تحديد هوية الخلية المناعية ونقاوتها باستخدام PCR الكمية اللاجينية
Summary
هنا نصف طريقة قوية لتحديد هوية الخلايا المناعية ونقاوتها من خلال التوقيعات اللاجينية التي تم اكتشافها باستخدام PCR الكمي (qPCR). ديميثيل الحمض النووي في مكان معين بمثابة معرف فريد لنوع خلية معينة ويسمح لتحديد CD8 + ، والخلايا التنظيمية ، أو T Th17.
Abstract
يمكن أن يكون لترددات الخلايا المناعية الفرعية تأثير كبير على فعالية علاجات الخلايا التائية. الأساليب الحالية ، مثل تدفق الخلايا ، لديها متطلبات عينة محددة ، ومدخلات عينة عالية ، هي إنتاجية منخفضة ، ويصعب توحيدها ، وكلها ضارة بتوصيف منتجات العلاج بالخلايا أثناء تطورها و التصنيع.
تحدد الاختبارات الموصوفة هنا بدقة أنواع الخلايا المناعية وقياسها في خليط غير متجانس من الخلايا باستخدام الحمض النووي الجينومي المعزول (gDNA). يتم الكشف عن أنماط ميثيل الحمض النووي من خلال تحويل بيسولفيت ، وهي عملية يتم فيها تحويل السيتوسات غير الميثيلية إلى uracils. يتم الكشف عن مناطق الحمض النووي غير الميثيلية من خلال تضخيم qPCR باستخدام الكبيات التي تستهدف المناطق المحولة. يتم قياس موضع واحد فريد لكل معين ويعمل كمعرف دقيق لنوع خلية معينة. وتتسم الخلايا القوية وتحديد CD8+, الخلايا التنظيمية, وTh17 T بطريقة إنتاجية عالية. يمكن استخدام هذه الاختبارات المحسنة لاختبار الإفراج عن المنتج والعملية في العملية.
Introduction
وقد زاد استخدام الخلايا التائية في العلاج المناعي الخلوي بشكل كبير على مدى العقد الماضي، وخاصة مع ظهور مستقبلات مستضد الشيم (CAR) تكنولوجيا الخلايا التائية1. في حين أن العلاجات القائمة على الخلايا التائية قد قوبلت بنجاح سريري كبير ، إلا أنها غير متجانسة ويمكن أن تختلف خصائص الخلايا والهويات بشكل كبير بين المتبرعين2. يمكن أن يكون لعدم تجانس مجموعات الخلايا التائية آثارًا كبيرة على الفعالية العلاجية وتعقيد الاستنتاجات من التجارب السريرية. لهذا السبب، من الأهمية بمكان فهم ت التائية الخلايا أثناء تصنيع المنتج وصياغة لتحديد التركيبات المثلى من العلاجات المناعية الخلايا التائية.
بالمعنى الواسع ، يمكن تقسيم الخلايا التائية إلى مجموعتين: خلايا CD4 + المساعد T ، التي تفرز السيتوكينات المناعية ، وخلايا CD8 + T السامة للخلايا ، والتي تقدم مباشرة خلايا الليسية التي تقدم مستضد الكونسعلى مجمع التوافق الهيستواني الرئيسي (MHC) الجزيئات I. CD4 + المساعد T الخلايا يمكن أن تفرق في عدد لا يحصى من مجموعات فرعية محددة التي تنتج مجموعة فريدة من السيتوكينات. يقترح البعض أن نسبة محددة من CD4 + إلى CD8 + T الخلايا في المنتج الخلية النهائية تعظيم في فعالية vivo والمثابرة ولكن يمكن أن تعقد تصنيع الخلايا3. الخلايا التائية التنظيمية (Tregs) ، وهي مجموعة فرعية من خلايا CD4 + T ، هي مثبطة للمناعة وتقلل من تنشيط الخلايا المناعية. وقد تورطت الخلايا T التنظيمية في التوسط التسامح الورم، وإذا كان موجودا خلال تصنيع خلايا T CAR، يمكن أن تمنع الاستجابة المناعية المضادة للورم من خلايا Car T4،5،6. مجموعات فرعية أخرى CD4 + مثل T المساعد 17 (Th17) الخلايا التائية تعزيز إزالة الورم ويمكن الاستفادة منها لزيادة فعالية العلاجات الخلايا التائية. وهكذا، زيادة Th17 CD4 + الخلايا التائية هي ذات أهمية خاصة في إعدادات الورم الصلبة حيث زيادة إنتاج إنترلوكين 17 (IL-17) يعزز الاستجابة المناعية المضادة للورم5،7،8،9. وقد أدى فهم أهمية خلايا Th17 في استجابات الورم إلى مزيد من التحقيق في استراتيجيات توليد هذه الخلايا في المختبر7،9. ولذلك، فإن أساليب الكشف عن هذه المجموعات الفرعية للخلايا التائية حاسمة لتحسين علاجات الخلايا التائية ويجب أن تكون قوية وسهلة وقابلة للتطوير وقابلة للاستنساخ.
