Tüberküloz Moleküler Bakteriyel Yük Analizi (TB-MBLA)
Summary
Balgamın ısı inaktivasyonundan sonra yapılan tüberküloz moleküler bakteriyel yük testini tanımladık. Isı inaktivasyonu balgam örneklerini enfeksiyöz olmayan hale getirir ve tüberküloz moleküler testleri için 3 laboratuvarları kapsama ihtiyacını ortadan kılmaktadır.
Abstract
Tüberküloz, Birleşmiş Milletler (BM) tarafından tehlikeli bir Kategori B biyolojik maddesi olarak sınıflandırılan bir patojen olan Mycobacterium tuberculosis (Mtb) neden olur. İşçilerin güvenliği için, Mtb taşıdığı sanılan tüm numunelerin işlenmesi bir koruma seviyesi (CL) 3 laboratuarında yapılmalıdır. Tüberküloz moleküler bakteri yük testi (TB-MBLA) testi, 16S rRNA için astar ve çift etiketli problar kullanarak Mtb basil yükünü ölçen ters transkriptaz nicel polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) testidir. TB-MBLA için RNA’yı korurken Tüberküloz örneklerini bulaşıcı hale getirmek için ısı inaktivasyonu nun kullanımını açıklıyoruz. Sıkıca kapatmış 15 mL santrifüj tüpteki balgam numunesinin 1 mL aliquot’u, Mtb basilini inaktive etmek için 80 °C, 85 °C veya 95 °C’de 20 dakika kaynatılır. 42 gün boyunca ısı inaktive ve kontrol (canlı) örnekleri ekimi Tüberküloz ölümü doğruladı. İnaktive numune daha sonra ekstraksiyon kontrolünün 100 μL’si ile çivilenir ve standart RNA izolasyon prosedürü nden sonra RNA ayıklanır. Isıl işlem görmüş numune kültürlerinde büyüme gözlenmedi. İzole RNA, Mtb 16S rRNA genindeki belirli bir hedefi yükselten ve niceleme döngüleri (Cq) şeklinde sonuçlar veren gerçek zamanlı RT-qPCR’ye maruz kalır. Standart bir eğri bakteriyel yük veya mL başına tahmini koloni şekillendirme birimleri (eCFU / mL) içine Cq çevirmek için kullanılır. Cq ile numunenin bakteriyel yükü arasında ters bir ilişki vardır. Sınırlama, ısı inaktivasyonunun bazı hücreleri etkisiz hale getirmesi ve RNA’yı <1 log10eCFU/mL (yani<10 CFU/mL) kaybına neden olan RNA'lara maruz bırakmasıdır. Daha ileri çalışmalar ısı inaktivasyonu nedeniyle yanlış negatif sonuçlara neden çok düşük yük hastaların oranını belirleyecektir.
Introduction
Mycobacterium tuberculosis (Mtb) neden, 7 x 106 yeni tüberküloz vakası (TB) üzerinde yılda 1 x 106 ölmek küresel rapor edilir1,2. Eğilimi tersine çevirmek için, Dünya Sağlık Örgütü (WHO) etkili tanı ve tedavi araçları geliştirme dahil olmak üzere üç ayaklı bir yaklaşım başlattı3. BM tarafından tehlikeli bir biyolojik madde olarak sınıflandırılan B, Mtb için pozitif olduğu sanılan numunelerle çalışmak için 3’lük bir çevreleme düzeyi (CL) gerekir. CL3 laboratuvarlarının inşası ve bakımı pahalıdır. Sonuç olarak, çoğu ülke bölgesel veya ulusal düzeyde tüberküloz kültür hizmetlerini merkezileştirmiş. Bu, yayma mikroskobunun çevre sağlık tesislerinde en uygun tanı aracı olduğu anlamına gelir.
