A السل الجزيئي ة الحمل البكتيري ة (TB-MBLA)
Summary
نحن نصف اختبار فحص الحمل البكتيري الجزيئي السل أجريت بعد تنشيط الحرارة من البلغم. تعطيل الحرارة يجعل عينات البلغم غير معدية ويغني الحاجة إلى مختبرات الاحتواء من المستوى 3 للاختبارات الجزيئية للسل.
Abstract
السل سببه السل الميكوباكتري (Mtb)، وهو ممرض تصنفه الأمم المتحدة كمادة بيولوجية خطيرة من الفئة باء. من أجل سلامة العمال ، يجب أن يتم التعامل مع جميع العينات المفترض أنها تحمل Mtb في مختبر مستوى الاحتواء (CL) 3. اختبار قياس الحمل البكتيري الجزيئي للسل (TB-MBLA) هو اختبار تفاعل سلسلة بوليميراز كمي عكسي (RT-qPCR) يحدد كمية الحمل العصوية Mtb باستخدام المبشرات والمسابير ذات العلامات المزدوجة لـ 16S rRNA. نحن نصف استخدام تعطيل الحرارة لجعل عينات السل غير معدية مع الحفاظ على الحمض النووي الريبي للسل-MBLA. يتم غلي 1 مل العلية من عينة البلغم في أنابيب الطرد المركزي مغلقة بإحكام 15 مل لمدة 20 دقيقة إما في 80 درجة مئوية، 85 درجة مئوية، أو 95 درجة مئوية لتعطيل عصية Mtb. وأكدت زراعة عينات الحرارة المعطلة والخاضعة للرقابة (الحية) لمدة 42 يوماً وفاة السل. ثم يتم ارتفاع العينة المعطلة مع 100 ميكرولتر من التحكم في الاستخراج ويتم استخراج الحمض النووي الريبي بعد إجراء عزل الحمض النووي الريبي القياسي. ولم يلاحظ أي نمو في ثقافات العينات المعالجة بالحرارة. يخضع الحمض النووي الريبي المعزول لـ RT-qPCR في الوقت الحقيقي ، مما يضخم هدفًا محددًا في جين Mtb 16S rRNA ، مما يؤدي إلى نتائج في شكل دورات قياس كمي (Cq). يتم استخدام منحنى قياسي لترجمة Cq إلى حمل بكتيري ، أو وحدات تشكيل مستعمرة تقديرية لكل مل (eCFU / mL). هناك علاقة عكسية بين Cq والحمولة البكتيرية للعينة. القيد هو أن تعطيل الحرارة يتساقط على بعض الخلايا ، مما يعرض الحمض النووي الريبي لRNases التي تسبب خسارة < 1 سجل10eCFU / مل (أي ، < 10 CFU / مل). ستحدد دراسات أخرى نسبة المرضى الذين يعانون من عبء منخفض للغاية الذين يتسببون في نتائج سلبية كاذبة بسبب تعطيل الحرارة.
Introduction
بسبب السل الميكوباكتري (Mtb)، أكثر من 7 × 106 حالات جديدة من السل (السل) يتم الإبلاغ عنها على الصعيد العالمي منها أكثر من 1 × 106 يموت في السنة1،,2. ولعكس هذا الاتجاه، أطلقت منظمة الصحة العالمية نهجاً ثلاثي الأركان يشمل تطوير أدوات تشخيص وعلاج فعالة3. وتصنف الأمم المتحدة مادة بيولوجية خطيرة من نوع B، ويتطلب العمل مع عينات يفترض أنها إيجابية بالنسبة لمادة Mtb مستوى احتواء قدره 3. مختبرات CL3 مكلفة لبناء وصيانة. ونتيجة لذلك، فإن معظم البلدان لديها خدمات مركزية لثقافة السل على الصعيدين الإقليمي أو الوطني. وهذا يعني أن المجهر اللطاخة هو الأداة التشخيصية الأكثر توفرًا في مرافق الرعاية الصحية الطرفية.
