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Immunology and Infection

Um ensaio de carga bacteriana molecular de tuberculose (TB-MBLA)

Published: April 30, 2020
doi:
10.3791/60460
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1Division of Infection and Global Health, School of Medicine,University of St Andrews, 2National Institute for Medical Research (NIMR)-Mbeya Medical Research Centre, 3Instituto Nacional de Saúde (INS), Ministério da Saúde, 4Institute of Biodiversity, Animal Health & Comparative Medicine, College of Medical, Veterinary & Life Sciences,University of Glasgow

Summary

Descrevemos um teste de ensaio de carga bacteriana molecular de tuberculose realizado após a inativação do calor da escória. A inativação do calor torna as amostras de espelo não infecciosas e evita a necessidade de laboratórios de nível de contenção 3 para testes moleculares de tuberculose.

Abstract

A tuberculose é causada pelo Mycobacterium tuberculosis (Mtb), um patógeno classificado pela Organização das Nações Unidas (ONU) como uma substância biológica perigosa categoria B. Para o bem da segurança dos trabalhadores, o manuseio de todas as amostras presumidas para transportar Mtb deve ser realizado em um laboratório de nível de contenção (CL) 3. O teste de carga bacteriana molecular da TB (TB-MBLA) é um teste de reação em cadeia de polimerase quantitativa transcriptase reversa (RT-qPCR) que quantifica a carga bacilada Mtb usando primers e sondas de dupla etiqueta para 16S rRNA. Descrevemos o uso da inativação de calor para tornar as amostras de TB não infecciosas, preservando o RNA para a TB-MBLA. Uma alíquota de 1 mL da amostra de espeto em tubos de centrífuga de 15 mL bem fechados é fervida por 20 min a 80 °C, 85 °C ou 95 °C para inativar bacilos Mtb. O cultivo do calor inativado e o controle (vivo) das amostras por 42 dias confirmaram a morte da TB. A amostra inativada é então cravada com 100 μL do controle de extração e o RNA é extraído seguindo o procedimento padrão de isolamento do RNA. Não foi observado crescimento nas culturas de amostras tratadas a calor. O RNA isolado é submetido a RT-qPCR em tempo real, que amplifica um alvo específico no gene rRNA Mtb 16S, produzindo resultados na forma de ciclos de quantificação (Cq). Uma curva padrão é usada para traduzir Cq em carga bacteriana, ou unidades de formação de colônias estimadas por mL (eCFU/mL). Há uma relação inversa entre Cq e a carga bacteriana de uma amostra. A limitação é que a inativação de calor atinge algumas células, expondo o RNA a RNases que causam uma perda de <1 log10eCFU/mL (ou seja, <10 CFU/mL). Outros estudos determinarão a proporção de pacientes com carga muito baixa que causam resultados falsos negativos devido à inativação do calor.

Introduction

Causada suscetida pela Mycobacterium tuberculosis (Mtb), mais de 7 x106 novos casos de tuberculose (TB) são relatados globalmente dos quais mais de 1 x 106 morrem por ano1,2. Para reverter a tendência, a Organização Mundial da Saúde (OMS) lançou uma abordagem de três pilares, incluindo o desenvolvimento de ferramentas eficazes de diagnóstico e tratamento3. Classificada como uma substância biológica perigosa B pela ONU, trabalhar com amostras presumidamente positivas para Mtb requer um nível de contenção (CL) de 3. Os laboratórios CL3 são caros para construir e manter. Consequentemente, a maioria dos países tem serviços de cultura de TB centralizados em nível regional ou nacional. Isso significa que a microscopia de difamação é a ferramenta de diagnóstico mais disponível nas unidades de saúde periféricas.

Existe a aprovação da OMS para implementar testes moleculares rápidos como o Xpert MTB/RIF em unidades de saúde de nível 4, situadas principalmente nos níveis distritais4,5. Alguns distritos são muito grandes e menos acessíveis para algumas pessoas. Embora benéfico, xpert MTB/RIF funciona detectando o DNA Mtb. O DNA é uma molécula estável que sobrevive muito tempo depois que as células morrem e, portanto, não é um bom padrão para medir células viáveis críticas para monitorar a resposta ao tratamento5,6. Os ensaios baseados em RNA oferecem uma alternativa para medição precisa de células viáveis7,,8,9,10,11,12,13. O RNA existe em diferentes espécies de estabilidade variável: RNA ribossômico (rRNA), RNA de transferência (tRNA) e RNA mensageiro (mRNA). O RNA mensageiro está associado à expressão genética e, portanto, o mais associado à atividade celular e viabilidade14. É importante notar que a ausência de expressão genética não é equivalente à morte celular porque patógenos como mtb são conhecidos por existirem em estados inativos (dormentes), mas estados viáveis15,16. Espécies estáveis de RNA como o rRNA são, portanto, melhores marcadores de estados ativos e inativos de células viáveis.