Düzey 4 sağlık tesislerinde Xpert MTB / RIF gibi hızlı moleküler testler uygulamak için DSÖ onayı vardır, çoğunlukla ilçe düzeylerinde yer4,5. Bazı ilçeler oldukça büyük ve bazı insanlar için daha az erişilebilir. Yararlı olmakla birlikte, Xpert MTB/RIF Mtb DNA’sını tespit ederek çalışır. DNA hücreleri öldükten sonra uzun süre hayatta kalır ve böylece tedavi yanıtı izlemek için kritik canlı hücreleri ölçmek için iyi bir standart değildir istikrarlı bir moleküldür5,6. RNA tabanlı tahliller canlı hücrelerin doğru ölçümü için bir alternatif sunuyoruz7,8,9,10,11,12,13. RNA farklı stabilite türlerinde bulunur: ribozomal RNA (rRNA), transfer RNA (tRNA) ve haberci RNA (mRNA). Messenger RNA gen ekspresyonu ile ilişkilidir ve böylece en yakından hücre aktivitesi ve canlılık ile ilişkili14. Mtb gibi patojenlerin inaktif (atıl) ama yaşanabilir devletlerde var olduğu bilindiği için gen ekspresyonunun yokluğunun hücre ölümüyle eşdeğer olmadığını belirtmek önemlidir15,16. RRNA gibi kararlı RNA türleri bu nedenle canlı hücrelerin hem aktif hem de inaktif durumlarının daha iyi belirteçleridir.
Escherichia colikullanarak, Sheridan 16S rRNA orantılı koloni oluşturan birimleri (CFU) sayıları ile ölçülen bakteri üreme sayar17arttı gösterdi. E. coli bakterisi antibiyotiklere maruz kaldığında CFU sayılarında ve 16S rRNA’da eşzamanlı bir düşüş yaşandı. Hücre ölümünün ardından rRNA’daki düşüş, hücre canlılığı için bir belirteç olarak kullanılabileceğinin bir göstergesiydi13,17. Bu ilkeden yola çıkarak, Anti-TB tedavisi olan hastalar için tedavi yanıtının bir göstergesi olarak m. tüberküloz 16S rRNA’yı hedeflemek için Tüberküloz moleküler bakteri yükü (TB-MBLA),18,19geliştirilmiştir. Biz daha da geliştirdik ve M. tüberküloz basili lysis yansıtan bir hücresel ekstraksiyon kontrolü dahil etmek için TB-MBLA optimize ve farklı çevre ortamlarında sağlam20. TB-MBLA prosedürü, Mtb hücrelerinin işçilerin güvenliğini sağlamak için tamamen lysed kadar Mtb’den RNA izolasyonunun ilk adımlarının CL3 laboratuvarında yapılmasını gerektirir. Ayrıca guanidin tiyosiyanat, bir seviye 4 toksik madde -80 °C’de muhafaza edilecek retrospektif toplu analiz için örnek koruma içerir. Bu amaçla, Mtb’yi inaktive etmek ve örnekleri kobi mikroskop seviyesi laboratuvarlarında yapılacak Tüberküloz-MBLA için güvenli hale getirmek için ısı kullandık.
Laboratuvar ve klinik uygulamalarda ısı kullanımı yüzyıllardır21,22civarında olmuştur. Ancak, Mtb gibi bazı mikroorganizmalar öldürmek zordur, ve ısı ya daha kısa maruz kalma tüm hücreleri öldürmek için yetersizdir23,24. Yapılan bir çalışmada, 80 °C’de Tüberküloz kültürlerinin 20 dk ısıtmapcr25için gerekli DNA’yı yok etmeden tüm Mtb basillerini öldürdüğü ortaya konmıştır. Daha sonra, laboratuvar DNA çıkarma teknikleri bir dizi şu anda 95 °C ısı. Aynı prensibi, 80 °C, 85 °C veya 95 °C’de kaynayan Tüberküloz örneklerinin MTB’yi inaktive ettiğini ve TB-MBLA için yeterli RNA’yı koruduğunu göstermek için uyguladık. Inaktive kültür veya balgam oda sıcaklığında sıkıca kapalı kaplarda muhafaza edilebilir veya ölçülebilir rRNA miktarını azaltmadan 7 gün buzdolabında.
