Un test di tubercolosi a carico batterico molecolare (TB-MBLA)
Summary
Descriviamo un test di analisi del carico batterico molecolare della tubercolosi eseguito dopo l’inattivazione termica dell’espettorato. L’inattivazione del calore rende non infettivi i campioni di sputum e ovvia la necessità di laboratori di livello di contenimento 3 per i test molecolari della tubercolosi.
Abstract
La tubercolosi è causata dalla mitologia Mycobacterium (Mtb), un agente patogeno classificato dalle Nazioni Unite (ONU) come una sostanza biologica pericolosa di categoria B. Per motivi di sicurezza dei lavoratori, la movimentazione di tutti i campioni che si presume portino Mtb deve essere effettuata in un laboratorio a livello di contenimento (CL) 3. Il test TB Molecular bacterial load assay (TB-MBLA) è un test inverso di reazione a catena quantitativa polimerasi (RT-qPCR) che quantifica il carico battericolare Mtb utilizzando primer e sonde a doppia etichetta per 16S rRNA. Descriviamo l’uso dell’inattivazione termica per rendere i campioni di TB non infettivi preservando l’RNA per il TB-MBLA. Una aliquota di 1 mL del campione di espettorato in tubi di centrifuga da 15 mL ben chiusi viene bollita per 20 minuti a 80 , 85 o 95 gradi centigradi per inattivare i bacilli Mtb. La coltivazione del calore inattivato e il controllo (vivi) dei campioni per 42 giorni hanno confermato la morte della TB. Il campione inattivato viene quindi riempito con 100 l del controllo di estrazione e l’RNA viene estratto seguendo la procedura standard di isolamento dell’RNA. Non è stata osservata alcuna crescita nelle colture di campioni trattati con calore. L’RNA isolato è sottoposto a RT-qPCR in tempo reale, che amplifica un bersaglio specifico nel gene RRNA Mtb 16S, producendo risultati sotto forma di cicli di quantificazione (Cq). Una curva standard viene utilizzata per tradurre Cq in carico batterico, o unità formanti colonie stimate per mL (eCFU/mL). C’è una relazione inversa tra Cq e il carico batterico di un campione. La limitazione è che la disattivazione del calore lisce alcune cellule, esponendo l’RNA a RNaes che causano una perdita di <1 log10eCFU/mL (vale a dire, <10 CFU/mL). Ulteriori studi determineranno la percentuale di pazienti a basso carico di lavoro che causano falsi risultati negativi a causa dell'inattivazione di calore.
Introduction
Causato da Mycobacterium tuberculosis (Mtb), oltre 7 x 106 nuovi casi di tubercolosi (TB) sono segnalati a livello globale di cui oltre 1 x 106 muoiono all’anno1,2. Per invertire la tendenza, l’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) ha lanciato un approccio a tre pilastri, tra cui lo sviluppo di efficaci strumenti diagnostici e terapeutici3. Classificata come una pericolosa sostanza biologica B dall’ONU, lavorare con campioni presunti positivi per Mtb richiede un livello di contenimento (CL) di 3. I laboratori CL3 sono costosi da costruire e mantenere. Di conseguenza, la maggior parte dei paesi dispone di servizi di cultura della TB centralizzati a livello regionale o nazionale. Ciò significa che la microscopia striscio è lo strumento diagnostico più disponibile nelle strutture sanitarie periferiche.
L’OMS ha approvato l’attuazione di test molecolari rapidi come Xpert MTB/RIF alle strutture sanitarie di livello 4, per lo più situate ai livelli distrettuali4,5. Alcuni distretti sono piuttosto grandi e meno accessibili ad alcune persone. Pur è vantaggioso, Xpert MTB/RIF funziona rilevando il DNA Mtb. Il DNA è una molecola stabile che sopravvive a lungo dopo la morte delle cellule e quindi non è un buon standard per misurare le cellule vitali critiche per monitorare la risposta al trattamento5,6. I saggi basati sull’RNA offrono un’alternativa per la misurazione accurata delle cellule vitali7,8,9,10,11,12,13. L’RNA esiste in diverse specie di stabilità variabile: RNA ribosomico (rRNA), RNA di trasferimento (tRNA) e RNA messaggero (mRNA). L’RNA messaggero è associato all’espressione genica e quindi il più strettamente associato all’attività cellulare e alla vitalità14. È importante notare che l’assenza di espressione genica non è equivalente alla morte cellulare perché patogeni come Mtb sono noti per esistere in stati inattivi (domeggiati) ma vitali15,16. Le specie di RNA stabili come l’rRNA sono quindi marcatori migliori di stati attivi e inattivi di cellule vitali.