Usando Escherichia coli, Sheridan mostrou que o rRNA 16S aumentou proporcionalmente com o crescimento bacteriano medido pelas unidades de formação de colônias (UFC) conta17. Houve um declínio simultâneo na contagem de UFC e 16S rRNA quando as bactérias E. coli foram expostas a antibióticos. A queda do rRNA após a morte celular foi um indicador de que poderia ser usado como marcador para a viabilidade celular13,17. A partir desse princípio, o ensaio de carga bacteriana molecular da TB (TB-MBLA) foi desenvolvido para direcionar m. tuberculosis 16S rRNA para medir a carga bacilado de TB viável como marcador de resposta ao tratamento para pacientes em terapia anti-TB11,18,19. Desenvolvemos e otimizamos ainda mais a TB-MBLA para incorporar um controle de extração celular que reflete a lésia de M. tuberculosis bacilli e é robusto em diferentes ambientes20. O procedimento TB-MBLA exige que os primeiros passos de isolamento de RNA do MTB sejam conduzidos em laboratório CL3 até que as células Mtb sejam completamente lysed para garantir a segurança dos trabalhadores. Também inclui a preservação da amostra para análise retrospectiva em lote a ser mantida a -80 °C em guanidina tiocianato, uma substância tóxica nível 4. Para isso, usamos calor para inativar o Mtb e tornar as amostras seguras para tb-MBLA a serem realizadas em laboratórios de nível de microscopia de manchas.

O uso de calor em aplicações laboratoriais e clínicas existe há séculos21,,22. No entanto, alguns microrganismos como mtb são difíceis de matar, e menor exposição ao calor é insuficiente para matar todas as células23,24. Um estudo revelou que o aquecimento de 20 min de culturas de TB a 80 °C matou todos os bacilos Mtb sem destruir o DNA necessário para pcr25. Posteriormente, uma série de técnicas de extração de DNA laboratorial atualmente aquecem a 95 °C. Aplicamos o mesmo princípio para mostrar que amostras de TB fervente a 80 °C, 85 °C ou 95 °C inativam Mtb, preservando RNA suficiente para a TB-MBLA a ser realizada. A cultura ou a escória inativadas podem ser mantidas em recipientes bem fechados à temperatura ambiente ou refrigerados por 7 dias sem reduzir a quantidade de rRNA quantificável.

O teste TB-MBLA, atualmente utilizado apenas como uso de pesquisa (RUO), é adaptável e tem sido aplicado a diferentes tipos de amostra, incluindo escarro, tecido pulmonar e fluido espinhal cerebral. Ainda está para ser aplicado em fluido alveolar brôquico, sangue e outros tipos de amostra. Utilizando escarro como amostra, resultados da avaliação multisite na África (dados inéditos) e publicações anteriores18,26 mostram que a sensibilidade da MBLA é consistente com a cultura líquida do tubo indicador de crescimento de micobacterium (MGIT). No entanto, a TB-MBLA é mais rápida, dando resultados em horas ao invés de dias ou semanas de cultura, específicas, não afetadas por microrganismos não-TB na amostra, e dá uma medida quantitativa da gravidade da doença. A OMS reconheceu recentemente a TB-MBLA como candidata a substituir a microscopia e a cultura de difamação para o monitoramento do tratamento da TB2.

Neste artigo descrevemos detalhadamente a inativação do calor e o protocolo TB-MBLA publicado em Sabiiti et al.27. Este protocolo detalhado fornecerá um recurso visual único para os usuários de TB-MBLA em todo o mundo.