TB-MBLA, şu anda sadece bir araştırma kullanımı olarak kullanılan (RUO) testi uyarlanabilir ve balgam, akciğer dokusu ve serebral spinal sıvı dahil olmak üzere farklı örnek tipleri uygulanmıştır. Bronşiyal alveoler sıvı, kan ve diğer örnek tiplerine henüz uygulanmamıştır. Örnek olarak balgam kullanılması, Afrika’da çok siteli değerlendirme (yayınlanmamış veriler) ve önceki yayınlar18,26 sonuçları MBLA duyarlılığı nın mikobacterium büyüme göstergesi tüpü (MGIT) sıvı kültürü ile tutarlı olduğunu göstermektedir. Ancak, TB-MBLA daha hızlıdır, kültür gün veya hafta aksine saat sonuçları veren, özel, örnekte olmayan Tüberküloz mikroorganizmalar etkilenmez, ve hastalığın şiddetini nicel bir ölçü verir. DSÖ son zamanlarda tb tedavisi2izlenmesi için smear mikroskobu ve kültür yerine aday olarak TB-MBLA tanıdı.
Bu yazıda Sabiiti ve ark.27’deyayınlanan ısı inaktivasyonu ve TB-MBLA protokolünü ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Bu ayrıntılı protokol, dünya genelinde KiRemit kullanıcıları için tek noktadan görsel bir kaynak sağlayacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makale, tüberküloz örneklerini 80 °C, 85 °C ve 95 °C’de 20 dk ısıl işlemin etkili bir şekilde inaktive ettiğini ve tb-MBLA’nın laboratuvar çalışanlarına enfeksiyon riski olmadan CL3 dışı bir tesiste yapılmasını mümkün kılabilir. Bulgular mtb25,,30ısı inaktivasyonu etkinliği bazı tezat ise önceki çalışmalarda yapılan gözlemler ilerler. Örneğin, bazı raporlar 80 °C’deısıtmanınyüksek basil yük örnekleri 25,31,3232,33’teetkili olmadığını göstermektedir. Çalışmamızda tüm balgam ve saf kültürlerin 15 mL santrifüj tüp başına 1 mL hacimde ısıtılmasını sağlayarak numunenin her bir parçasını kaynamaya maruz bırakmak için yeterli alan sağlanarak yüksek yoğunluklu inokül etkisi önlenmiştir27.
Isı inaktivasyonu ndan sonra RNA’nın korunması, TB-MBLA’nın yapılmasını mümkün kılar. Bu bulgu ısı inaktivasyonu12,,34sonra RNA korunması gösterdi iki çalışma ile aynı fikirde . Isı yalıtımlı numunelerde RNA’nın 37 °C’de 4 gün boyunca stabil olduğunu gösterdik, bu da laboratuvarların bir hafta oda sıcaklığında inaktive numuneler tutarak toplu testler yapabileceğini ima etti. Soğutma veya donma gerektiren RNA ekstraksiyon kitleri uygulayarak, oda sıcaklığında ısı inaktive numuneleri muhafaza yeteneği, hem soğuk zincir hem de Kategori 3 laboratuvarlarının kaynak sınırlı ayarlarında TB-MBLA’yı gerçekleştirmesi gereğini ortadan kaldırabilir.
1log’dan daha az bakteriyel yük, işaretleyici olarak 16S rRNA kullanılarak kaybedildi. Canlı ve ısı inaktive numunesi arasında fark olmasına rağmen, ısı inaktivasyonunda kaybedilen miktar akış aşağı sonuçlarını tehlikeye atamayacak kadar küçüktür. Artan sıcaklık, gözlenen kaybın ısıl işlemden bağımsız olduğunu ima ederek kaybedilen RNA miktarını artırmadı. Yüksek sıcaklıklarda ısıl işlem büyük olasılıkla hücre lysis neden olur, RNA RNas tarafından bozulmasına maruz. Gerçekten de, ısı inaktive fraksiyonu RNa A eksojen eklenmesi RNA bozulma oranını artırdı. Kaynama, çok esnek bir protein olduğunu ima, RNase aktivitesini azaltmadı.