Utilizzando Escherichia coli, Sheridan ha mostrato che 16S rRNA proporzionalmente aumentato con la crescita batterica misurata da unità formanti colonia (CFU) conta17. C’è stato un calo simultaneo nei conteggi di CFU e 16S rRNA quando i batteri E. coli sono stati esposti agli antibiotici. Il calo dell’rRNA dopo la morte cellulare è stato un indicatore che potrebbe essere utilizzato come marcatore per la vitalità cellulare13,17. Attingendo a questo principio, il test del carico batterico molecolare della TB (TB-MBLA) è stato sviluppato per prendere di mira M. tuberculosis 16S rRNA per misurare il carico batterico TB vitale come marcatore della risposta al trattamento per i pazienti con terapia anti-TB11,18,19. Abbiamo ulteriormente sviluppato e ottimizzato il TB-MBLA per incorporare un controllo di estrazione cellulare che riflette la lisi di M. tuberculosis bacilli ed è robusto in diverse impostazioni ambientali20. La procedura TB-MBLA richiede che i primi passi di isolamento dell’RNA da Mtb siano condotti in un laboratorio CL3 fino a quando le cellule Mtb non sono completamente lisminate per garantire la sicurezza dei lavoratori. Esso comprende anche la conservazione del campione per l’analisi retrospettiva in lotti a zero sotto la guanidina, una sostanza tossica di livello 4. A tal fine, abbiamo usato il calore per inattivare Mtb e rendere sicuri i campioni per TB-MBLA da eseguire nei laboratori a livello di microscopia spalmata.
L’uso del calore in laboratorio e applicazioni cliniche è stato intorno per secoli21,22. Tuttavia, alcuni microrganismi come Mtb sono difficili da uccidere, e l’esposizione più breve al calore è insufficiente per uccidere tutte le cellule23,24. Uno studio ha rivelato che il riscaldamento di 20 min di colture di TB a 80 gradi centigradi ha ucciso tutti i bacilli Mtb senza distruggere il DNA necessario per PCR25. Successivamente, un certo numero di tecniche di estrazione del DNA di laboratorio attualmente riscaldano a 95 gradi centigradi. Abbiamo applicato lo stesso principio per dimostrare che l’ebollizione di campioni di TB a 80 gradi centigradi, 85 gradi centigradi o 95 gradi centigradi inattiva Mtb preservando l’RNA sufficiente per la TB-MBLA da eseguire. La coltura inattivata o l’espettorato possono essere mantenuti in contenitori strettamente chiusi a temperatura ambiente o refrigerati per 7 giorni senza ridurre la quantità di rRNA quantificabile.
Il TB-MBLA, attualmente utilizzato come test di solo uso di ricerca (RUO) è adattabile ed è stato applicato a diversi tipi di campione tra cui espettorato, tessuto polmonare, e fluido spinale cerebrale. Deve ancora essere applicato sul liquido alveolar bronchiale, sangue, e altri tipi di campioni. Utilizzando l’espettorato come campione, i risultati della valutazione multisito in Africa (dati inediti) e le pubblicazioni precedenti18,26 mostrano che la sensibilità di MBLA è coerente con mycobacterium crescita indicatore di cultura del tubo (MGIT) coltura liquida. Tuttavia, TB-MBLA è più veloce, dando risultati in ore al contrario di giorni o settimane di cultura, specifici, non colpiti da microrganismi non TB nel campione, e dà una misura quantitativa della gravità della malattia. L’OMS ha recentemente riconosciuto TB-MBLA come candidato per sostituire la microscopia e la coltura dello striscio per il monitoraggio del trattamento della TB2.