Protocol

1. Preparação da amostra Cultura Trabalhando em um banco limpo ou cabine classe 1, colhe alíquotas de 1 mL de cultura de fase exponencial Bacillus Calmette-Guérin (BCG) em tubos de centrífuga de plástico de 15 mL. Feche bem os tubos.NOTA: Para processar uma amostra inteira de 5 mL, são necessários cinco tubos de centrífuga de 15 mL.ATENÇÃO: É necessário um gabinete de biossegurança ao trabalhar com qualquer cultura de TB. Amostra de espaquete do paciente Trabalhando em um espaço bem ventilado e usando uma máscara nasal, abra cuidadosamente o copo da amostra, pipeta 1 mL alíquotas em tubos de centrífuga de plástico de 15 mL e feche firmemente os tubos.NOTA: Recomenda-se uma ponta de boca larga para a escória da pipeta. Usando uma tesoura, corte a parte fina da boca da ponta de 1 mL para criar uma boca mais larga. 2. Inativação de calor Antes da preparação da amostra, coloque o banho de água a 95 °C.NOTA: A temperatura de 95 °C aumenta a chance de reduzir a atividade do RNase e, assim, preservar mais RNA para TB-MBLA a jusante. Transfira os tubos de amostra para um rack de retenção imerso no banho-maria. Certifique-se de que três quartos de cada tubo de amostra esteja imerso na água. Ferva a 95 °C por 20 min, depois transfira os tubos para o banco para esfriar em temperatura ambiente por 5 min antes de iniciar a extração de RNA.NOTA: A inativação completa do calor de M. tuberculosis bacilli e BCG foi verificada por incubação de amostras inativadas por calor e controles a 37 °C durante 42 dias para verificar o crescimento. Uma medição de densidade óptica a 600 nm (OD600) foi feita na linha de base e, em seguida, semanalmente para o período de incubação de 42 dias. 3. Extração de RNA NOTA: O processo de extração de RNA descrito aqui é para o kit De RNA listado na Tabela de Materiais. Outros kits de extração de RNA adequados por diferentes fabricantes podem ser usados. Adição do controle de extração (CE) Transferir alíquotas de 1 mL das amostras inativadas pelo calor para tubos de 1,5 mL. Espete 100 μL da CE em cada amostra, feche o tubo e misture invertendo o tubo de cabeça para baixo 3x.NOTA: A CE é fornecida com o kit de bactérias vitais TB-MBLA (Tabela de Materiais). Sedimentação celular Usando uma microcentrífuga de bancada, centrifuge os tubos a 20.000 x g por 10 min à temperatura ambiente. Pipeta fora do sobrenadante, deixando 50 μL de sedimentos. Suspender o sedimento em 950 μL de tampão de lysis por pipetting para cima e para baixo, e transferir toda a suspensão para o tubo de matriz de lysing fornecido com o kit de extração de RNA (Tabela de Materiais). Certifique-se de que os tubos estão bem fechados e rotule tanto a tampa quanto o lado do tubo. Para a lse celular, transfira os tubos da etapa 3.2.2 para um homogeneizador. Homogeneize as amostras para 40 s a 6.000 rpm. Purificação do ácido nucleico Centrifugar o lysate do passo 3.3 a 12.000 x g por 5 min em temperatura ambiente. Prepare tubos frescos de 1 mL e adicione 300 μL de clorofórmio em cada tubo. Usando uma ponta de 1 mL cuidadosamente pipeta fora do sobrenadante sem tocar na matriz de lysing. Transfira o sobrenadante para o clorofórmio contendo tubos e vórtice para 5 s. Deixe o tubo se contentar com 5 min ou mais até que três fases (superior, média e inferior) estejam claramente visíveis. Centrífuga a 12.000 x g por 5 min em temperatura ambiente. Pipeta cuidadosamente a fase superior e transfira para tubos frescos de 1,5 mL. Aos tubos na etapa 3.4.5, adicione 500 μL de etanol 100% frio, feche os tubos e misture invertendo suavemente de cabeça para baixo 3x. Incubar os tubos a -80 °C por 15 min ou -20 °C por 30 min e continuar a extração, ou deixar a -20 °C durante a noite para completar a extração no dia seguinte. Coloque a microcentrífusa a 4 °C e deixe esfriar a pelo menos 12 °C antes de começar a centrifugação. Carregue os tubos na microcentrífuga e centrífuga por 20 min a 13.000 x g. Descarte o sobrenadante, substitua por 70% de etanol gelado e centrífuga por mais 10 min a 13.000 x g.NOTA: O etanol de 70% deve ser feito com água livre de nuclease de grau molecular. Descarte todo o sobrenadante do passo 3.4.7 e transfira os tubos para uma incubadora a 50 °C. Incubar por 20 min para secar a pelota de RNA/DNA. Mantenha os tubos parcialmente abertos para permitir a evaporação de todo o etanol. Adicione 100 μL de água livre de nuclease à pelota seca e incubar por 5 min em temperatura ambiente. Vórtice para 3 s para misturar o conteúdo.NOTA: Nesta fase, o extrato pode ser armazenado de 2 a 3 dias na geladeira ou mais a -80 °C até que a seção 3.5 seja realizada. Remoção de DNANOTA: Esta etapa é crucial porque a presença de DNA no extrato invalida o resultado da MBLA. Esta seção é baseada em um kit de remoção de DNA (Tabela de Materiais). Prepare uma mistura da enzima DNase I 10x tampão e enzima DNase I para o número de amostras (10 μL de tampão e 1 μL de DNase por amostra) mais 10% extra para cobrir qualquer perda de pipetting. Misture por vórtice e, em seguida, pipeta 11 μL em cada tubo contendo o extrato de RNA. Misture ao vórterindo 3 s e gire brevemente (10 s a 13.000 x g)para remover quaisquer gotículas nas paredes. Incubar