Bu 1.5 günlük10 eCFU / mL ortalama RNA bozulması büyük bir kayıp olmadığını unutmayın. Bu amaçla, ısıtmanın Mtb basilinin küçük bir kısmını eşitleyerek az miktarda RNA’yı RNa’ya maruz bıraktığı varsayımında bulunmaktadır. TEM ile Mtb hücre morfolojisi ve hücre duvarlarının bütünlüğünün 95 °C’de ısıtıldıktan etkilenmediğini gösterdik. Bu önemli ölçüde RNA,35,36düşürmek için ev sahibi gibi çeşitli fizyolojik faktörler ve RNases yeterli kaynağı gerektirebilir anlamına gelir. Ayrıca, yapısal bir ribozom olmak, 16S rRNA potansiyel olarak daha az RNaseduyarlıdır 37,38. Tek bir Mtb hücresi ~ 700 ribozom/0.1 mm3 sitoplazma37içerir , hücre başına rRNA yüksek miktarlarda olduğunu ima. Böylece, RNase küçük miktarlarda daha küçük bir etkisiolabilir 38. Ribozomların yüksek sayıda varlığı duyarlılık ve düşük yük Tüberküloz hastaları tespit yeteneği açısından TB-MBLA için bir avantaj sağlar.
Tüberküloz-MBLA ile ölçülen bakteriyel yük ile MGIT kültürü TTP arasında güçlü bir korelasyon vardı. Bu bir ölçüde kültür pozitifliği sürücüsü olarak bakteriyel yük doğrular. Ancak, TB-MBLA’nın avantajı, numunede bulunan basil yükünü doğrudan ölçmesi ve tespit edilmeden önce Mtb hücre çoğalmasını gerektirmemesidir. Bu, pozitifliğe olan zamanı bakteriyel yük seviyesine ve Mtb hücre çoğalma hızına bağlı olan kültürle tezat oluşturuyor. Gelecekteki çalışmalar, ısı inaktivasyonu da dahil olmak üzere TB-MBLA iş akışını rutin klinik ortamlarda değerlendirecektir. Çalışma da pozitif negatif (yani, ısı inaktivasyonu aşağıdaki daha az bakteri olanlar) değişebilir sayısını anlamak için bakteri yükleri bir dizi örnekleri araştıracaktır.
Bakteriyel yükün moleküler olarak ölçülmesi için TB-MBLA protokolü bakteriyolojide türünün ilk türünün ilk günüdür. Bu yöntem hasta balgamından mtb basil yükünü doğrudan ölçer ve bunu yapmak için kültür gerektirmez. Bu daha hızlı yapar ve hastanın ilerleme hakkında bir klinik karar bilgilendirmek için potansiyelini artırır. Isı inaktivasyon adımı enfeksiyon riskini azaltır ve kategori 3 laboratuarı olmayan ortamlarda TB-MBLA’nın uygulanabilirliğini artırır. Numunenin ısı inaktivasyonundan sonra, TB-MBLA sonuçlarını elde etmek için üç protokol adımı vardır: RNA ekstraksiyonu, ters transkriptaz (RT)-qPCR ve qPCR sonuç analizi.
Mtb RNA’yı hasta örneğinden yalıtma etkinliği ne kadar yüksekse, sonuçların kalitesi de o kadar yüksek olur. Balgam numunesinin kalitesinin izole edilen RNA miktarını etkilediğini belirtmek önemlidir. Örneğin, tükürük balgam düşük kaliteli olarak kabul edilir ve düşük basil yükü ile ilişkili olmuştur. Bu da hastanın kaliteli balgam beklentisi için eğitilmesinin önemli olduğu anlamına gelir. Çıkarma işleminin verimliliğini değerlendirmek için, rna ekstraksiyonundan önce numuneye bir ekstraksiyon kontrolü (yani Mtb dışı hücrelerin bilinen sayısı) ekilir. Çıkarma kontrolünün alınması RNA çıkarma işleminin verimliliğini doğrular. Çıkarma denetimi alınmadıkça RNA yalıtım işlemi geçerli olamaz. Mtb’nin dirençli bir organizma olduğu göz önüne alındığında mekanik bir lisis ilerletmek sürecin önemli bir parçasıdır. Numunenin yüksek hızda homojenleştirilmesi (600 rpm) boncuk varlığında (yani, lysing matrisi) hücreleri etkili bir şekilde doğrular. Lysate saflaştırma rna ve DNA hem de içeren bir ekstre verir. DNA’nın çıkarılması RNA çıkarmanın son adımıdır. TB-MBLA, RNA’yı ölçerek uygulanabilir basilleri ölçmeyi amaçlamaktadır. Böylece, genomik DNA’nın çıkarılamaması, sonuçların DNA’dan bir sinyal alacağı anlamına gelir, bu da hücre canlılığı için iyi bir belirteç değildir6.