In questo articolo descriviamo in dettaglio l’inattivazione del calore e il protocollo TB-MBLA pubblicati in Sabiiti et al.27. Questo protocollo dettagliato fornirà una risorsa visiva one-stop per gli utenti TB-MBLA in tutto il mondo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo articolo mostra che il trattamento termico per 20 minuti a 80 gradi centigradi, 85 gradi centigradi e 95 gradi di tubercolosi inattiva efficacemente i campioni di tubercolosi, rendendo possibile l’esecuzione di TB-MBLA in un impianto non CL3 senza rischio di infezione per i lavoratori di laboratorio. I risultati confermano le osservazioni fatte in studi precedenti, mentre in contrasto con alcune sull’efficacia dell’inattivazione del calore di Mtb25,30. Per esempio, alcuni rapporti indicano che il riscaldamento a 80 gradi centigradi non è efficace su campioni di carico ad alta bacillari25,31,32,33. L’effetto inoculum ad alta densità è stato evitato nel nostro studio assicurando che tutti l’espettorato e le colture pure fossero riscaldate a un volume da 1 mL per tubo di centrifugazione da 15 mL fornendo spazio adeguato per esporre ogni parte del campione all’ebollizione27.
La conservazione dell’RNA in seguito all’inattivazione del calore rende possibile l’esecuzione di TB-MBLA. Questa scoperta concorda con due studi che hanno dimostrato la conservazione dell’RNA dopo l’inattivazione del calore12,34. Abbiamo dimostrato che l’RNA nei campioni inattivati dal calore è stabile a 37 gradi centigradi per 4 giorni, il che implica che i laboratori potrebbero fare test in batch mantenendo i campioni inattivati a temperatura ambiente per una settimana. Applicando kit di estrazione dell’RNA che richiedono refrigerazione o congelamento, la capacità di mantenere i campioni inattivati dal calore a temperatura ambiente elimina la necessità sia della catena del freddo che dei laboratori di categoria 3 per eseguire TB-MBLA in ambienti con risorse limitate.
Il carico batterico di 1log è stato perso usando il rRNA 16S come marcatore. Anche se c’era una differenza tra campione inattivato dal vivo e calore, la quantità persa per inattivazione del calore è troppo piccola per compromettere i risultati a valle. L’aumento della temperatura non ha aumentato la quantità di RNA perso, il che implica che la perdita osservata è indipendente dal trattamento termico. Il trattamento termico ad alte temperature causa molto probabilmente la lisi cellulare, esponendo l’RNA alla degradazione da parte di RNases. Infatti, l’aggiunta esogena di RNase A alla frazione inattivata dal calore ha aumentato il tasso di degradazione dell’RNA. L’ebollizione non ha ridotto l’attività di RNase, il che implica che si tratta di una proteina molto resistente.
È importante notare che una degradazione media dell’RNA di 1,5 log10 eCFU/mL non è una grande perdita. A tal fine si ipotizza che il riscaldamento lisi una piccola parte di Mtb bacilli, esponendo così una piccola quantità di RNA a RNase. Utilizzando TEM abbiamo dimostrato che la morfologia e l’integrità delle pareti cellulari delle cellule Mtb non sono influenzate dal riscaldamento a 95 gradi centigradi. Ciò significa che può richiedere vari fattori fisiologici e un apporto sufficiente di RNasi come nell’ospite per degradare significativamente L’RNA35,36. Inoltre, essendo un ribosoma strutturale, 16S rRNA è potenzialmente meno suscettibile a RNase37,38. Una singola cella Mtb contiene 700 ribosomi/0,1 mm3 di citoplasma37, il che implica che ci sono maggiori quantità di rRNA per cellula. Pertanto, piccole quantità di RNase possono avere un impatto minore38. L’esistenza di un elevato numero di ribosomi dà un vantaggio alla TB-MBLA in termini di sensibilità e capacità di rilevare i pazienti a basso carico di lavoro.