a 37 °C por 30 min no bloco quente ou incubadora. Adicione um adicional de 1 μL de enzima DNase I diretamente em cada tubo, misture bem por vórtice e incubar por mais 30 min a 37 °C. Descongele o reagente de inativação de DNase 10 min antes do fim da incubação do DNase. Vortex 20 s para garantir uma suspensão homogênea e leitosa e, em seguida, adicionar 10 μL de reagente de inativação de DNase em cada extrato de RNA do passo 3.5.2. Incubar a mistura em temperatura ambiente durante 5 min. Vórtice 3x durante a etapa de incubação de 5 min. Centrifugar a mistura a 13.000 x g por 2 min. Transfira cuidadosamente o sobrenadante para tubos livres de RNase de 1,5 mL sem tocar em nenhuma das matrizs de inativação. Guarde o extrato de RNA na geladeira se estiver executando o RT-qPCR no mesmo dia ou a -80 °C para armazenamento a longo prazo. 4. Transcriptase reversa qPCR Para amostras desconhecidas, diluir todos os extratos de RNA a serem usados em uma razão de 1:10 em água livre de RNase. Misture bem, vórticando para 5 s e gire brevemente para baixo para remover quaisquer gotículas ou bolhas de ar. Para obter amostras padrão para uma curva padrão, pegue os padrões Mtb e EC RNA do congelador -80 °C e descongele à temperatura ambiente. Faça sete e seis diluições de dez vezes de amostras padrão Mtb e CE, respectivamente. Mude as pontas antes de transferir a mistura de um tubo para outro.NOTA: As amostras padrão são fornecidas com o kit TB-MBLA. Preparação de mix mestreNOTA: Master mix (MM) é uma solução de reagentes PCR suficiente para amplificar todas as amostras, padrões e água para um controle sem modelo (NTC). A água utilizada como NTC deve ser a mesma água utilizada na extração e para o preparo do MM. Certifique-se de que as normas, cada amostra de RNA e sua diluição decimal sejam amplificadas 2x para a reação reversa transcriptase positiva (RT+) e 1x para a reação reverse transcriptase negative (RT-). A reação RT é um controle para determinar a eficiência da remoção do DNA (Tabela 1). Transfira 16 μL de MM para cada tubo de reação PCR. Adicione 4 μL de extrato de RNA em cada tubo de reação RT+ e RT e água nos tubos de reação NTC. Carregue os tubos de reação em uma máquina PCR em tempo real e ajuste as condições de PCR da seguinte forma: 50 °C para 30 min, 95 °C para 15 min, 40x ciclos a 94 °C para 45 s e 60 °C para 1 min com aquisição com fluoróforos que absorvem em canais verdes e amarelos.NOTA: O canal verde é o fluoróforo de detecção de Mtb e o amarelo é o fluoróforo de detecção de controle de extração. Interpretação de resultadosNOTA: Certifique-se de que as reações duplicadas da mesma amostra não diferem por mais de 1 desvio padrão. Os valores de Mtb e EC Cq superiores a 30 são considerados negativos. Veja mais detalhes de interpretação na Tabela 2. Para interpretar a resposta do tratamento, converta os valores de Cq em carga bacteriana (eCFU/mL) utilizando a curva padrão. Leia a resposta do tratamento como a mudança na carga bacteriana durante o período de acompanhamento do tratamento.NOTA: A queda na carga bacteriana após o tratamento significa uma resposta positiva (ou seja, drogas anti-TB matando as bactérias da TB) enquanto nenhuma alteração ou aumento na carga bacteriana implica uma resposta negativa, o que pode significar resistência das bactérias da TB a medicamentos anti-TB ou o paciente não aderindo adequadamente à sua dose de tratamento. A queda da carga bacteriana medida pela TB-MBLA correlaciona-se com o aumento do tempo de MGIT à positividade da cultura (TTP). 5. Microscopia eletrônica de transmissão Transfira as alíquotas de 2 mL de culturas inativadas por calor e controles em tubos de microcentrífuge de 2 mL. Centrífuga por 10 min a 20.000 x g. Descarte o sobrenadante e suspenda a pelota em 700 μL de tampão de fixação celular e incuba à temperatura ambiente por 5 min para fixar as células. Centrifugar a suspensão por 30 min a 16.000 x g para obter uma pelota dura. Descarte o sobrenadante e substitua por 1% de sacarose em solução salina tamponada por fosfato (PBS). Armazene as pelotas em sacarose a 4 °C até a secção para microscopia eletrônica. Secção e TEMNOTA: O protocolo abaixo é adaptado de Griffiths et al.28. Crioproteja a pelota celular incorporando-a em 2,1 M de sacarose na PBS durante a noite a 4 °C. Lave 3x com água gelada. Esfrie as pelotas de células crioprotegidas em nitrogênio líquido e monte-as com criomicrotomia. Usando o criomicrotome, corte as seções ultrafinas a 90 nm. Recupere as seções de corte usando as alças de fio de tungstênio de 1:1 mistura de 2% de celulose metile e 2,1 M de sacarose na PBS. Transfira as seções para suportes tem de cobre hexagonal revestido de pioloforme de 150 malhas hexagonais (grades) e armazene a 4 °C ou siga para a etapa 5.4.5. Contraste as grades em acetato de uranyl e ar seco em um filme de acetato de metila. Lave as grades com água gelada seguida por duas gotas de PBS acima de 5 min e seque por 15-30 min. Examine as seções sob tem seguindo as orientações do fabricante.NOTA: Todas as etapas de rotulagem foram realizadas à temperatura do gelo (temperatura líquida), exceto as etapas de lavagem, que foram realizadas à temperatura ambiente.