RT-qPCR, Mtb ve ekstraksiyon kontrolü için çift etiketli problar çalıştıran bir dublekstir. Üç adım içerir: 50 °C’de ters transkripsiyon ile 30 dk ters transkripsiyon, 95 °C’de 15 dk denatürasyon ve 94 °C ve 60 °C’de 40 döngü amplifikasyon. Problardan floresan elde edilmesi 60 °C’de (yani parça uzama aşamasında) gerçekleşir. TB-MBLA’nın belirli bir qPCR makinesi kullanılarak optimize edildiğini, bu nedenle diğer qPCR platformlarını kullanan operatörlerin ekipmanlarının koşullarını optimize etmesi gerektiğini unutmayın. DNA çıkarma nın etkinliği, RT yokluğunda numune başına tek bir reaksiyon çalıştırılarak kontrol edilir. Bu reaksiyondan elde edilen olumlu sonuç DNA’nın eksik çıkarılmasıanlamına geliyor. Yüksek miktarda DNA’ya sahip yüksek yük örnekleri, DNA’yı tamamen çıkarmak için iki kat DNase enzimi gerektirebilir. Neyse ki, yüksek basilleryük örneklerinde, az miktarda DNA’nın varlığı RNA’dan kaynaklanan sonucu etkileme olasılığı daha düşüktür. Ribozomal RNA, TB-MBLA hedef, doğal dna37iki katı miktarda oluşur. PCR’de, PCR reaktiflerini eritmek için kullanılan su olan bir şablon kontrolü (NTC), eksojen DNA veya RNA ile çapraz kontaminasyon için kontrol eder. NTC’deki olumlu bir sinyal çapraz kontaminasyon ve geçersiz kabul edilen sonucu ima eder. Bu, bu su kullanılarak oluşturulan tüm çözeltilerin atılması ve taze bir su şişesi kullanılarak yenilerinin üretilmesi gerektiği anlamına gelir. Tüm suyun kirlenmesini önlemek için PCR suyunu niçin ayrı ayrı tutmanı tavsiye edilir. PCR’nin genel verimliliğini kontrol etmek için pozitif kontrol (Mtb RNA) kullanılır.
Sonuç analizi, STANDART eğriyi kullanarak PCR Cq’ların bakteriyel yüke (yani mL başına tahmini koloni şekillendirme ünitelerine) dönüştürülmesini içerir. Standart eğrinin ayarlanması ve optimize edilmesi bu adım için çok önemlidir. Standart eğri verimliliği 0.95-1 önerilir. MTb ve ekstraksiyon kontrolü için standart eğriler, hastalar veya diğer test numuneleri makinede çalıştırılmadan önce kurulmalı ve optimize edilmelidir. Standart numuneler TB-MBLA kiti ile birlikte verilir. PCR için RNA ekstresinin on kat seyreltilmesi önerilir. Bu, mL başına nihai bakteriyel yük sonucunu elde etmek için bakteriyel yük sonucunun 10 faktörle çarpılması gerektiği anlamına gelir. 30’un üzerindeki Cq’ların TB-MBLA için negatif kabul edilir. Tedavi yanıtı üzerinde bir çıkarım yapmak için farklı zaman noktalarında ölçülen en az iki prospektif bakteriyel yük sonuçları gereklidir. Tedaviye başlamadan önce iki sonuçtan birinin temel olması kuvvetle tavsiye edilir. Ancak, hasta ya da tedavinin ortasında bakteriyel yük değerlendirmesi başlatılırsa, tedavi yanıtını değerlendirmek için ikinci bir zaman noktası bakteriyel yük ölçümü yapılmalıdır. TB-MBLA tedavi de 3 günlük bir alanda bakteriyel yük ayırt edebilirsiniz ama ideal iki bakteriyel yük ölçümleri 7 gün arayla alınan.