قياس التدفق الخلوي هو الطريقة الأكثر شيوعًا لتحديد هوية الخلية المناعية. ومع ذلك، يتطلب قياس الخلايا تدفق حية، والخلايا السليمة التي يجب تحليلها في نفس اليوم يتم حصادها. لتلطيخ السيتوكين داخل الخلايا (ICS), مطلوب تثبيط إفراز البروتين للاحتفاظ السيتوكينات داخل الخلايا التائية. ومع ذلك، مركبات مثبطة مختلفة لها آثار تفاضلية على إفراز السيتوكينات محددة، مما اضطر المستخدمين إلى إنشاء الكوكتيلات المتخصصة للكشف عن السيتوكين من الفائدة10،11. بالإضافة إلى ذلك ، يعتمد إخلاص قياس التدفق الخلوي على مستنسخات الأجسام المضادة التي ترتبط بشكل محدد وقوي بهدفها. استخدام الأجسام المضادة المستنسخة المختلفة يمكن أن يسبب نتائج متفاوتة ويؤدي إلى استنتاجات غير دقيقة، مما يجعل من الصعب لتوحيد طريقة12. علاوة على ذلك ، يمكن أن يختلف تحليل البيانات التي تم جمعها عبر قياس التدفق الخلوي ، وبالتالي الاستنتاجات المستخلصة من البيانات ، بشكل كبير بين المستخدمين استنادًا إلى كيفية تعيين البوابات13،14. لهذه الأسباب، والتدفق الخلوي ليست مثالية لمراقبة الجودة الدقيقة أثناء تطوير العلاج بالخلايا.
تقييم المثيل الجيني في موضع جين معين هو طريقة بديلة لتحديد هوية الخلية. وقد تم وصف الأساس المنطقي لاستخدام ميثيل الحمض النووي لتحديد أنواع معينة من الخلايا في مواد متعددة ويعتمد على أنماط مثيلة محددة موجودة في مجموعة خلايا معينة15،16،17. وفي الخلايا المستهدفة، تحتوي بعض المواقع على نيوكليوتيدات غير ميثيلية، بينما في الخلايا غير المستهدفة تكون هذه المواقع مُبتيَّدة. يمكن الكشف عن هذا النمط من خلال تحويل بيسولفيت، وهي عملية تحول حصرا النيوكليوتيدات السيتوسين غير الميثيلية (C) إلى uracil (U). يمكن تصميم الكبيات والمسابير ضد المواقع المحولة ، ثم تضخيمها واكتشافها من خلال qPCR16.