Representative Results

Calor inativa todos os bacilos de M. tuberculosisA densidade óptica (OD) dos controles (células vivas) aumentou ao longo do tempo, (0,04OD–0,85 OD ) e nenhuma alteração deODfoi observada nas amostras de calor inativadas, significando crescimento e nenhum crescimento, respectivamente (Figura 1)27. Da mesma forma, a escória clínica de controle cresceu positivamente no dia 3 em MGIT, enquanto as amostras clínicas inativadas pelo calor não sinalizaram positivamente até o final da incubação. O crescimento de Mtb no MGIT foi confirmado pela microscopia de difamação Ziehl-Neelsen e pelo antígeno MPT6429. RNA em amostras inativadas fica estável a 37 °C por 4 diasAmostras inativadas por calor foram incubadas a 37 °C para determinar se o RNA se degrada após a inativação de calor das células. Não foi encontrada diferença entre o RNA colhido no Dia (D) 0 imediatamente após a inativação do calor e o RNA isolado em D1, 2, 3 e 4 em ambas as culturas BCG(Figura 2A-C) e tb positivo(Figura 2D). RNase exógeno aumenta a taxa de degradação do RNA nas frações inativadas de calorPara determinar por que o RNA não estava degradante, a enzima RNase A foi exógenamente adicionada a 1.000 U/mL antes e/ou após a inativação do calor. Isso causou perda de RNA equivalente à carga bacteriana 1,5 ± 0,3 -, 1,8 ± 0,2 -, e 1,3 ± 0,1 – registro10 eCFU/mL a 80 °C, 85 °C e 95 °C, respectivamente, durante 4 dias de incubação. Houve diferença no RNA degradado em amostras onde o RNase foi adicionado antes e/ou após a inativação do calor (Figura 3A-C). RNA suficiente é preservado para TB-MBLA usando 16S rRNA como marcador de referênciaO efeito da inativação do calor no rRNA foi medido em culturas BCG e esfato de pacientes com TB positiva. A carga bacteriana medida de controle da cultura BCG, 5,3 ± 0,2 log10 eCFU/mL, foi de 0,2 ± 0,1 log10 eCFU/mL superior ao combinado 5,1 ± 0,3 log10 eCFU/mL de cultura inativada por calor (ANOVA p < 0,0001) a 80 °C, 85 °C e 95 °C(Figura 4A)27. Da mesma forma, a carga bacteriana de escolamento do paciente de controle, 7,1 log10 eCFU/mL, foi de 0,8 ± 0,1 tronco10 eCFU/mL maior que o combinado 6,3 ± 0,41 log10eCFU/mL a 80 °C, 85 °C e 95 °C(Figura 4B)27. A redução da carga bacteriana foi <1log nos dois tipos de amostras testadas. O teste de múltiplas comparações de Sidak revelou uma diferença significativa entre a carga bacteriana a 95 °C versus a de 80 °C e 85 °C (p = 0,001). Não foi encontrada diferença nas amostras de TB em todas as temperaturas, p = 0,8. A integridade da parede celular não é destruída pelo calor na maioria das células MtbUsando microscopia eletrônica de transmissão (TEM) investigamos se as células foram lysed por inativação de calor. Seções finas de pelotas fixas de paraformaldeído de células foram feitas e incorporadas em um meio rico em elétrons antes do exame pelo TEM. A inspeção das células em ampliação inferior e maior revelou parede celular intacta e corpos lipídicos intracelulares visíveis. As células pareciam morfologicamente alongadas, mas não lysed. A Figura 5 ilustra a morfologia das células mycobacterium em diferentes ampliações. Os dois primeiros painéis revelam corpos lipídicos intracelulares e o cordão de corda sem obstáculos, uma característica morfológica típica das espécies de micobacterium. Os dois painéis inferiores são maior ampliação expandindo a visão dos corpos lipídicos e revelando algumas estruturas micro-intracelulares. A carga bacteriana medida pela TB-MBLA está inversamente correlacionada ao tempo de cultura mgit à positividadePara pacientes que respondem à terapia, a carga bacteriana cai a uma média de1 00 eCFU/mL por semana durante o tratamento. Os respondentes rápidos limpam mais rapidamente, convertendo-se em negativo (carga bacteriana zero) por 2 semanas de tratamento. A queda da carga bacteriana medida pela TB-MBLA correspondeu ao aumento do tempo de cultura mgit à positividade (TTP). A Figura 6 demonstra a correlação inversa encontrada entre a carga bacteriana e o TTP MGIT. A diferença, no entanto, é que os resultados da TB-MBLA estão disponíveis em 4h e o tempo de resultado é independente do nível de carga bacteriana. Isso contrasta com 5-25 dias para testes de cultura MGIT. A contaminação com bactérias não-TB compromete ainda mais os resultados dos testes de cultura. Figura 1: Verificação da inativação bcg a 80 °C (curva do padrão de ponto), 85 °C (curva do t-dash padrão) e 95 °C (curva do padrão do traço). O controle (curva preta) foi a cultura BCG ao vivo (não aquecida) inoculada no mesmo meio de crescimento. O crescimento do controle foi confirmado pelo aumento do OD da cultura durante o período de incubação. Esta figura foi modificada a partir de Sabiiti et al.27. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Estabilidade do RNA quantificável na amostra inativada por calor incubada a 37 °C durante 4 dias (D0-D4). (A),(B)e(C)mostram culturas BCG inativadas a 80 °C, 85 °C e 95 °C, respectivamente. (D) mostra a espeto de TB inativado a 80 °C. O controle é a fração não tratada (ao vivo) da mesma amostra. Barras de erro = desvio padrão. Três repetições, nove réplicas por corrida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Maior degradação do RNA após adição exógena da enzima RNase A. (A) Inativação de calor (HI) a 80 °C,(B) HI a 85 °C, e (C) HI 95 °C. Barras de erro = erro padrão da média. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: A preservação de RNA suficiente para medição de carga bacteriana TB-MBLA utilizando 16S rRNA como marcador. (A) Carga bacteriana estimada a partir de culturas BCG in vitro. (B) Carga bacteriana estimada a partir da escória positiva da tuberculose. Barras de erro = erro padrão da média (n = 18 e 20 réplicas para A e B, respectivamente). Esta figura foi modificada a partir de Sabiiti et al.27. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5: Micrografos eletrônicos de bacilos Mtb intactos após a inativação a 95 °C por 20 min. Parede celular clara intacta e corpos lipídicos enumerados foram observados com TEM. Topo: imagens de baixa ampliação de um grupo de células revelando morfologia de corda micobacteriana sem obstáculos e corpos lipídicos intracelulares. Inferior: alta ampliação dos painéis superiores para expandir a visão dos corpos lipídicos e revelar algumas estruturas micro-intracelulares. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 6: A curva de resposta ao tratamento de 12 semanas de um paciente em terapia anti-TB mostrando uma correlação inversa da tb-MBLA medida carga bacteriana e MGIT TTP. A carga bacteriana (curva azul) cai enquanto o TTP sobe (curva vermelha) à medida que o paciente responde ao tratamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Mistura mestre Reação positiva do RT Reação negativa de RT Volume por reação x não. de reações + 5 Volume por reação x não. de reações + 5 Mistura de quantitect 10,0 μL 10,0 μL Mistura de primer Mtb16S (F + R) 0,4 μL 0,4 μL Sonda Mtb16S 0,2 μL 0,2 μL Mistura de primer EC (F + R) 0,4 μL 0,4 μL Sonda CE 0,2 μL 0,2 μL Enzima RT 0,2 μL ——- Água livre de RNase 4,6 μL 4,8 μL Volume total 16 μL 16 μL Tabela 1: Guia de preparação do mix mestre para o tb-MBLA qPCR. Tipo Canal de MTB Canal CE Interpretação Amostra Positivo Positivo Válido Amostra Positivo Negativo Indeterminado Amostra Negativo Positivo Válido Amostra Negativo Negativo Inválido MTB + Controle Positivo Negativo Válido Controle de Extração (CE) Negativo Positivo Válido Controle de DNA Negativo Negativo Válido Controle Negativo (NTC) Negativo Negativo Válido Tabela 2: Guia de interpretação dos resultados da TB-MBLA.

