーズを加えます。完全に、かつ簡単にチューブをスピンダウンする渦。 完全に混合する2プロパノールと渦の570 μLを加えます。 熱ミキサーまたは標準的な回転ミキサーで50 rpmでRTで7分間のチューブをインキュベートします。 チューブを簡単に回転させます。チューブを磁気ラックに置き、5分間インキュベートします。 サンプルを磁気ラックに置いた状態で、ビーズを邪魔することなく上清を取り外します。注:DNAはビーズに結合されています。 磁気ラックからチューブを取り外し、900 μLの洗浄バッファー 1 を追加します。チューブをボルテックスしてビーズを完全に再サスペンずしてから、チューブを短時間回転させます。 チューブを磁気ラックに戻し、3分間インキュベートします。 サンプルを磁気ラックに置いた状態で、ビーズを邪魔することなく上清を取り外します。 洗浄(4.1.7-4.1.9)を洗浄バッファ1で1回、次に洗浄バッファ2で2回繰り返します。 上清を取り外した後、チューブを少し回転させて3分間磁気ラックに戻します。 残留洗浄バッファー2をすべて取り外し、磁気ラックからチューブを取り外します。 チューブのふたを65°Cで15分間開けてビーズを乾かします。 各チューブに60μLの溶出バッファーを加え、RTで1,400rpmで7分間インキュベートします。あるいは、泡アダプターを使用して適度な速度で渦。 チューブを簡単にスピンダウンし、磁気ラックの上に2分間置きます。 ビーズを邪魔することなく、55 μLの溶出液を新しいチューブに移します。溶出物には、亜硫酸水素酸に変換されたDNAが含まれています。DNA濃度の測定は不要です。 qPCR をセットアップして実行する qPCR マシンと、そのソフトウェアを動作させるコンピューターの電源を入れます。 ソフトウェアのユーザー インターフェイスで、新しい実験を作成し、実験の実行に使用するブロックを選択します。 実験の種類として[標準曲線]を選択します。 該当する場合は、使用する検出化学を選択します。このアッセイは、TaqMan試薬を使用します。それ以外の場合は、パッシブリファレンスとしてROXを選択します。 該当する場合は、計測器実行のプロパティを[標準]として選択します。 ターゲット(例えば、FAMをレポーターとするGAPDHまたはCD8)と非蛍光クエンチャーを割り当てることによって、実験計画を定義します。 標準、サンプル、およびコントロールのサンプル名を割り当てます。 次に、qPCRプレートに従って各ウェル位置を割り当てます。各ウェルには、CD8 や GAPDH などのターゲットとサンプル名が必要です。各サンプルは三重で実行され、器械のための版のレイアウトに反映されなければならない。 各標準を標準タスクに割り当て、表 1に従って最終コピー番号を指定します。 サンプル、キャリブレータを割り当て、タスク[不明]を参照します。 テンプレート コントロールのウェルをNTCまたはNとして指定します。 標準として使用するラムダDNA(10ng/μL)の連続希釈を準備します(表1を参照)。 qPCR マスターミックスカクテルを、ターゲットセルタイプ用とGAPDH用に用意します(表2を参照)。すべてのサンプル、標準、および NTC コントロールを三重に実行します。注意: GAPDH は、セルの総数を定量化するために使用され、ターゲット増幅と並行して実行されます。CD8 B遺伝子の非メチル化調節要素のコピーは、CD8アッセイ、FoxP3でTreg、およびTh17のIL-17で測定される。 qPCR には 96 ウェルプレートを使用します。最初に3 μLのテンプレートDNAを井戸にロードします。次に、マスターミックスの7μLをロードします。 プレートを qPCR フィルムで密封し、プレートを短時間スピンダウンしてから qPCR 装置に入れします。 表 3に示すように qPCR を実行します。 実行の完了後、qPCR データを .txt または .xlsx ファイルとしてエクスポートします。 CD8アッセイの分析テンプレートとTregアッセイ(材料の表を参照)を使用してデータを分析し、Ct平均、Ct標準偏差、コピー数を計算します。 