يقيس المقاسير الموصوف هنا تواتر الأنواع الفرعية للخلايا المناعية ضمن مجموعات غير متجانسة من خلال تحديد عدد loci غير الميثيلي المحدد مقارنة بجين التدبير المنزلي. يتم قياس نسخ من العناصر التنظيمية غير المثيلة لجين CD8 B في اختبار CD8، FoxP3 في Treg، وIL-17 في Th17 في هذا التنظير. تم تحديد هذه loci عن طريق عزل مجموعة الخلايا المحددة ذات الأهمية (على سبيل المثال ، خلايا CD8 + T) وأداء تسلسل bisulfite لتحديد loci التي لا ميثيلها في نوع الخلية15فقط . يتم تطوير الكبيات والمسابير ضد loci غير الميثيلية بشكل فريد ويتم تحليل العينات عبر qPCR. يتم إنشاء منحنى قياسي من أرقام النسخ المعروفة من تخفيف اتّفاقات عدد النسخ العالي بلازميد قياسي، مما يسمح بتحويل قيمة Ct إلى رقم نسخة.
لتقييم أداء العينات، يلزم أخذ عينات من التحكم، بما في ذلك gDNA المرجعية وبلازميد المعايرة. المواد الجينومية المرجعية هي عينة دم مجمعة من متبرعين متعددين بترددات معروفة للخلايا المناعية وتستخدم لفحص أداء فحص قياس الجودة (QC). عينة المعايرة هي البلازميد المركبة التي تحتوي على تسلسل الجينات CD8، FoxP3، وGAPDH في نسبة متساوي. يتم استخدامه كمقياس لكفاءة تحويل البيسولفيت ، لأن تحويلات البيسوفيت داخل مناطق الجينوم المختلفة ستختلف في الكفاءة. نسبة الهدف إلى GAPDH داخل المعايرة هي 1 ، ولكن بسبب الاختلافات في كفاءة تحويل bisulfite ، يمكن أن تختلف النسبة. يتم تطبيق عامل المعايرة هذا على مقالات CD8 و Treg. يقع FoxP3، الجين المستخدم في اختبار Treg، على كروموسوم X. لأن هذا الفحص يقيس فقط نسخ غير ميثيلية من FoxP3، ونسخة واحدة فقط من FoxP3 غير ميثيلية في Tregs، وهذا الفحص هو لاأدري الجنس ويمكن استخدامها مع كل من الذكور والإناث عينات18. لا تستخدم عينة Th17 عينة معايرة أو GAPDH كجين التدبير المنزلي. وبدلاً من ذلك، يتم تضمين مجموعة التمهيدي ة الأخرى التي تستهدف loci الميثيلية الموجودة في الخلايا غير Th17 وينعكس العدد الإجمالي للخلايا من خلال مجموع نسخ ميثيلوغير ميثيلمن IL-17. يتم إدخال البيانات التي تم الحصول عليها من qPCR في قالب تحليل محدد مسبقًا يقوم بإجراء فحوصات مراقبة الجودة على البيانات وحساب النسبة المئوية للخلية المستهدفة ضمن مجموعة البداية. وهذا يوفر تحليل البيانات الآلي وغير المتحيزة، وبالتالي إزالة ذاتية المستخدم وتحسين قدرات التوحيد القياسي.
يستخدم هذا الفحص gDNA ، والذي يمكن عزله عن طريق إجراء leukapheresis باستخدام خلايا مستزرعة أو ثابتة ، أو كريات الخلايا المجمدة. متطلبات عينة منخفضة، والمرونة في عينة المواد بدءا، ودقة عالية، وتحليل موحد معالجة القيود المرتبطة بتدفق الخلايا وهي مثالية لأغراض مراقبة الجودة أثناء تطوير عملية العلاج بالخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
مع ظهور علاجات مناعية جديدة ، هناك حاجة إلى طرق موحدة للكشف عن هوية الخلايا المناعية ونقاوتها. ولا تزال أساليب التقييم لاختبار الاختبارات العملية واختبارات الإطلاق القوية والمعتمدة والقابلة للتطوير قائمة وتطرح تحدياً كبيراً لتسويق العلاجات القائمة على الخلايا. في حين أن قياس التدفق الخلوي هو حاليا الطريقة الأكثر شيوعا لفينوبتيب الخلايا المناعية، وارتفاع نوعية العينة ومتطلبات الكمية تجعل من الصعب للاستخدام المنتظم. علاوة على ذلك ، يتم تقييد تنفيذ قياس التدفق الخلوي في بيئة ممارسة التصنيع الجيدة (GMP) من خلال استراتيجيات الجاتينغ المعتمدة على المشغل ومتطلبات المعايير المرجعية لكل علامة تستخدم13،14. وعلى الرغم من أن الجاتينغ الآلي قد ثبت أنه يحسن متانة الاختبارات، فإنه ليس بعد استراتيجية راسخة لمراقبة الجودة. في حين يمكن أيضا أن تستخدم التنميط التعبير الجيني لتوصيف هوية المنتج العلاج الخلوي والنقاء، والبيانات هي شبه كمية وكثيفة العمالة. بالإضافة إلى ذلك، الحمض النووي الريبي والحمض النووي الريبي هي أقل استقرارا نسبيا من الحمض النووي ويمكن أن تسهم في عدم وجود نتائج قوية وقابلة للاستنساخ. وهكذا، فإن استخدام حالة ميثيل الحمض النووي اللاجيني لموضع معين يوفر طريقة مستقرة وسهلة الأداء وقوية وقابلة للتطوير لتحديد وتحديد نوع الخلية من الفائدة.