Discussion

Este artigo mostra que o tratamento térmico para 20 min a 80 °C, 85 °C e 95 °C inativa as amostras de tuberculose de forma eficaz, possibilitando que a TB-MBLA seja realizada em uma instalação não-CL3 sem risco de infecção para trabalhadores de laboratório. Os achados confirmam observações feitas em estudos anteriores, contrastando com algumas sobre a eficácia da inativação do calor de Mtb25,30. Por exemplo, alguns relatórios indicam que o aquecimento a 80 °C não é eficaz em amostras de alta carga bacilo25,,31,,32,33. O efeito inóculo de alta densidade foi evitado em nosso estudo, garantindo que toda a esmérosa e culturas puras fossem aquecidas a um volume de 1 mL por tubo de centrifuge de 15 mL, proporcionando espaço adequado para expor cada parte da amostra à ebulição27.

A preservação do RNA após a inativação do calor possibilita a realização da TB-MBLA. Esse achado concorda com dois estudos que demonstraram a preservação do RNA após a inativação do calor12,34. Mostramos que o RNA em amostras inativadas por calor é estável a 37 °C por 4 dias, implicando que os laboratórios poderiam fazer testes em lote mantendo amostras inativadas à temperatura ambiente por uma semana. Ao aplicar kits de extração de RNA que requerem refrigeração ou congelamento, a capacidade de manter amostras inativadas por calor à temperatura ambiente evita a necessidade de laboratórios de cadeia fria e de categoria 3 realizarem TB-MBLA em configurações limitadas de recursos.

Menos de 1log carga bacteriana foi perdida usando o rRNA 16S como marcador. Embora tenha havido uma diferença entre amostra inativada ao vivo e calor, a quantidade perdida para a inativação de calor é muito pequena para comprometer os resultados a jusante. O aumento da temperatura não aumentou a quantidade de RNA perdido, implicando que a perda observada é independente do tratamento térmico. O tratamento térmico a altas temperaturas provavelmente causa a lse celular, expondo o RNA à degradação por RNases. De fato, a adição exógena de RNase A à fração inativada de calor aumentou a taxa de degradação do RNA. A ebulição não reduziu a atividade do RNase, implicando que é uma proteína muito resistente.

É importante notar que uma degradação média de RNA de 1,5 log10 eCFU/mL não é uma grande perda. Para isso, supõe-se que o aquecimento é uma pequena proporção de bacilos Mtb, expondo assim uma pequena quantidade de RNA ao RNase. Usando tem mostrou que a morfologia celular Mtb e a integridade das paredes celulares dificilmente são afetadas pelo aquecimento a 95 °C. Isso significa que pode exigir vários fatores fisiológicos e fornecimento suficiente de RNases, como no hospedeiro, para degradar significativamente o RNA35,36. Além disso, por ser um ribossomos estruturais, o rRNA 16S é potencialmente menos suscetível ao RNase37,38. Uma única célula Mtb contém ~700 ribossomos/0,1 mm3 de citoplasma37, implicando que há maiores quantidades de rRNA por célula. Assim, quantidades menores de RNase podem ter um impacto menor38. A existência de elevados números de ribossomos dá uma vantagem à TB-MBLA em termos de sensibilidade e capacidade de detectar pacientes com TB de baixa carga.

Houve forte correlação entre a carga bacteriana medida pela TB-MBLA e pela cultura MGIT TTP. Isso confirma a carga bacteriana como o motor da positividade cultural até certo ponto. No entanto, a vantagem da TB-MBLA é que ela quantifica diretamente a carga bacilada presente na amostra e não requer proliferação celular de Mtb antes da detecção. Isso contrasta com a cultura cujo tempo de positividade depende do nível de carga bacteriana e da taxa de proliferação celular de Mtb. Estudos futuros avaliarão o fluxo de trabalho tb-MBLA, incluindo a inativação do calor, em ambientes clínicos de rotina. O estudo também explorará amostras com uma gama de cargas bacterianas para entender o número que pode mudar de positivo para negativo (ou seja, aqueles com menos bactérias após a inativação do calor).

O protocolo TB-MBLA para quantificação molecular da carga bacteriana é o primeiro do tipo em bacteriologia. O método quantifica diretamente a carga bacilo Mtb da escória do paciente e não requer cultura para fazê-lo. Isso o torna mais rápido e aumenta seu potencial para informar uma decisão clínica sobre o progresso do paciente. A etapa de inativação do calor reduz o risco de infecção e aumenta a aplicabilidade da TB-MBLA em configurações que não possuem um laboratório de categoria 3. Após a inativação do calor da amostra, existem três etapas de protocolo para alcançar os resultados da TB-MBLA: extração de RNA, transcriptase reversa (RT)-qPCR e análise de resultados qPCR.