Protokol tedavi yanıtı için bilgilendirici kantitatif sonuçlar üretirken, hala büyük ölçüde manuel dir ve RNA ekstraksiyonu için zamanında önemli eller talep eder. Meşgul laboratuvarlarda Teknisyenler bu kez olmayabilir. RNA çıkarma ve PCR işlemlerini otomatikleştirmek için düzenlemeler devam etmektedir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çalışma, Avrupa ve Gelişmekte Olan Ülkeler Klinik Deneyler Ortaklığı (EDCTP) – Pan Afrika Biyomarker Genişletme programı (PanBIOME) hibeS.2011.41304.008’den gelen finansman la mümkün kılındı. Destek de Üniversitesi St Andrews Tıp Fakültesi araştırma hibe elde edildi. Bu makalenin ve TB-MBLA protokolünün görsel bir kaynak olarak yayınlanması, İskoç Finansman Konseyi ve Küresel Zorluklar Araştırma Fonu’ndan St Andrews Üniversitesi’ne yapılan fonla mümkün kılınmıştır. Klinik balgam örnekleri sağlayan Maputo Maternal hastanesi ve Mavalane Sağlık Merkezi ve klinik balgam örneklerinin ısı inaktivasyon deneylerine yardımcı olan Maputo Tuberculosis Tedavi Birimi ekibi sayesinde.
Materials
| Heat inactivation: | |||
| 15 mL Centrifuge tubes | Fisher-Scientific | 10136120 | 50 mL tubes may be used if larger sample volumes are involved |
| 15 mL Wire Tube rack | Fisher-Scientific | 11749128 | Other brands with similar make can be used |
| Water bath | Fisher-Scientific | 15700619 | Other brands with similar make can be used |
| RNA extraction: | |||
| Chloroform | Sigma | 372978-1L | Not necessary in other RNA extraction kit brands |
| Ethanol, absolute 99-100% | Sigma | 51976-500ML-F | Larger volume available |
| Extraction control | SOI group St Andrews | VitalbacteriaEC | Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit |
| FASTRNA Pro blue Kit | MP Biomedicals | 116025050 | Supplied with lysing matrix tubes |
| Molecular grade water (RNase free) | Sigma | W4502-1L | Qiagen, Fisherscientific can also supply same product |
| Precellys 24 homogeniser | VWR | 432-3750 | FastPrep MP Biomedicals can be used too |
| Refrigerated micro-centrifuge, Fresco 21, Heraeus | Fisher-Scientific | 15352117 | Other brands with similar capacity can be used |
| Thermomixer | Eppendorf | BLD-455-010C | Works with 1-2 mL tubes |
| TURBO DNA-free | Fisher-Scientific | AM1907M | Takes longer but more effective than shorter DNA removal procedures. |
| RT-qPCR: | |||
| Primers and Taqman probes | SOI group St Andrews | VitalbacteriaPP | Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit. Probe fluorophores are FAM (green) for Mtb and HEX (yellow) for Extraction control (EC). Applied Biosystems qPCR platforms use VIC instead of HEX. |
| QuantiTect Multiplex RT-PCR NR Kit | Qiagen | 204845 | PCR mix plus the RT enzyme |
| RotorGene Q 5plex machine | Qiagen | 9001580 | Other qPCR machines: Vii7, Quantistudio, Steponelus etc can be used |
| Strip Tubes and Caps, 0.1 ml | Qiagen | 981103 | Other tube sizes available depending on the rotor size. For other PCR platforms 96 well PCR plates are needed. |
| Non-heat inactivation Sample preservation materials | |||
| 1M Tris-HCl pH 7.5 | Sigma | 93313 | Supplied ready to use |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | 63689 | Many competent suppliers |
| Guanidine thiocyanate (GTC) | Promega | V2791 | Promega brand recommended for quality |
| Molecular grade water (RNase free) | Sigma | W4502-1L | Ensures that GTC solution is free of nucleases |
| General materials (used but not specific to TB-MBLA) | |||