يعتمد الكشف عن أنماط الميثيل في الخلايا النمط الظاهري على ثلاث خطوات حاسمة: أولاً ، يتطلب إجراء فحص استخدام gDNA ، المعزول وفقًا للطرق الموصوفة. مطلوب الحمض النووي عالية الجودة وإذا لم تستخدم، قد تتأثر تحويل bisulfite23،24. إذا تم الحصول على الحمض النووي منخفض الجودة، يوصى بمزيد من التنقية لضمان موثوقية العينات. ثانيا، مطلوب نجاح تحويل بيسولفيت من السيتوزين غير ميثيلإلى uracil. الخطوة الأكثر أهمية في تحويل bisulfite هو تسخ الحمض النووي23،25. ارتفاع درجة الحرارة التهيئة باستخدام bisulfite الأمونيوم، بدلا من بيسولفيت الصوديوم، ويزيد من كفاءة التحويل والاتساق وهي العملية الموصى بها لهذه المقالات25،26. يجب على المستخدمين التأكد من أن التفاعل يحدث في 80 درجة مئوية وأن يتم خلط العينة بشكل متكرر. لهذه الأسباب ، يوصى بخلاط حراري رقمي (انظر جدول المواد). ثالثا، يجب اتباع تقنية الأنابيب السليمة أثناء إعداد qPCR. هناك حاجة إلى ثلاثة تكرار التقنية خلال رد فعل qPCR للتقيد بالحد الأدنى من المعلومات لنشر التجارب الكمية في الوقت الحقيقي PCR (MIQE) المبادئ التوجيهية27. وإدراج المزيد من اليكررات التقنية أمر مقبول ولكنه غير مطلوب. تقنية الأنابيب غير صحيح و / أو لا بما في ذلك يكرر التقنية سيؤدي إلى نتائج qPCR لا يمكن الاعتماد عليها.
إذا تم اتباع الخطوات الهامة ولم يتم الحصول على النتائج المرجوة بعد، يمكن الاستفادة من عناصر تحكم متعددة داخل الفحص لتحديد المشكلة. تحويل bisulfite السليم هو الخطوة الأكثر أهمية في هذا المنقّع. سيتم تمييز تحويل bisulfite غير السليم بواسطة عامل معايرة فاشل و/أو قيم مرجعية محسوبة بواسطة قالب التحليل. إذا تم إجراء تحويل bisulfite بشكل غير صحيح (على سبيل المثال، إذا تم تنفيذ رد الفعل في RT)، فلن يكون هناك أي تضخيم أثناء qPCR. أيضا، لن ينظر إلى أي تضخيم إذا تم إجراء خطأ أثناء إعداد رد فعل qPCR (على سبيل المثال، إذا لم تتم إضافة المزيج الرئيسي qPCR). يمكن فصل هاتين المسألتين عن طريق التحقيق في العينات القياسية. التضخيم في العينات القياسية، ولكن ليس العينات المرجعية والمعايرة والتجريبية، يشير إلى أن تحويل البيسولفيت لم يتم بشكل صحيح. لا يوجد تضخيم في أي من العينات تشير إلى أن qPCR لم يتم تنفيذها بشكل صحيح.