Quanto maior a eficiência de isolar o RNA de Mtb de uma amostra do paciente, maior a qualidade dos resultados. É importante notar que a qualidade da amostra de esfatonte afeta a quantidade de RNA isolada. Por exemplo, a salivar é considerada de baixa qualidade e tem sido associada à baixa carga bacilo. Isso significa que treinar o paciente para uma espera de esmaque de qualidade é importante. Para avaliar a eficiência do processo de extração, um controle de extração (ou seja, o número conhecido de células não-Mtb) é cravado na amostra antes da extração do RNA. A recuperação do controle de extração confirma a eficiência do processo de extração de RNA. O processo de isolamento de RNA não pode ser válido a menos que o controle de extração tenha sido recuperado. Dado o fato de que o Mtb é um organismo resiliente faz da lise mecânica uma parte crucial do processo. A homogeneização da amostra em alta velocidade (600 rpm) na presença de contas (ou seja, matriz de lysing) efetivamente lince as células. A purificação do lysato produz um extrato contendo tanto RNA quanto DNA. A remoção do DNA é um último passo crucial da extração do RNA. Tb-MBLA visa medir bacilos viáveis quantificando O Nat. Assim, a não remoção do DNA genômico significa que os resultados terão um sinal do DNA, que não é um bom marcador para a viabilidade celular6.

O RT-qPCR é um duplex executando testes com dupla etiqueta para Mtb e controle de extração. Envolve três etapas: transcrição inversa de 30 min por transcriptase reversa a 50 °C, 15 min de desnaturação a 95 °C e 40 ciclos de amplificação a 94 °C e 60 °C. A aquisição de fluorescência das sondas ocorre a 60 °C (ou seja, o estágio de alongamento do fragmento). É importante notar que a TB-MBLA foi otimizada utilizando uma determinada máquina qPCR, de modo que os operadores que utilizam outras plataformas qPCR devem otimizar as condições para seus equipamentos. A eficiência da remoção do DNA é controlada por uma única reação por amostra na ausência de RT. Um resultado positivo dessa reação significa remoção incompleta do DNA. Amostras de alta carga que têm altas quantidades de DNA podem exigir o dobro da quantidade de enzima DNase para remover completamente o DNA. Felizmente, em amostras de alta carga bacilo, a presença de pequenas quantidades de DNA é menos provável que afete o resultado do RNA. O RNA ribossômico, o alvo TB-MBLA, ocorre naturalmente em dobro da quantidade de DNA37. No PCR, um controle sem modelo (NTC), que é a água usada para dissolver os reagentes pcr, controla a contaminação cruzada com DNA exógeno ou RNA. Um sinal positivo no NTC implica contaminação cruzada e o resultado considerado inválido. Isso significa que todas as soluções constituídas com esta água devem ser descartadas e novas feitas usando um frasco fresco de água. É aconselhável manter a água PCR em alíquotas separadas para evitar a contaminação de toda a água. Um controle positivo (Mtb RNA) é usado para controlar a eficiência geral do PCR.

A análise dos resultados envolve a conversão de PCR Cqs em carga bacteriana (ou seja, as unidades de formação de colôniaestimadas por mL) utilizando a curva padrão. Definir e otimizar a curva padrão é crucial para esta etapa. Recomenda-se uma eficiência de curva padrão de 0,95-1. As curvas padrão para MTb e controle de extração devem ser configuradas e otimizadas antes que pacientes ou outras amostras de teste sejam executadas na máquina. As amostras padrão são fornecidas com o kit TB-MBLA. Recomenda-se uma diluição dez vezes maior do extrato de RNA para PCR. Isso implica que o resultado da carga bacteriana deve ser multiplicado por um fator de 10 para obter o resultado final da carga bacteriana por mL. É importante notar que cqs acima de 30 são considerados negativos para TB-MBLA. Um mínimo de dois resultados potenciais de carga bacteriana medidos em diferentes pontos de tempo é necessário para fazer uma inferência sobre a resposta ao tratamento. Recomenda-se fortemente que um dos dois resultados seja a linha de base, antes do início do tratamento. No entanto, se o paciente iniciou a avaliação da carga bacteriana no meio do tratamento, deve haver uma segunda medição de carga bacteriana ponto de tempo para avaliar a resposta do tratamento. Tb-MBLA pode distinguir a carga bacteriana em um espaço de 3 dias no tratamento, mas o ideal são duas medidas de carga bacteriana tomadas com 7 dias de intervalo.

Embora o protocolo gere resultados quantitativos informativos para a resposta ao tratamento, ele ainda é em grande parte manual e exige mãos substanciais no tempo para a extração de RNA. Técnicos em laboratórios ocupados podem não ter desta vez. Estão em andamento arranjos para automatizar os processos de extração de RNA e PCR.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

O estudo foi possível graças ao financiamento da Parceria de Ensaios Clínicos dos Países Europeus e dos Países Em Desenvolvimento (EDCTP) – Programa Panafricano de Expansão de Biomarcadores (PanBIOME) do sp.2011.41304.008. Também foi obtido apoio na bolsa de pesquisa da Faculdade de Medicina da Universidade de St. Andrews. A publicação deste manuscrito e do protocolo TB-MBLA como recurso visual foi possível graças ao financiamento do Conselho Escocês de Financiamento e do Fundo de Pesquisa de Desafios Globais para a Universidade de St. Andrews. Graças ao Hospital Materno Maputo e ao Centro de Saúde mavalane, que forneceram os espécimes de espeto clínico, e à equipe da Unidade de Tratamento da Tuberculose Maputo, que ajudaram nos experimentos de inativação de calor de amostras clínicas de espelo.