هناك موافقة منظمة الصحة العالمية على تنفيذ الاختبارات الجزيئية السريعة مثل Xpert MTB/RIF في مرافق الرعاية الصحية من المستوى 4، وتقع في الغالب على مستويات المقاطعات4،5. بعض المناطق كبيرة جدا وأقل سهولة في الوصول إليها لبعض الناس. على الرغم من أنه مفيد ، يعمل Xpert MTB / RIF عن طريق الكشف عن الحمض النووي Mtb. الحمض النووي هو جزيء مستقر يبقى لفترة طويلة بعد وفاة الخلايا وبالتالي ليس معيارًا جيدًا لقياس الخلايا القابلة للحياة الحرجة لمراقبة استجابة العلاج5،6. تقدم المقالات المستندة إلى الحمض النووي الريبي بديلاً للقياس الدقيق للخلايا القابلة للحياة7،8،9،10،11،12،13. الحمض النووي الريبي موجود في أنواع مختلفة من الاستقرار متفاوتة: الحمض النووي الريبي (rRNA)، نقل الحمض النووي الريبي (رنا)، ورسول الحمض النووي الريبي (مرنا). ويرتبط رسول الجيش الملكي النيبالي مع التعبير الجيني، وبالتالي الأكثر ارتباطا وثيق مع نشاط الخلية وقابلية البقاء14. من المهم ملاحظة أن غياب التعبير الجيني لا يعادل موت الخلايا لأن مسببات الأمراض مثل Mtb معروفة بوجودها في الدول الخاملة (نائمة) ولكنها قابلة للحياة15،16. الأنواع المستقرة الحمض النووي الريبي مثل rRNA هي علامات أفضل لكل من الحالات النشطة وغير النشطة من الخلايا القابلة للحياة.
باستخدام الإشريكية القولونية، شيريدان أظهرت أن 16S rRNA زيادة نسبيا مع النمو البكتيري تقاس وحدات تشكيل مستعمرة (CFU) التهم17. كان هناك انخفاض متزامن في عدد CFU و 16S rRNA عندما تعرضت بكتيريا الإشريكية القولونية للمضادات الحيوية. كان الانخفاض في rRNA بعد موت الخلية مؤشرا على أنه يمكن استخدامه كعلامة لصلاحية الخلية13،17. وبالاعتماد على هذا المبدأ، تم تطوير قياس الحمل البكتيري الجزيئي للسل (TB-MBLA) لاستهداف M. Tuberculosis 16S rRNA لقياس الحمل عصيات السل القابل للتطبيق كعلامة على استجابة العلاج للمرضى على العلاج المضاد للسل11,18,19. لقد قمنا بتطوير وتحسين السل MBLA لدمج التحكم في الاستخراج الخلوي الذي يعكس الانسالة من عصيات السل M. وقوية في بيئات بيئية مختلفة20. يتطلب إجراء TB-MBLA الخطوات الأولى لعزل الحمض النووي الريبي من Mtb ليتم إجراؤها في مختبر CL3 حتى يتم تحل خلايا Mtb بالكامل لضمان سلامة العمال. ويشمل أيضا الحفاظ على عينة للتحليل دفعات بأثر رجعي ليتم الاحتفاظ بها في -80 درجة مئوية في الثيوكيات guanidine، مادة سامة من المستوى 4. ولتحقيق هذه الغاية، استخدمنا الحرارة لتعطيل Mtb وجعل العينات آمنة لTB-MBLA ليتم إجراؤها في مختبرات مستوى التنظير المجهري.
استخدام الحرارة في التطبيقات المختبرية والسريرية وقد حول ها منذ قرون21،22. ومع ذلك ، فإن بعض الكائنات الحية الدقيقة مثل Mtb صعبة القتل ، والتعرض لأقصر للحرارة غير كافية لقتل جميع الخلايا23،24. كشفت دراسة أن 20 دقيقة تسخين ثقافات السل في 80 درجة مئوية قتل جميع عصيات Mtb دون تدمير الحمض النووي اللازم لPCR25. وفي وقت لاحق، فإن عددا من تقنيات استخراج الحمض النووي المختبري ة الحرارة حاليا إلى 95 درجة مئوية. لقد طبقنا نفس المبدأ لإظهار أن عينات السل المغلي إما عند 80 درجة مئوية أو 85 درجة مئوية أو 95 درجة مئوية يعطل Mtb مع الحفاظ على الحمض النووي الريبي الكافي للسل-MBLA ليتم إجراؤها. يمكن الحفاظ على الثقافة أو البلغم المعطلة في حاويات مغلقة بإحكام في درجة حرارة الغرفة أو تبريدها لمدة 7 أيام دون تقليل كمية rRNA القابلة للقياس الكمي.
اختبار TB-MBLA، المستخدم حاليًا كاختبار استخدام بحثي فقط (RUO) قابل للتكيف وتم تطبيقه على أنواع مختلفة من العينات بما في ذلك البلغم وأنسجة الرئة والسائل الشوكي الدماغي. لم يتم تطبيقه بعد على السائل الهوائية الهوائية والدم وأنواع العينة الأخرى. باستخدام البلغم كعينة ، نتائج التقييم متعدد المواقع في أفريقيا (البيانات غير المنشورة) والمنشورات السابقة18،26 تظهر أن حساسية MBLA تتفق مع أنبوب مؤشر النمو الميكوباكتيري (MGIT) الثقافة السائلة. ومع ذلك، فإن السل-MBLA أسرع، ويعطي نتائج في ساعات بدلاً من أيام أو أسابيع من الثقافة، محددة، لا تتأثر بالكائنات الحية الدقيقة غير السل ية في العينة، ويعطي مقياساً كمياً لشدة المرض. وقد اعترفت منظمة الصحة العالمية مؤخراً بالسل -MBLA كمرشح ة لاستبدال المجهر الضوئي اللطاخة والثقافة لرصد علاج السل2.