C’era una forte correlazione tra il carico batterico misurato da TB-MBLA e MGIT culture TTP. Questo conferma il carico batterico come motore della positività culturale in una certa misura. Tuttavia, il vantaggio di TB-MBLA è che quantifica direttamente il carico di bacchezza presente nel campione e non richiede la proliferazione delle cellule Mtb prima del rilevamento. Questo contrasta con la cultura il cui tempo di positività dipende dal livello di carico batterico e dalla velocità di proliferazione cellulare Mtb. Studi futuri valuteranno il flusso di lavoro TB-MBLA, inclusa l’inattivazione del calore, in ambienti clinici di routine. Lo studio esplorerà anche campioni con una serie di carichi batterici per capire il numero che potrebbe cambiare da positivo a negativo (cioè quelli con meno batteri in seguito all’inattivazione del calore).
Il protocollo TB-MBLA per la quantificazione molecolare del carico batterico è il primo del suo genere in batteriologia. Il metodo quantifica direttamente il carico batteriale Mtb dall’espettorato del paziente e non richiede alcuna coltura per farlo. Questo lo rende più veloce e aumenta il suo potenziale per informare una decisione clinica sul progresso del paziente. La fase di inattivazione del calore riduce il rischio di infezione e aumenta l’applicabilità di TB-MBLA in ambienti che non dispongono di un laboratorio di categoria 3. In seguito all’inattivazione termica del campione, ci sono tre passaggi di protocollo per ottenere risultati TB-MBLA: estrazione di RNA, trascrizione inversa (RT)-qPCR e analisi dei risultati qPCR.
Maggiore è l’efficienza di isolare l’RNA Mtb da un campione di pazienti, maggiore è la qualità dei risultati. È importante notare che la qualità del campione di espettorato influisce sulla quantità di RNA isolato. Ad esempio, l’espettorato salivare è considerato di bassa qualità ed è stato associato a un basso carico di bacillario. Ciò significa che è importante allenare il paziente all’aspettativa dell’espettorato di qualità. Per valutare l’efficienza del processo di estrazione, un controllo di estrazione (cioè il numero noto di cellule non-Mtb) è a spillo nel campione prima dell’estrazione dell’RNA. Il recupero del controllo di estrazione conferma l’efficienza del processo di estrazione dell’RNA. Il processo di isolamento dell’RNA non può essere valido a meno che il controllo di estrazione non sia stato recuperato. Dato che Mtb è un organismo resiliente rende la lisi meccanica una parte cruciale del processo. L’omogeneizzazione del campione ad alta velocità (600 giri/min) in presenza di perline (cioè matrice liscivia) lisci letali le cellule. La purificazione del lisato produce un estratto contenente sia l’RNA che il DNA. La rimozione del DNA è un ultimo passo cruciale dell’estrazione dell’RNA. TB-MBLA mira a misurare bacilli vitali quantificando l’RNA. Pertanto, la mancata rimozione del DNA genomico significa che i risultati avranno un segnale dal DNA, che non è un buon marcatore per la vitalità cellulare6.
L’RT-qPCR è un duplex con sonde dual labelcon per Mtb e controllo di estrazione. Si tratta di tre passaggi: trascrizione inversa di 30 min per trascrizione inversa a 50 gradi centigradi, denaturazione di 15 min a 95 gradi centigradi e 40 cicli di amplificazione a 94 e 60 gradi centigradi. L’acquisizione della fluorescenza dalle sonde avviene a 60 gradi centigradi (cioè la fase di allungamento del frammento). È importante notare che il TB-MBLA è stato ottimizzato utilizzando una particolare macchina qPCR, quindi gli operatori che utilizzano altre piattaforme qPCR dovrebbero ottimizzare le condizioni per le loro apparecchiature. L’efficienza della rimozione del DNA è controllata eseguendo una singola reazione per campione in assenza di RT. Un risultato positivo da questa reazione significa la rimozione incompleta del DNA. I campioni ad alto carico di peso che hanno elevate quantità di DNA possono richiedere il doppio della quantità di enzima DNase per rimuovere completamente il DNA. Fortunatamente, in campioni di carico di alta bacillari, la presenza di piccole quantità di DNA ha meno probabilità di influenzare il risultato dell’RNA. L’RNA ribosomico, il bersaglio TB-MBLA, si verifica naturalmente in un valore doppio della quantità di DNA37. Nella PCR, un controllo senza modello (NTC), che è l’acqua utilizzata per sciogliere i reagenti PCR, controlla la contaminazione incrociata con DNA o RNA esogeno. Un segnale positivo nel NTC implica contaminazione incrociata e il risultato considerato non valido. Ciò significa che tutte le soluzioni costituite con quest’acqua devono essere scariate e quelle nuove realizzate con una fiala d’acqua fresca. Si consiglia di tenere l’acqua PCR in separa per evitare la contaminazione di tutta l’acqua. Un controllo positivo (Mtb RNA) viene utilizzato per controllare l’efficienza complessiva della PCR.