في حين أن هذا التحليل يتناول متطلبات العينة الصارمة وتباين التحليل المرتبط بأساليب الفينوبة الأخرى ، وتحديداً قياس التدفق الخلوي ، هناك قيود يجب ملاحظتها. يستهدف هذا الاسبلي موضع واحد يستخدم كمعرف فريد للخلية المستهدفة، والذي يحظر التحليل متعدد المضاعف الذي يتم تنفيذه بشكل شائع مع قياس التدفق الخلوي. وهذا يجعل تحديد أنواع الخلايا المعقدة مثل Th17 صعبة. ومع ذلك ، فقد ثبت أن استخدام أنماط الميثيل في مكان واحد علامة دقيقة لخلايا متعددة وقد استخدم في تجارب سريرية متعددة15،16. هذا صحيح خاصة في Tregs حيث تقييم FOXP3 التوقيعات الميثيل هو وسيلة دقيقة ولا لبس فيها للكشف عن Tregs صحيح من الخلايا عبر FOXP3 عابرة28. يتم تعويض فقدان التحليل المتعدد من خلال دقة loci التي تم استجوابها. يمكن أن تتضمن التكرارات المستقبلية للالمقايسة أصباغ qPCR متعددة وquenchers للسماح بالكشف عن loci متعددة في رد فعل واحد qPCR.
ويمكن استخدام هذا الفحص كطريقة بديلة للتدفق الخلوي في تحديد النمط الظاهري للخلية والهوية. تجدر الإشارة إلى أن هذا الخضوع لا ينتج القيم الدقيقة التي تدفق cytometry لا(الأشكال 1-3). ويرجع ذلك جزئيا إلى تباين تحليل البيانات المرتبط بقياس التدفق الخلوي. اعتمادا على استراتيجية الجاتينغ، يمكن أن تختلف النتائج من تدفق الخلايا بشكل كبير. هذا هو الحال بشكل خاص عند استخدام بروتوكولات تلطيخ معقدة للنظر في الأهداف داخل الخلايا ، مثل IL-17 ، حيث يمكن أن يصل معامل الاختلاف (CV) إلى 15٪14. بين العديد من المستخدمين ، وكان على النحو الثابت في إجراء عملية تقييم السيرة الذاتية من <15 ٪، مما يدعم متانة من قُدم وتحسين قدرات التوحيد القياسي. وينظر إلى أكبر الاختلافات بين اللاجينية وتدفق الخلايا القائم على phenotyping عندما يكون مطلوبا تحفيز الخلية(الشكل 3). تم إنجاز الكشف عن خلايا Th17 عبر قياس التدفق الخلوي باستخدام بروتوكول مشترك لتحفيز الخلايا التائية وتلطيخ الخلايا الخلوية29،30،31. يمكن أن تكون الاختلافات التي شوهدت في Th17 فينوبتيبينت بين القياس اللاجيني وقياس التدفق الخلوي بسبب حركية إنتاج IL-17. في حين أن توقيعات الميثيل ثابتة ، فإن إنتاج البروتين يستغرق وقتًا ويجب أن يكون موجودًا بكميات كافية ليتم اكتشافها بواسطة الأجسام المضادة الفلورية20،32. قد تحتاج الحضانة 6 h مع مثبط نقل البروتين وكوكتيل تحفيز الخلايا إلى توسيع هاوية لمعرفة مستوى خلايا Th17 التي تم اكتشافها عبر طرق الفينوتيكلالالجينية. هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتحديد السبب الدقيق لعدم تطابق القيم وتحديد طريقة الفينوبة الأكثر دقة.