في هذه المقالة نصف بالتفصيل تنشيط الحرارة وبروتوكول TB-MBLA المنشورة في سابيتى وآخرين27. سيوفر هذا البروتوكول التفصيلي موردًا مرئيًا شاملًا لمستخدمي TB-MBLA في جميع أنحاء العالم.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتبين هذه المقالة أن المعالجة الحرارية لمدة 20 دقيقة عند 80 درجة مئوية و85 درجة مئوية و95 درجة مئوية يعطل عينات السل بشكل فعال، مما يجعل من الممكن تنفيذ السل-MBLA في منشأة غير CL3 دون خطر العدوى للعاملين في المختبر. وتؤكد النتائج الملاحظات التي أبديت في دراسات سابقة بينما تتناقض مع بعض حول فعالية تنشيط الحرارة من Mtb25,30. على سبيل المثال، تشير بعض التقارير إلى أن التدفئة عند 80 درجة مئوية ليست فعالة على عينات الحمل العصوية العالية25،31،32،33. تم تجنب تأثير التلقيح عالي الكثافة في دراستنا من خلال ضمان تسخين جميع البلغم والثقافات النقية بحجم 1 مل لكل أنبوب طرد مركزي 15 مل مما يوفر مساحة كافية لتعريض كل جزء من العينة للغليان27.
الحفاظ على الحمض النووي الريبي بعد تعطيل الحرارة يجعل من الممكن للسل-MBLA أن يتم تنفيذها. تتفق هذه النتيجة مع دراستين أظهرتا الحفاظ على الحمض النووي الريبي بعد تعطيل الحرارة12،34. أظهرنا أن الحمض النووي الريبي في عينات منشطة الحرارة مستقرة عند 37 درجة مئوية لمدة 4 أيام، مما يعني أن المختبرات يمكن أن دفعات الاختبارات عن طريق الحفاظ على عينات معطلة في درجة حرارة الغرفة لمدة أسبوع. من خلال تطبيق مجموعات استخراج الحمض النووي الريبي التي تتطلب التبريد أو التجميد ، فإن القدرة على الحفاظ على عينات منشطة للحرارة في درجة حرارة الغرفة تغني الحاجة إلى كل من سلسلة التبريد ومختبرات الفئة 3 لأداء TB-MBLA في بيئات محدودة الموارد.
تم فقدان أقل من 1log الحمل البكتيري باستخدام rRNA 16S كعلامة. على الرغم من وجود فرق بين العينة المعطلة الحية والحرارة ، فإن الكمية المفقودة بسبب تعطيل الحرارة صغيرة جدًا بحيث لا يمكن المساس بنتائج المصب. لم تزيد درجة الحرارة المتزايدة من كمية الحمض النووي الريبي المفقودة ، مما يعني أن الخسارة الملحوظة مستقلة عن المعالجة الحرارية. المعالجة الحرارية في درجات حرارة عالية على الأرجح يسبب تحلل الخلايا، مما يعرض الحمض النووي الريبي للتدهور من قبل RNases. في الواقع، إضافة خارجية من RNase A إلى كسر تنشيط الحرارة زيادة معدل تدهور الحمض النووي الريبي. الغليان لم يقلل من نشاط RNase ، مما يعني أنه بروتين مرن للغاية.
من المهم أن نلاحظ أن متوسط تدهور الحمض النووي الريبي من 1.5 سجل10 eCFU /mL ليست خسارة كبيرة. وتحقيقا لهذه الغاية ونحن نفترض أن التدفئة يلمع نسبة صغيرة من عصيات Mtb، وبالتالي تعريض كمية صغيرة من الحمض النووي الريبي لRNase. باستخدام TEM أظهرنا أن مورفولوجيا خلية Mtb وسلامة جدران الخلية لا تتأثر بالتدفئة عند 95 درجة مئوية. وهذا يعني أنه قد يتطلب عوامل فسيولوجية مختلفة وإمدادات كافية من RNases كما هو الحال في المضيف لتدهور الحمض النووي الريبي35بشكل كبير،36. وعلاوة على ذلك، يجري الريبوسم الهيكلية، 16S rRNA هو يحتمل أن تكون أقل عرضة لRNase37،38. خلية Mtb واحدة تحتوي على ~ 700 ريبوسوم/0.1 مم3 من السيتوبلازم37،مما يعني أن هناك كميات أعلى من rRNA لكل خلية. وبالتالي، كميات أصغر من RNase قد يكون لها تأثير أصغر38. ووجود أعداد كبيرة من الريبوسوم يعطي ميزة للسل -MBLA من حيث الحساسية والقدرة على الكشف عن مرضى السل منخفض العبء.
