結核分子細菌負荷アッセイ(TB-MBLA)

1. サンプルの準備 文化 クリーンベンチまたはクラス1のキャビンで働き、指数相バチルス・カルメット・ゲリン(BCG)培養物の1mLのアリコートを15mLプラスチック遠心管に収穫します。チューブをしっかりと閉じます。注:5 mL サンプル全体を処理するには、5 本の 15 mL 遠心分離チューブが必要です。注意: 結核の文化を扱う場合は、バイオセーフティキャビネットが必要です。 患者痰標本 換気の良い空間で作業し、鼻マスクを着用し、慎重に標本カップを開き、ピペット1 mLアリコートを15 mLプラスチック遠心管に入れ、チューブをしっかりと閉じます。注:広口先端は、ピペット痰に推奨されます。はさみを使用して、1 mL先端口の細かい部分を切り取り、より広い口を作ります。 2. 熱不活性化 試料調製の前に、水浴を95°Cに設定します。注:95°Cの温度はRNase活性を低下させる可能性を高め、従って下流のTB-MBLAのためのより多くのRNAを保存する。 サンプルチューブを、水浴に浸したホールディングラックに移します。各サンプルチューブの4分の3が水中に浸かっていることを確認してください。 95°Cで20分間沸騰させ、チューブをベンチに移して室温で5分間冷却してから、RNA抽出を開始します。注:結核菌およびBCGの完全な熱不活性化は、増殖を確認するために37°Cで37°Cの熱不活性化サンプルおよびコントロールをインキュベートすることによって検証された。600 nm (OD600)で光学密度測定を行い、その後、42日間のインキュベーション期間について毎週行った。 3. RNA抽出 注:ここで説明する RNA 抽出プロセスは、材料表に記載されている RNA キットに関するものです。異なる製造業者による他の適切なRNA抽出キットを使用することができます。 抽出制御 (EC) の追加 熱不活性化サンプルの1 mLアリコートを1.5mLチューブに移します。ECの100μLを各サンプルにスパイクし、チューブを閉じ、チューブを上下逆さまに3倍に反転して混ぜます。注:ECはTB-MBLAの重要な細菌キット(材料のテーブル)と供給されます。 細胞沈下 ベンチトップのマイクロ遠心分離機を使用して、室温で10分間20,000 x gのチューブを遠心します。上清からピペットを取り除き、50 μLの堆積物を残す。 上下にピペットを入れ、950μLのリシスバッファーに沈降を中断し、RNA抽出キットに付属のライジングマトリックスチューブに懸濁液全体を移す(材料表)。チューブがしっかりと閉まっていることを確認し、蓋とチューブの側面の両方にラベルを付けます。 細胞のリシスの場合、工程3.2.2からホモジナイザーにチューブを移します。サンプルを6,000rpmで40sに均質化します。 核酸精製 ステップ3.3からリセートを室温で5分間12,000 x gで遠心分離します。 新鮮な1 mLチューブを準備し、各チューブに300 μLのクロロホルムを加えます。 1 mL チップを使用して、上清を慎重にピペットを取り除き、ラッシングマトリックスに触れることなく。 上清をチューブと渦を含むクロロホルムに5分間移動し、3段階(上、中央、底部)がはっきりと見えるまで5分以上落ち着きます。 室温で5分間12,000 x gで遠心分離機。慎重に上相をピペットし、新鮮な1.5 mLチューブに移します。 ステップ3.4.5のチューブに、氷冷100%エタノールの500 μLを加え、チューブを閉じ、3倍の逆さまに軽く反転して混ぜます。チューブを-80°Cで-80°Cで15分間、または-20°Cで30分間インキュベートし、抽出を継続するか、-20°Cで一晩放置して翌日抽出を完了します。 マイクロ遠心分離機を4°Cに設定し、遠心分離を開始する前に少なくとも12°Cに冷やします。チューブをマイクロ遠心分離機と遠心分離機に20分間13,000 x gでロードします。上清を捨て、70%の氷冷エタノールに置き換え、遠心分離機を13,000 x gでさらに10分間交換してください。注:70%エタノールは、分子グレードヌクレアーゼフリー水で作られるべきです。 ステップ3.4.7からすべての上清を捨て、50°Cに設定されたインキュベーターにチューブを移します。RNA/DNAペレットを乾燥させるために20分間インキュベートします。チューブを部分的に開けて、すべてのエタノールの蒸発を可能にします。 乾燥ペレットに100μLのヌクレアーゼフリー水を加え、室温で5分間インキュベートします。3 sの渦は内容物を混合する。注:この段階では、抽出物は、セクション3.5が実行されるまで-80°Cで2〜3日間、または-80°Cで長期間保存され得る。 DNA除去注:抽出内の DNA の存在は MBLA の結果を無効にするため、このステップは重要です。このセクションは、DNA除去キット(材料表)に基づいています。 