في هذا التقرير، نفصّل كيفية تحديد أنواع الخلايا المناعية وقياسها في خليط غير متجانس من الخلايا بطريقة بسيطة وقوية. تم تصميم وتحسين الاختبارات للاستخدام المحتمل في العملية واختبار الإفراج عن العلاجات القائمة على الخلايا. وتستوفي المقالات الموصوفة متطلبات استخدام المواد الخام المؤهلة تأهيلاعاليا في تطبيقات العلاج الخلوي. من خلال معالجة أوجه القصور في قياس التدفق الخلوي والأساليب الجزيئية الأخرى مثل الاستقرار ومتطلبات العينة والتحفيز المسبق وpermeabilization الخلوية للتلطيخ داخل الخلايا ، وموضوعية تحليل البيانات ، فإن الاختبارات الموصوفة في الخط مع أهداف تسويق العلاجات القائمة على الخلايا.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل المشروع من منحة Thermo Fisher العلمية الداخلية.
Materials
| 2.0 ml Eppendorf Safe-Lock Tubes | Eppendorf | 22363344 | |
| Analysis template for CD8 assay | Click Here | ||
| Analysis template for Th17 assay | Click Here | ||
| Analysis template for Treg assay | Click Here | ||
| Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer, blue/red/violet6/yellow | Thermo Fisher Scientific | A29004 | |
| CTS PureQuant CD8+ T-Cell Assay | Thermo Fisher Scientific | A43674 | |
| CTS PureQuant Th17 Assay | Thermo Fisher Scientific | A43676 | |
| CTS PureQuant Treg Assay | Thermo Fisher Scientific | A43675 | |
| Dynabeads SILANE Genomic DNA Kit | Thermo Fisher Scientific | 37012D | Used for genomic DNA isolation and purification after bisulfite conversion. Contains elution buffer to dilute samples. |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Used as a magnetic rack during DNA isolation and purification |
| eBioscience Essential Human T cell Phenotyping Kit | Thermo Fisher Scientific | A42923 | |
| eBioscience Essential Human Th1/Th17 Phenotyping Kit | Thermo Fisher Scientific | A42927 | |
| eBioscience Essential Human Treg Phenotyping Kit | Thermo Fisher Scientific | A42925 | |
| Eppendorf SmartBlock 2 mL | Eppendorf | 5362000035 | |
| Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
| HulaMixer Sample Mixer | Thermo Fisher Scientific | 15920D | Recommended sample mixer |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ND 1000 | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | Applied Biosystems | AM12450 | |
| QuantStudio 12S Flex | Applied Biosystems | 4470661 | |
| TE, pH 8.0, RNase-free | Thermo Fisher Scientific | AM9849 | |
| Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | H2KT17113 |
References
- Hartmann, J., Schüßler-Lenz, M., Bondanza, A., Buchholz, C. J. Clinical development of CAR T cells-challenges and opportunities in translating innovative treatment concepts. EMBO Molecular Medicine. 9, 1183-1197 (2017).
- Graham, C., Jozwik, A., Pepper, A., Benjamin, R. Allogeneic CAR-T Cells: More than Ease of Access?. Cells. 7, E155 (2018).
- Turtle, C. J., et al. CD19 CAR-T cells of defined CD4+:CD8+ composition in adult B cell ALL patients. Journal of Clinical Investigation. 126, 2123-2138 (2016).
- Akalin, I., et al. Effects of Chimeric Antigen Receptor (CAR) Expression on Regulatory T Cells. Molecular Therapy. 17, S25 (2009).
- Knochelmann, H. M., et al. CAR T Cells in Solid Tumors: Blueprints for Building Effective Therapies. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
- Chen, M. L., et al. Regulatory T cells suppress tumor-specific CD8 T cell cytotoxicity through TGF-β signals in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102, 419-424 (2005).
- Muranski, P., et al. Tumor-specific Th17-polarized cells eradicate large established melanoma. Blood. 112, 362-373 (2008).
- Majchrzak, K., et al. Exploiting IL-17-producing CD4+ and CD8+ T cells to improve cancer immunotherapy in the clinic. Cancer Immunology, Immunotherapy. 65, 247-259 (2016).
- Guedan, S., et al. ICOS-based chimeric antigen receptors program bipolar TH17/TH1 cells. Blood. 124, 1070-1080 (2014).