كان هناك ارتباط قوي بين الحمل البكتيري الذي يقاس بالسل MBLA وثقافة MGIT TTP. وهذا يؤكد الحمل البكتيري كمحرك للإيجابية الثقافة إلى حد ما. ومع ذلك، فإن ميزة السل-MBLA هو أنه يحدد كمية الحمل العصوية الموجودة مباشرة في العينة ولا يتطلب انتشار خلايا Mtb قبل الكشف عنها. هذا يتناقض مع الثقافة التي يعتمد وقتها للإيجابية على مستوى الحمل البكتيري ومعدل انتشار خلايا Mtb. ستقوم الدراسات المستقبلية بتقييم سير عمل TB-MBLA، بما في ذلك تعطيل الحرارة، في البيئات السريرية الروتينية. كما ستستكشف الدراسة عينات تحتوي على مجموعة من الأحمال البكتيرية لفهم العدد الذي قد يتغير من إيجابي إلى سلبي (أي أولئك الذين لديهم بكتيريا أقل بعد تعطيل الحرارة).
بروتوكول TB-MBLA للقياس الكمي الجزيئي للحمولة البكتيرية هو الأول من نوعه في علم الجراثيم. هذه الطريقة تحدد كمية مباشرة الحمل عصية Mtb من البلغم المريض ولا يتطلب أي ثقافة للقيام بذلك. وهذا يجعلها أسرع ويزيد من قدرتها على إبلاغ قرار سريري حول تقدم المريض. تقلل خطوة تعطيل الحرارة من خطر العدوى وتزيد من إمكانية تطبيق TB-MBLA في البيئات التي لا تحتوي على مختبر من الفئة 3. بعد تنشيط الحرارة للعينة ، هناك ثلاث خطوات بروتوكولية لتحقيق نتائج TB-MBLA: استخراج الحمض النووي الريبي ، والنسخ العكسي (RT) – qPCR ، وتحليل نتائج qPCR.
كلما زادت كفاءة عزل Mtb RNA من عينة المريض ، كلما زادت جودة النتائج. من المهم ملاحظة أن جودة عينة البلغم تؤثر على كمية الحمض النووي الريبي المعزول. على سبيل المثال، يعتبر البلغم اللعابي منخفض الجودة وقد ارتبط بالحمل العصوية المنخفضة. وهذا يعني أن تدريب المريض على جودة البلغم تتوقع أمر مهم. لتقييم كفاءة عملية الاستخراج ، يتم زيادة عنصر التحكم في الاستخراج (أي العدد المعروف للخلايا غير Mtb) في العينة قبل استخراج الحمض النووي الريبي. استرجاع التحكم استخراج يؤكد كفاءة عملية استخراج الحمض النووي الريبي. لا يمكن أن تكون عملية عزل RNA صالحة ما لم يتم استرداد عنصر التحكم في الاستخراج. وبالنظر إلى حقيقة أن Mtb هو كائن حي مرن يجعل التحليل الميكانيكي جزءًا حاسمًا من العملية. تجانس العينة بسرعة عالية (600 دورة في الدقيقة) في وجود الخرز (أي مصفوفة التسييل) يلهي الخلايا بشكل فعال. تنقية الليسات ينتج استخراج يحتوي على كل من الحمض النووي الريبي والحمض النووي. إزالة الحمض النووي هو خطوة حاسمة الأخيرة من استخراج الحمض النووي الريبي. يهدف TB-MBLA إلى قياس عصيات قابلة للتطبيق من خلال تحديد الحمض النووي الريبي. وبالتالي ، فإن الفشل في إزالة الحمض النووي الجينومي يعني أن النتائج سيكون لها إشارة من الحمض النووي ، وهو ليس علامة جيدة لصلاحية الخلية6.