Materials

Heat inactivation:
15 mL Centrifuge tubes Fisher-Scientific 10136120 50 mL tubes may be used if larger sample volumes are involved
15 mL Wire Tube rack Fisher-Scientific 11749128 Other brands with similar make can be used
Water bath Fisher-Scientific 15700619 Other brands with similar make can be used
RNA extraction:
Chloroform Sigma 372978-1L Not necessary in other RNA extraction kit brands
Ethanol, absolute 99-100% Sigma 51976-500ML-F Larger volume available
Extraction control SOI group St Andrews VitalbacteriaEC Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit
FASTRNA Pro blue Kit MP Biomedicals 116025050 Supplied with lysing matrix tubes
Molecular grade water (RNase free) Sigma W4502-1L Qiagen, Fisherscientific can also supply same product
Precellys 24 homogeniser VWR 432-3750 FastPrep MP Biomedicals can be used too
Refrigerated micro-centrifuge, Fresco 21, Heraeus Fisher-Scientific 15352117 Other brands with similar capacity can be used
Thermomixer Eppendorf BLD-455-010C Works with 1-2 mL tubes
TURBO DNA-free Fisher-Scientific AM1907M Takes longer but more effective than shorter DNA removal procedures.
RT-qPCR:
Primers and Taqman probes SOI group St Andrews VitalbacteriaPP Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit. Probe fluorophores are FAM (green) for Mtb and HEX (yellow) for Extraction control (EC). Applied Biosystems qPCR platforms use VIC instead of HEX.
QuantiTect Multiplex RT-PCR NR Kit Qiagen 204845 PCR mix plus the RT enzyme
RotorGene Q 5plex machine Qiagen 9001580 Other qPCR machines: Vii7, Quantistudio, Steponelus etc can be used
Strip Tubes and Caps, 0.1 ml Qiagen 981103 Other tube sizes available depending on the rotor size. For other PCR platforms 96 well PCR plates are needed.
Non-heat inactivation Sample preservation materials
1M Tris-HCl pH 7.5 Sigma 93313 Supplied ready to use
2-Mercaptoethanol Sigma 63689 Many competent suppliers
Guanidine thiocyanate (GTC) Promega V2791 Promega brand recommended for quality
Molecular grade water (RNase free) Sigma W4502-1L Ensures that GTC solution is free of nucleases
General materials (used but not specific to TB-MBLA)
500 mL plastic containers 734-5087 Nalgene brand recommeded
Biological waste discard jars Many competent suppliers
Chemical waste discard jars Many competent suppliers
Disposable gloves, chemical resistant Many competent suppliers
Freezer (-20 °C) Many competent suppliers
Freezer (-80 °C) Many competent suppliers
Fridge (0-8 °C) Many competent suppliers
Fume hood For safe handling of toxic reagents
Laboratory scales For accurate measurement of reagents
Measuring cylinders, plastic To ensure accurate measurement of reagents
PCR reaction tubes Should be suitable to the PCR instrument used
Pipettes and matching sterile filtered pipette tips, DNAse and RNAse-free, range: P1000, P200, P10, P2 recommended
Qiagility loading plates Qiagen 5-well master mix plate, 16-well reagent plate, 32-well sample plate, 72-well and 96-well reaction plates
QIAgility Pipetting Robot Qiagen Important for high throughput pipetting
Racks for 1.5 mL and 2 mL microtubes and for 15 mL and 50 mL Falcon tubes Chemical-resistant and autoclavable recommended
RNase Away (Removes RNases enzymes from working space) Fisher Scientific 10666421 Important to ensure services and devices are free from RNase enzyme
Safety goggles, chemical resistant Fisher Scientific Can also be got from Sigma. Protect eyes from toxic reagents.
Sterile Pasteur pipettes, 1.5 mL – 3 mL Many competent suppliers
Sterile RNAse-free microtubes 1.5 mL tubes suitable for freezing at -80 °C recommended
TB disinfectant, e.g. Tristel Fuse Ensure it is freshly prepared or prepared within a week
Vortex Genie 2 brand recommended
Transmission electron microscopy
Glutaldehyde (8%) Sigma G7526-10ML Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer)
HEPES (pH 7.4, 100 mM) Sigma H4034-25G Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer)
Leica FCS ultracryo Leica Cryomicrotome for tissue sectioning
Methyl cellulose Agar Scientific AGG6425 Cold mounting resin
Paraformaldehyde (4% in PBS) Sigma P6148-500G Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer)
Sucrose Sigma 84097-250G Preservation and mounting medium
Uranyl acetate Agar Scientific AGR1260A Universal Electron microscopy stain
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References

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Sabiiti, W., Mtafya, B., De Lima, D. A., Dombay, E., Baron, V. O., Azam, K., Oravcova, K., Sloan, D. J., Gillespie, S. H. A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA). J. Vis. Exp. (158), e60460, doi:10.3791/60460 (2020).
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