- Vicetti Miguel, R. D., Maryak, S. A., Cherpes, T. L. Brefeldin A, but not monensin, enables flow cytometric detection of interleukin-4 within peripheral T cells responding to ex vivo stimulation with Chlamydia trachomatis. Journal of Immunological Methods. 384, 191-195 (2012).
- Lovelace, P., Maecker, H. T. Multiparameter Intracellular Cytokine Staining. Methods in Molecular Biology. 699, 165-178 (2011).
- Presicce, P., Moreno-Fernandez, M. E., Lages, C. S., Orsborn, K. I., Chougnet, C. A. Association of two clones allows for optimal detection of human FOXP3. Cytometry A. 77, 571-579 (2010).
- Pachón, G., Caragol, I., Petriz, J. Subjectivity and flow cytometric variability. Nature Reviews Immunology. 12, 396 (2012).
- Westera, L., et al. Centrally Determined Standardization of Flow Cytometry Methods Reduces Interlaboratory Variation in a Prospective Multicenter Study. Clinical and Translational Gastroenterology. 8, e126 (2017).
- Baron, U., et al. Epigenetic immune cell counting in human blood samples for immunodiagnostics. Science Translational Medicine. 10, (2018).
- Kleen, T. O., Yuan, J. Quantitative real-time PCR assisted cell counting (qPACC) for epigenetic – based immune cell quantification in blood and tissue. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3, 46 (2015).
- Rapko, S., et al. DNA methylation analysis as novel tool for quality control in regenerative medicine. Tissue Engineering. 13, 2271-2280 (2007).
- Wieczorek, G., et al. Quantitative DNA Methylation Analysis of FOXP3 as a New Method for Counting Regulatory T Cells in Peripheral Blood and Solid Tissue. Cancer Research. 69, 599-608 (2009).
- Andersson, D., et al. Properties of targeted preamplification in DNA and cDNA quantification. Expert Review of Molecular Diagnosis. 15, 1085-1100 (2015).
- Jung, T., Schauer, U., Heusser, C., Neumann, C., Rieger, C. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 159, 197-207 (1993).
- Armbruster, D. A., Pry, T. Limit of Blank, Limit of Detection and Limit of Quantitation. Clinical Biochemistry Reviews. 29, S49-S52 (2008).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55, 611-622 (2009).
- Li, Y., Tollefsbol, T. O. DNA methylation detection: Bisulfite genomic sequencing analysis. Methods in Molecular Biology. 791, 11-21 (2011).
- Warnecke, P. M., et al. Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing. Methods. 27, 101-107 (2002).
- Genereux, D. P., Johnson, W. C., Burden, A. F., Stöger, R., Laird, C. D. Errors in the bisulfite conversion of DNA: modulating inappropriate- and failed-conversion frequencies. Nucleic Acids Research. 36, e150 (2008).
- Darst, R. P., Pardo, C. E., Ai, L., Brown, K. D., Kladde, M. P. Bisulfite Sequencing of DNA. Current Protocols in Molecular Biology. 91, 7.9.1-7.9.7 (2010).
- Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines. Methods. 50, S1-S5 (2010).
- Baron, U., et al. DNA demethylation in the human FOXP3 locus discriminates regulatory T cells from activated FOXP3(+) conventional T cells. European Journal of Immunology. 37, 2378-2389 (2007).
- Yao, Z., et al. Human IL-17: a novel cytokine derived from T cells. Journal of Immunology. 155, 5483-5486 (1995).
- Lockhart, E., Green, A. M., Flynn, J. L. IL-17 production is dominated by gammadelta T cells rather than CD4 T cells during Mycobacterium tuberculosis infection. Journal of Immunology. 177, 4662-4669 (2006).
- Liang, S. C., et al. Interleukin (IL)-22 and IL-17 are coexpressed by Th17 cells and cooperatively enhance expression of antimicrobial peptides. Journal of Experimental Medicine. 203, 2271-2279 (2006).
- Olsen, I., Sollid, L. M. Pitfalls in determining the cytokine profile of human T cells. Journal of Immunological Methods. 390, 106-112 (2013).