وRT-qPCR هو مزدوج تشغيل تحقيقات مزدوجة وصفت لMtb والسيطرة على الاستخراج. وهو ينطوي على ثلاث خطوات: 30 دقيقة النسخ العكسي عن طريق transcriptase العكسي في 50 درجة مئوية، 15 denaturation دقيقة عند 95 درجة مئوية، و 40 دورات من التضخيم في 94 درجة مئوية و 60 درجة مئوية. ويحدث اكتساب الفلورسينس من المسابير عند 60 درجة مئوية (أي مرحلة استطالة الأجزاء). من المهم ملاحظة أنه تم تحسين TB-MBLA باستخدام جهاز qPCR معين ، لذلك يجب على المشغلين الذين يستخدمون منصات qPCR الأخرى تحسين ظروف معداتهم. يتم التحكم في كفاءة إزالة الحمض النووي من خلال تشغيل رد فعل واحد لكل عينة في حالة عدم وجود RT. نتيجة إيجابية من رد الفعل هذا يعني إزالة غير مكتملة من الحمض النووي. عينات العبء العالي التي تحتوي على كميات عالية من الحمض النووي قد تتطلب ضعف كمية إنزيم DNase لإزالة الحمض النووي تمامًا. لحسن الحظ، في عينات الحمل العُملية العالية، وجود كميات صغيرة من الحمض النووي أقل احتمالاً للتأثير على النتيجة من الحمض النووي الريبي. الريبوبال الجيش الملكي النيبالي، هدف السل-MBLA، يحدث بشكل طبيعي في ضعف كمية الحمض النووي37. في PCR ، لا يوجد عنصر تحكم في القالب (NTC) ، وهو الماء المستخدم لحل كواشف PCR ، وضوابط للتلوث عبر الحمض النووي الخارجي أو الحمض النووي الريبي. إشارة إيجابية في المجلس الوطني الانتقالي يعني التلوث عبر والنتيجة تعتبر غير صالحة. وهذا يعني أن جميع الحلول التي يتم تشكيلها باستخدام هذه المياه يجب التخلص منها والحلول الجديدة باستخدام قارورة عذبة من الماء. من المستحسن الحفاظ على مياه PCR في العليوت منفصلة لتجنب تلوث جميع المياه. يتم استخدام عنصر تحكم إيجابي (Mtb RNA) للتحكم في الكفاءة العامة لPCR.
تحليل النتائج ينطوي على تحويل Cqs PCR إلى الحمل البكتيري (أي وحدات تشكيل المستعمرة المقدرة لكل مل) باستخدام المنحنى القياسي. يعد وضع المنحنى القياسي وتحسينه أمرًا حاسمًا لهذه الخطوة. ويوصى بكفاءة منحنى قياسية من 0.95-1. يجب إعداد المنحنيات القياسية لـ MTb والتحكم في الاستخراج وتحسينها قبل تشغيل المرضى أو عينات الاختبار الأخرى على الجهاز. يتم توفير عينات قياسية مع مجموعة TB-MBLA. ويوصى تخفيف عشرة أضعاف من استخراج الحمض النووي الريبي لPCR. وهذا يعني أن نتيجة الحمل البكتيري يجب أن تتضاعف بعامل 10 للحصول على نتيجة الحمل البكتيري النهائي لكل مل. من المهم ملاحظة أن Cqs فوق 30 تعتبر سلبية لـ TB-MBLA. مطلوب ما لا يقل عن اثنين من نتائج الحمل البكتيري المحتملين تقاس في نقاط زمنية مختلفة لجعل الاستدلال على استجابة العلاج. ويوصى بشدة أن تكون إحدى النتيجتين خط الأساس، قبل بدء العلاج. ومع ذلك ، إذا كان المريض الذي بدأ تقييم الحمل البكتيري يحدث في منتصف الطريق من خلال العلاج ، يجب أن يكون هناك نقطة ثانية لقياس الحمل البكتيري لتقييم استجابة العلاج. يمكن أن يميز TB-MBLA الحمل البكتيري في غضون 3 أيام على العلاج ولكن المثل الأعلى هو اثنين من قياسات الحمل البكتيرية التي اتخذت 7 أيام بعيدا.
في حين أن البروتوكول يولد نتائج كمية مفيدة للاستجابة للعلاج ، فإنه لا يزال يدويًا إلى حد كبير ويتطلب يدين كبيرتين في الوقت المحدد لاستخراج الحمض النووي الريبي. قد لا يكون لدى الفنيين في المختبرات المزدحمة هذا الوقت. ويجري اتخاذ الترتيبات لأتمتة عمليات استخراج الحمض النووي الريبي وPCR.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد أمكن إجراء الدراسة من خلال التمويل المقدم من شراكة التجارب السريرية الأوروبية والنامية (EDCTP) – برنامج توسيع المؤشرات البيولوجية لعموم أفريقيا (PanBIOME) منحة SP.2011.41304.008. كما تم الحصول على الدعم من منحة أبحاث كلية سانت أندروز للطب. وقد أمكن نشر هذا البروتوكول من المخطوطات وبروتوكول TB-MBLA كمورد مرئي بفضل التمويل المقدم من مجلس التمويل الاسكتلندي وصندوق بحوث التحديات العالمية إلى جامعة سانت أندروز. وبفضل مستشفى مابوتو للأمهات ومركز مافالان الصحي الذي وفر عينات البلغم السريرية، وفريق وحدة علاج السل في مابوتو الذي ساعد في تجارب تعطيل الحرارة لعينات البلغم السريرية.