L’analisi dei risultati comporta la conversione dei Cq PCR in carico batterico (cioè le unità di formazione della colonia stimate per mL) utilizzando la curva standard. L’impostazione e l’ottimizzazione della curva standard sono fondamentali per questo passaggio. Si consiglia un’efficienza di curva standard di 0,95–1. Le curve standard per la MTb e il controllo dell’estrazione devono essere impostate e ottimizzate prima che i pazienti o altri campioni di prova vengano eseguiti sulla macchina. I campioni standard sono forniti con il kit TB-MBLA. Per la PCR si raccomanda una diluizione di dieci volte dell’estratto di RNA. Ciò implica che il risultato del carico batterico deve essere moltiplicato per un fattore di 10 per ottenere il risultato finale del carico batterico per mL. È importante notare che i Cq superiori a 30 sono considerati negativi per TB-MBLA. È necessario un minimo di due potenziali risultati di carico batterico misurati in diversi punti temporali per fare un’inferenza sulla risposta al trattamento. Si raccomanda vivamente che uno dei due risultati dovrebbe essere al basale, prima dell’inizio del trattamento. Tuttavia, se la valutazione del carico batterico iniziata dal paziente si verifica a metà del trattamento, deve essere effettuata una misurazione del carico batterico a un secondo punto temporale per valutare la risposta al trattamento. TB-MBLA è in grado di distinguere il carico batterico in uno spazio di 3 giorni durante il trattamento, ma l’ideale sono due misurazioni del carico batterico effettuate a 7 giorni di distanza.
Mentre il protocollo genera risultati quantitativi informativi per la risposta al trattamento, è ancora in gran parte manuale e richiede notevoli mani sul tempo per l’estrazione dell’RNA. I tecnici dei laboratori occupati potrebbero non avere questo tempo. Sono in corso accordi per automatizzare i processi di estrazione dell’RNA e PCR.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lo studio è stato reso possibile dal finanziamento del partenariato europeo e dei paesi in via di sviluppo (EDCTP) – Pan African Biomarker Expansion Program (Pan African Biomarker Expansion Program) SP.2011.41304.008. Il sostegno è stato ottenuto anche il grant di ricerca della University of St Andrews School of Medicine. La pubblicazione di questo manoscritto e del protocollo TB-MBLA come risorsa visiva è stata resa possibile dai finanziamenti del Consiglio di finanziamento scozzese e del Global Challenges Research Fund all’Università di St Andrews. Grazie all’ospedale materno di Maputo e al Mavalane Health Centre che ha fornito i campioni di espettorato clinico, e al team dell’Unità di trattamento della tubercolosi maputo che ha contribuito agli esperimenti di inattivazione del calore di campioni di espettorato clinico.