サンプル数(10μLのバッファーと1サンプル当たり1μL)に加えて、ピペットによる損失をカバーするために、酵素DNase I 10xバッファーとDNase I酵素の混合物を調製します。ボルテックスで混合し、その後、RNA抽出物を含む各チューブにピペット11μLを混合します。 3 sをボルテックスして混ぜてから、短時間回転(13,000 x gで10s)、壁の液滴を除去します。ホットブロックまたはインキュベーターで30分間37°Cでインキュベートします。各チューブに直接1μLのDNase I酵素を加え、ボルテックスでよく混ぜ合わせ、さらに30分間37°Cでインキュベートします。 DNaseインキュベーション終了の10分前にDNase不活性化試薬を解凍する。ボルテックス20 sは、均質で乳白色の懸濁液を確保し、ステップ3.5.2から各RNA抽出物に10μLのDNase不活性化試薬を加えた。 5分間のインキュベーション工程中に室温で5分間ボルテックス3倍をインキュベートします。 2分間13,000 x gで混合物を遠心分離します。 RT-qPCRを同日または-80°Cで実行して長期保存する場合は、RNA抽出物を冷蔵庫に保管してください。 4. 逆転写酵素 qPCR 未知のサンプルの場合、RNaseフリーウォーターで1:10比で使用されるすべてのRNA抽出物を希釈します。5sの渦によってよく混ぜ、一時的に回転して液滴や気泡を取り除きます。 標準曲線の標準サンプルの場合は、-80°Cの冷凍庫からMtbおよびEC RNA標準を取り、室温で解凍します。MtbおよびEC標準サンプルの7個と6個の10倍希釈液をそれぞれ作ります。1つのチューブから別のチューブに混合物を転送する前に、チップを変更します。注:標準サンプルは TB-MBLA キットと共に提供されます。 マスターミックスの準備注:マスターミックス(MM)は、テンプレートなし制御(NTC)のすべてのサンプル、標準、および水を増幅するのに十分なPCR試薬の溶液です。NTCとして使用される水は、抽出およびMMの調製に使用されるのと同じ水である必要があります。RT-反応とは、DNA除去の効率を決定する制御である(表1)。 各PCR反応チューブに16μLのMMを移します。 各RT+反応チューブとRT-反応チューブに4μLのRNA抽出物を加え、NTC反応管に水を加えます。 反応管をリアルタイムPCR機にセットし、PCR条件を設定する:30分間50°C、15分間95°C、45sの94°Cで40倍のサイクル、緑と黄色のチャネルで吸収するフルオロフォアでの取得で1分間60°C。注:緑色のチャネルはMtb検出フルオロフォアで、黄色は抽出制御検出フルオロフォアです。 結果解釈注:同じサンプルの重複する反応が 1 標準偏差より大きく異ならないようにしてください。Mtb および EC Cq の値が 30 より大きい場合は、負と見なされます。表 2の詳細な解釈を参照してください。 治療応答を解釈するには、標準曲線を使用してCq値を細菌負荷(eCFU/mL)に変換します。治療フォローアップ期間における細菌負荷の変化として治療応答を読み取る。注:治療後の細菌負荷の低下は陽性反応(すなわち、結核菌を殺す抗結核薬)を意味するが、細菌負荷の変化または上昇は否定的な反応を意味し、抗結核薬または患者に対する結核菌の耐性を意味するかもしれない。TB-MBLAによって測定された細菌負荷の低下は、MGIT時間の増加と培養陽性(TTP)と相関する。 5. 透過電子顕微鏡 2 mL の熱不活化培養液およびコントロールのアリコートを 2 mL マイクロ遠心分離管に移します。20,000 x gで10分間の遠心分離機. 上清を捨て、ペレットを700μLの細胞固定バッファーにサスペンドし、室温で5分間インキュベートして細胞を固定します。 懸濁液を16,000xgで30分間遠心しg、硬質ペレットを得た。上清を捨て、リン酸緩衝生理食塩(PBS)で1%スクロースに交換します。ペレットをスクロースに4°Cで保管し、電子顕微鏡用に切り離します。 セッティングとTEM注:以下のプロトコルはグリフィスら28. 細胞ペレットをPBS中の2.1Mスクロースに一晩4°Cで埋め込んで凍結保護する。氷冷水で3倍洗います。 液体窒素中の凍結保護された細胞ペレットを冷却し、それらを凍結ミクロトミースタブをマウントします。クライオミクロトームを使用して、90nmで超薄切片を切断する。 PBSで2%メチルセルロースと2.1 Mスクロースの1:1混合物のタングステンワイヤーループを使用して切断されたセクションを取得します。 ピオロホルムコーティング150メッシュ六角形の銅TEMサポート(グリッド)にセクションを移し、4°Cで保存するか、ステップ5.4.5に進みます。 酢酸メチルのフィルムでウラニル酢酸塩と空気乾燥のグリッドを対比します。氷冷水でグリッドを洗浄し、その後にPBSを5分間2滴、15〜30分間乾燥させます。注:全てのラベリングステップは、周囲温度で行った洗浄工程を除き、氷温(液温)で行った。