Materials
| Heat inactivation: | |||
| 15 mL Centrifuge tubes | Fisher-Scientific | 10136120 | 50 mL tubes may be used if larger sample volumes are involved |
| 15 mL Wire Tube rack | Fisher-Scientific | 11749128 | Other brands with similar make can be used |
| Water bath | Fisher-Scientific | 15700619 | Other brands with similar make can be used |
| RNA extraction: | |||
| Chloroform | Sigma | 372978-1L | Not necessary in other RNA extraction kit brands |
| Ethanol, absolute 99-100% | Sigma | 51976-500ML-F | Larger volume available |
| Extraction control | SOI group St Andrews | VitalbacteriaEC | Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit |
| FASTRNA Pro blue Kit | MP Biomedicals | 116025050 | Supplied with lysing matrix tubes |
| Molecular grade water (RNase free) | Sigma | W4502-1L | Qiagen, Fisherscientific can also supply same product |
| Precellys 24 homogeniser | VWR | 432-3750 | FastPrep MP Biomedicals can be used too |
| Refrigerated micro-centrifuge, Fresco 21, Heraeus | Fisher-Scientific | 15352117 | Other brands with similar capacity can be used |
| Thermomixer | Eppendorf | BLD-455-010C | Works with 1-2 mL tubes |
| TURBO DNA-free | Fisher-Scientific | AM1907M | Takes longer but more effective than shorter DNA removal procedures. |
| RT-qPCR: | |||
| Primers and Taqman probes | SOI group St Andrews | VitalbacteriaPP | Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit. Probe fluorophores are FAM (green) for Mtb and HEX (yellow) for Extraction control (EC). Applied Biosystems qPCR platforms use VIC instead of HEX. |
| QuantiTect Multiplex RT-PCR NR Kit | Qiagen | 204845 | PCR mix plus the RT enzyme |
| RotorGene Q 5plex machine | Qiagen | 9001580 | Other qPCR machines: Vii7, Quantistudio, Steponelus etc can be used |
| Strip Tubes and Caps, 0.1 ml | Qiagen | 981103 | Other tube sizes available depending on the rotor size. For other PCR platforms 96 well PCR plates are needed. |
| Non-heat inactivation Sample preservation materials | |||
| 1M Tris-HCl pH 7.5 | Sigma | 93313 | Supplied ready to use |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | 63689 | Many competent suppliers |
| Guanidine thiocyanate (GTC) | Promega | V2791 | Promega brand recommended for quality |
| Molecular grade water (RNase free) | Sigma | W4502-1L | Ensures that GTC solution is free of nucleases |
| General materials (used but not specific to TB-MBLA) | |||
| 500 mL plastic containers | 734-5087 | Nalgene brand recommeded | |
| Biological waste discard jars | Many competent suppliers | ||
| Chemical waste discard jars | Many competent suppliers | ||
| Disposable gloves, chemical resistant | Many competent suppliers | ||
| Freezer (-20 °C) | Many competent suppliers | ||
| Freezer (-80 °C) | Many competent suppliers | ||
| Fridge (0-8 °C) | Many competent suppliers | ||
| Fume hood | For safe handling of toxic reagents | ||
| Laboratory scales | For accurate measurement of reagents | ||
| Measuring cylinders, plastic | To ensure accurate measurement of reagents | ||
| PCR reaction tubes | Should be suitable to the PCR instrument used | ||
| Pipettes and matching sterile filtered pipette tips, | DNAse and RNAse-free, range: P1000, P200, P10, P2 recommended | ||
| Qiagility loading plates | Qiagen | 5-well master mix plate, 16-well reagent plate, 32-well sample plate, 72-well and 96-well reaction plates | |
| QIAgility Pipetting Robot | Qiagen | Important for high throughput pipetting | |
| Racks for 1.5 mL and 2 mL microtubes and for 15 mL and 50 mL Falcon tubes | Chemical-resistant and autoclavable recommended | ||
| RNase Away (Removes RNases enzymes from working space) | Fisher Scientific | 10666421 | Important to ensure services and devices are free from RNase enzyme |
| Safety goggles, chemical resistant | Fisher Scientific | Can also be got from Sigma. Protect eyes from toxic reagents. | |
| Sterile Pasteur pipettes, 1.5 mL – 3 mL | Many competent suppliers | ||
| Sterile RNAse-free microtubes | 1.5 mL tubes suitable for freezing at -80 °C recommended | ||
| TB disinfectant, e.g. Tristel Fuse | Ensure it is freshly prepared or prepared within a week | ||
| Vortex | Genie 2 brand recommended | ||
| Transmission electron microscopy | |||
| Glutaldehyde (8%) | Sigma | G7526-10ML | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
| HEPES (pH 7.4, 100 mM) | Sigma | H4034-25G | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
| Leica FCS ultracryo | Leica | Cryomicrotome for tissue sectioning | |
| Methyl cellulose | Agar Scientific | AGG6425 | Cold mounting resin |
| Paraformaldehyde (4% in PBS) | Sigma | P6148-500G | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
| Sucrose | Sigma | 84097-250G | Preservation and mounting medium |
| Uranyl acetate | Agar Scientific | AGR1260A | Universal Electron microscopy stain |
References
- World Health Organization. END TB Global Tuberculosis Report 2017. World Health Organization. , (2017).