Materials
| Heat inactivation: | |||
| 15 mL Centrifuge tubes | Fisher-Scientific | 10136120 | 50 mL tubes may be used if larger sample volumes are involved |
| 15 mL Wire Tube rack | Fisher-Scientific | 11749128 | Other brands with similar make can be used |
| Water bath | Fisher-Scientific | 15700619 | Other brands with similar make can be used |
| RNA extraction: | |||
| Chloroform | Sigma | 372978-1L | Not necessary in other RNA extraction kit brands |
| Ethanol, absolute 99-100% | Sigma | 51976-500ML-F | Larger volume available |
| Extraction control | SOI group St Andrews | VitalbacteriaEC | Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit |
| FASTRNA Pro blue Kit | MP Biomedicals | 116025050 | Supplied with lysing matrix tubes |
| Molecular grade water (RNase free) | Sigma | W4502-1L | Qiagen, Fisherscientific can also supply same product |
| Precellys 24 homogeniser | VWR | 432-3750 | FastPrep MP Biomedicals can be used too |
| Refrigerated micro-centrifuge, Fresco 21, Heraeus | Fisher-Scientific | 15352117 | Other brands with similar capacity can be used |
| Thermomixer | Eppendorf | BLD-455-010C | Works with 1-2 mL tubes |
| TURBO DNA-free | Fisher-Scientific | AM1907M | Takes longer but more effective than shorter DNA removal procedures. |
| RT-qPCR: | |||
| Primers and Taqman probes | SOI group St Andrews | VitalbacteriaPP | Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit. Probe fluorophores are FAM (green) for Mtb and HEX (yellow) for Extraction control (EC). Applied Biosystems qPCR platforms use VIC instead of HEX. |
| QuantiTect Multiplex RT-PCR NR Kit | Qiagen | 204845 | PCR mix plus the RT enzyme |
| RotorGene Q 5plex machine | Qiagen | 9001580 | Other qPCR machines: Vii7, Quantistudio, Steponelus etc can be used |
| Strip Tubes and Caps, 0.1 ml | Qiagen | 981103 | Other tube sizes available depending on the rotor size. For other PCR platforms 96 well PCR plates are needed. |
| Non-heat inactivation Sample preservation materials | |||
| 1M Tris-HCl pH 7.5 | Sigma | 93313 | Supplied ready to use |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | 63689 | Many competent suppliers |
| Guanidine thiocyanate (GTC) | Promega | V2791 | Promega brand recommended for quality |
| Molecular grade water (RNase free) | Sigma | W4502-1L | Ensures that GTC solution is free of nucleases |
| General materials (used but not specific to TB-MBLA) | |||
| 500 mL plastic containers | 734-5087 | Nalgene brand recommeded | |
| Biological waste discard jars | Many competent suppliers | ||
| Chemical waste discard jars | Many competent suppliers | ||
| Disposable gloves, chemical resistant | Many competent suppliers | ||
| Freezer (-20 °C) | Many competent suppliers | ||
| Freezer (-80 °C) | Many competent suppliers | ||
| Fridge (0-8 °C) | Many competent suppliers | ||
| Fume hood | For safe handling of toxic reagents | ||
| Laboratory scales | For accurate measurement of reagents | ||
| Measuring cylinders, plastic | To ensure accurate measurement of reagents | ||
| PCR reaction tubes | Should be suitable to the PCR instrument used | ||
| Pipettes and matching sterile filtered pipette tips, | DNAse and RNAse-free, range: P1000, P200, P10, P2 recommended | ||
| Qiagility loading plates | Qiagen | 5-well master mix plate, 16-well reagent plate, 32-well sample plate, 72-well and 96-well reaction plates | |
| QIAgility Pipetting Robot | Qiagen | Important for high throughput pipetting | |
| Racks for 1.5 mL and 2 mL microtubes and for 15 mL and 50 mL Falcon tubes | Chemical-resistant and autoclavable recommended | ||
| RNase Away (Removes RNases enzymes from working space) | Fisher Scientific | 10666421 | Important to ensure services and devices are free from RNase enzyme |
| Safety goggles, chemical resistant | Fisher Scientific | Can also be got from Sigma. Protect eyes from toxic reagents. | |
| Sterile Pasteur pipettes, 1.5 mL – 3 mL | Many competent suppliers | ||
| Sterile RNAse-free microtubes | 1.5 mL tubes suitable for freezing at -80 °C recommended | ||
| TB disinfectant, e.g. Tristel Fuse | Ensure it is freshly prepared or prepared within a week | ||
| Vortex | Genie 2 brand recommended | ||
| Transmission electron microscopy | |||
| Glutaldehyde (8%) | Sigma | G7526-10ML | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
| HEPES (pH 7.4, 100 mM) | Sigma | H4034-25G | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
| Leica FCS ultracryo | Leica | Cryomicrotome for tissue sectioning | |
| Methyl cellulose | Agar Scientific | AGG6425 | Cold mounting resin |
| Paraformaldehyde (4% in PBS) | Sigma | P6148-500G | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
| Sucrose | Sigma | 84097-250G | Preservation and mounting medium |
| Uranyl acetate | Agar Scientific | AGR1260A | Universal Electron microscopy stain |
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