初期プラスミドコピー数/3 μL ボリューム 希釈DNA [1] 最終コピー数/3 μL ラベル 31250 1000 μL – 31250 STD#1 31250 200 μL 800 μL 6250 STD#2 6250 200 μL 800 μL 1250 STD#3 1250 200 μL 800 μL 250 STD#4 250 200 μL 800 μL 50 STD#5 1250 30 μL 1200 μL 30 STD#6 [2] [1] TEの10 ng/μLラムダDNA(10 mMトリス、1 mM EDTA、pH 8.0) [2] STD#3 を使用して STD#6 を準備する 表1:標準的な希釈液の調製。31250-30コピーにまたがる4対4希釈基準は、希釈剤としてTE/λDNAを用いてテーブルに従って調製した。同じ標準希釈液を CD8 と GAPDH の両方に使用しました。標準は-20°Cで保管した。 試薬 量 ラムダDNA(TEで50ng/μL、pH8.0) 1 μL タクマンアッセイ 0.5 μL 水、ヌクレアーゼフリー 0.5 μL マスターミックス 5 μL 合計 7 μL 表2:qPCRカクテルの調製表に従ったテンプレートDNAを除き、CD8とGAPDH用の2つの別々のチューブにqPCRマスターミックスを準備します。 ステップ 時間 温度 サイクル プレインキュベーション 35分 95°C 1X 増幅 15秒 95°C 50倍 1分 61°C クールダウン 5秒 42°C 1X 表3:CD8およびTregアッセイのqPCR実行パラメータqPCR は、表に指定されたパラメーターに従って実行されました。 5. Th17アッセイ 亜硫酸水素変換後のDNA精製 セクション 4.1 に記載されている精製手順を実行します。 サンプルを溶出するには、各チューブに25μLの溶出バッファーを加え、RTで1,400rpmで7分間インキュベートします。あるいは、泡アダプターを使用して適度な速度で渦。 チューブを簡単にスピンダウンし、2分間磁気ラックに置きます。 ビーズを邪魔することなく、20 μLの溶出液を新しいチューブに移します。溶出物には、亜硫酸水素酸に変換されたDNAが含まれています。 DNAのプリアンプ注: DNAのプリアンプは、qPCR19による正確な定量化のために、低い存在量の標的に推奨されます。Th17メチル化アッセイは、この理由のためにプリアンプを必要とするように設計されました。 2 μLの亜硫酸水素変換DNAをPCRストリップチューブに移します。2 μLの水でNTCチューブを作成します。 すべてのサンプルに対してプリアンプマスターミックスを作成します(表4を参照)。 各チューブにマスターミックスを23μL加えます。チューブ、渦をキャップし、チューブを短時間スピンダウンします。 熱い蓋を使用してサーモサイクラーでプリアンププロトコルを実行します。(表 5)。実行が完了したら、チューブを短時間スピンダウンします。 増幅されたDNAの2μLを新しいチューブに移し、78μLの水を加え、サンプルを1:40に希釈します。 qPCR の設定と実行 セクション 4.2 に従って qPCR をセットアップし、実行します。 Th17 アッセイの分析テンプレート(材料の表を参照)を使用してデータを分析し、Ct 平均、Ct 標準偏差、コピー数を計算します。 試薬 量 水、ヌクレアーゼフリー 9.5 μL ホットスタート PCR マスターミックス 12.5 μL Th17 PCR プライマー 1 μL 合計 23 μL 表4:Th17アッセイのDNAを予増幅する。予増幅反応マスターミックスをテーブルに従って調製した。 ステップ 時間 温度 サイクル プレインキュベーション 35分 95°C 1X 変性 1分 95°C 12倍 焼鈍 45秒 55°C 伸長 30秒 72°C 最終伸長 10分 72°C 1X 保持 不定 4°C 表5:Th17 DNAを前駆増幅する。Th17 DNAは、実際のqPCRの前に12サイクル予増幅した。