- World Health Organization. Global tuberculosis report 2018. World Health Organization. , (2018).
- World Health Organization. TB Elimination in Low-Incidence Countries. World Health Organization. , (2014).
- Boehme, C. C., et al. diagnostic accuracy, and effectiveness of decentralised use of the Xpert MTB/RIF test for diagnosis of tuberculosis and multidrug resistance: a multicentre implementation study. The Lancet. 377, 1495-1505 (2011).
- World Health Organization. Xpert MTB/RIF assay for the diagnosis of pulmonary and extrapulmonary TB in adults and children. World Health Organization. , (2010).
- Friedrich, S. O., et al. Assessment of the sensitivity and specificity of Xpert MTB/RIF assay as an early sputum biomarker of response to tuberculosis treatment. The Lancet Respiratory Medicine. 1, 462-470 (2013).
- Desjardin, L. E., et al. Measurement of Sputum Mycobacterium tuberculosis Messenger RNA as a Surrogate for Response to Chemotherapy. American Journal of Respiratory Critical Care Medicine. 160, 203-210 (1999).
- Hellyer, T. J., et al. Detection of Viable Mycobacterium tuberculosis by Reverse Transcriptase-Strand Displacement Amplification of mRNA. Journal of Clinical Microbiology. 37, 518-523 (1999).
- Honeyborne, I., et al. Molecular Bacterial Load Assay , a Culture-Free Biomarker for Rapid and Accurate Quantification of Sputum Mycobacterium tuberculosis Bacillary Load during Treatment. Journal of Clinical Microbiology. 49, 3905-3911 (2011).
- Li, L., et al. Sputum Mycobacterium tuberculosis mRNA as a Marker of Bacteriologic Clearance in Response to Antituberculosis Therapy. Journal of Clinical Microbiology. 48, 46-51 (2010).
- Honeyborne, I., et al. The Molecular Bacterial Load Assay Replaces Solid Culture for Measuring Early Bactericidal Response to Antituberculosis Treatment. Journal of Clinical Microbiology. 52, 3064-3067 (2014).
- Hellyer, T. J., Jardin, L. E. D. E. S., Hehman, G. L., Cave, M. D. Quantitative Analysis of mRNA as a Marker for Viability of Mycobacterium tuberculosis. Journal of Clinical Microbiology. 37, 290-295 (1999).
- Aellen, S., Que, Y., Guignard, B., Haenni, M., Moreillon, P. Detection of Live and Antibiotic-Killed Bacteria by Quantitative Real-Time PCR of Specific Fragments of rRNA. Antimicrobial agents chemotherapy. 50, 1913-1920 (2006).
- Deutscher, M. P. Degradation of RNA in bacteria: Comparison of mRNA and stable RNA. Nucleic Acids Research. 34, 659-666 (2006).
- Gupta, R. K., Srivastava, R. Resuscitation Promoting Factors: A Family of Microbial Proteins in Survival and Resuscitation of Dormant Mycobacteria. Indian Journal of Microbiology. 52, 114-121 (2012).
- Mukamolova, G. V., Turapov, O., Malkin, J., Woltmann, G., Barer, M. R. Resuscitation-promoting factors reveal an occult population of tubercle bacilli in sputum. American Journal of Respiratory Critical Care Medicine. 181, 174-180 (2010).
- Sheridan, G. E. C., Masters, C. I., Shallcross, J. A., Mackey, B. M. Detection of mRNA by Reverse Transcription-PCR as an Indicator of Viability in Escherichia coliCells Detection of mRNA by Reverse Transcription-PCR as an Indicator of Viability in Escherichia coli Cells. Applied Environment Microbiology. 64, 1313-1318 (1998).
- Honeyborne, I., et al. Molecular bacterial load assay, a culture-free biomarker for rapid and accurate quantification of sputum Mycobacterium tuberculosis bacillary load during treatment. Journal of Clinical Microbiology. 49, 3905-3911 (2011).
- Sabiiti, W., et al. Molecular Bacterial Load Assay: a Fast and Accurate Means for Monitoring Tuberculosis Treatment Response. BMJ Global Health. 2, 1-8 (2017).
- Gillespie, H., Stephen, S. W., Oravcova, K., Bishop, A. K. Mybacterial Load Assay. Diagnostic Bacteriology. Methods and Protocols. , 89-105 (2017).
- Juffs, H., Deeth, H. Scientific Evaluation of Pasteurisation for Pathogen Reduction in Milk and Milk Products. Food Standards Australia New Zealand. , (2007).
- Holmes, C. J., Degremont, A., Kubey, W. Effectiveness of Various Chemical Disinfectants versus Cleaning Combined with Heat Disinfection on Pseudomonas Biofi lm. Blood Purification. 22, 461-468 (2004).
- Chedore, P., et al. Method for inactivating and fixing unstained smear preparations of Mycobacterium tuberculosis for improved laboratory safety. Journal of Clinical Microbiology. 40, 4077-4080 (2002).
- Cardoso, C. L., et al. Survival of Tubercle Bacilli in Heat-fixed and Stained Sputum Smears. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 96, 277-280 (2001).
- Doig, C., Seagar, A. L., Watt, B., Forbes, K. J. The efficacy of the heat killing of Mycobacterium tuberculosis. Journal of Clinical Pathology. 55, 778-779 (2002).
- Honeyborne, I., et al. The molecular bacterial load assay replaces solid culture for measuring early bactericidal response to antituberculosis treatment. Journal of Clinical Microbiology. 52, 3064-3067 (2014).
- Sabiiti, W., et al. Heat Inactivation Renders Sputum Safe and Preserves Mycobacterium tuberculosis RNA for Downstream Molecular tests. Journal of Clinical Microbiology. , 1-8 (2019).
- Griffiths, G., McDowall, A., Back, R., Dubochet, J. On the preparation of cryosections for immunocytochemistry. Journal of Ultrasructure Research. 89, 65-78 (1984).
- Kumar, V. G., Urs, T. A., Ranganath, R. R. MPT 64 Antigen detection for Rapid confirmation of M. tuberculosis isolates. BMC Research Notes. 4, 79 (2011).
- Zwadyk, P., Down, J. A., Myers, N., Dey, M. S. Rendering of mycobacteria safe for molecular diagnostic studies and development of a lysis method for strand displacement amplification and PCR. Journal of Clinical Microbiology. 32, 2140-2146 (1994).
- Blackwood, K. S., et al. Viability testing of material derived from Mycobacterium tuberculosis prior to removal from a Containment Level-III Laboratory as part of a Laboratory Risk Assessment Program. BMC Infectious Diseases. 5, 3-9 (2005).
- Somerville, W., Thibert, L., Schwartzman, K., Behr, M. A. Extraction of Mycobacterium tuberculosis DNA: a Question of Contaiment. Journal of Clinical Microbiology. 43, 2996-2997 (2005).
- Bemer-Melchior, P., Drugeon, H. B. Inactivation of Mycobacterium tuberculosis for DNA typing analysis. Journal of Clinical Microbiology. 37, 2350-2351 (1999).
- McKillip, J. L., Jaykus, L. A., Drake, M. rRNA stability in heat killed and UV-irradiated enterotoxigenic Staphylococcus aureus and Escherichia coli O157:H7. Journal of Appied Environmental Microbiology. 64, 4264-4268 (1998).
- Blank, A., Dekker, C. A. Ribonucleases of Human Serum, Urine, Cerebrospinal Fluid, and Leukocytes. Activity Staining following Electrophoresis in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gels. Biochemistry. 20, 2261-2267 (1981).
- O’Leary, T. J. Reducing the impact of endogenous ribonucleases on reverse transcription-PCR assay systems. Clinical Chemistry. 45, 449-450 (1999).
- Yamada, H., Yamaguchi, M., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. Structome analysis of virulent Mycobacterium tuberculosis, which survives with only 700 ribosomes per 0.1 fl of cytoplasm. PLoS One. 10, 1-14 (2015).
- Yang, K., et al. Structural insights into species-specific features of the ribosome from the human pathogen Mycobacterium tuberculosis. Nucleic Acids Research. 45, 10884-10894 (2017).