| 500 mL plastic containers | 734-5087 | Nalgene brand recommeded | |
| Biological waste discard jars | Many competent suppliers | ||
| Chemical waste discard jars | Many competent suppliers | ||
| Disposable gloves, chemical resistant | Many competent suppliers | ||
| Freezer (-20 °C) | Many competent suppliers | ||
| Freezer (-80 °C) | Many competent suppliers | ||
| Fridge (0-8 °C) | Many competent suppliers | ||
| Fume hood | For safe handling of toxic reagents | ||
| Laboratory scales | For accurate measurement of reagents | ||
| Measuring cylinders, plastic | To ensure accurate measurement of reagents | ||
| PCR reaction tubes | Should be suitable to the PCR instrument used | ||
| Pipettes and matching sterile filtered pipette tips, | DNAse and RNAse-free, range: P1000, P200, P10, P2 recommended | ||
| Qiagility loading plates | Qiagen | 5-well master mix plate, 16-well reagent plate, 32-well sample plate, 72-well and 96-well reaction plates | |
| QIAgility Pipetting Robot | Qiagen | Important for high throughput pipetting | |
| Racks for 1.5 mL and 2 mL microtubes and for 15 mL and 50 mL Falcon tubes | Chemical-resistant and autoclavable recommended | ||
| RNase Away (Removes RNases enzymes from working space) | Fisher Scientific | 10666421 | Important to ensure services and devices are free from RNase enzyme |
| Safety goggles, chemical resistant | Fisher Scientific | Can also be got from Sigma. Protect eyes from toxic reagents. | |
| Sterile Pasteur pipettes, 1.5 mL – 3 mL | Many competent suppliers | ||
| Sterile RNAse-free microtubes | 1.5 mL tubes suitable for freezing at -80 °C recommended | ||
| TB disinfectant, e.g. Tristel Fuse | Ensure it is freshly prepared or prepared within a week | ||
| Vortex | Genie 2 brand recommended | ||
| Transmission electron microscopy | |||
| Glutaldehyde (8%) | Sigma | G7526-10ML | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
| HEPES (pH 7.4, 100 mM) | Sigma | H4034-25G | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
| Leica FCS ultracryo | Leica | Cryomicrotome for tissue sectioning | |
| Methyl cellulose | Agar Scientific | AGG6425 | Cold mounting resin |
| Paraformaldehyde (4% in PBS) | Sigma | P6148-500G | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
| Sucrose | Sigma | 84097-250G | Preservation and mounting medium |
| Uranyl acetate | Agar Scientific | AGR1260A | Universal Electron microscopy stain |
References
- World Health Organization. END TB Global Tuberculosis Report 2017. World Health Organization. , (2017).
- World Health Organization. Global tuberculosis report 2018. World Health Organization. , (2018).
- World Health Organization. TB Elimination in Low-Incidence Countries. World Health Organization. , (2014).
- Boehme, C. C., et al. diagnostic accuracy, and effectiveness of decentralised use of the Xpert MTB/RIF test for diagnosis of tuberculosis and multidrug resistance: a multicentre implementation study. The Lancet. 377, 1495-1505 (2011).
- World Health Organization. Xpert MTB/RIF assay for the diagnosis of pulmonary and extrapulmonary TB in adults and children. World Health Organization. , (2010).
- Friedrich, S. O., et al. Assessment of the sensitivity and specificity of Xpert MTB/RIF assay as an early sputum biomarker of response to tuberculosis treatment. The Lancet Respiratory Medicine. 1, 462-470 (2013).
- Desjardin, L. E., et al. Measurement of Sputum Mycobacterium tuberculosis Messenger RNA as a Surrogate for Response to Chemotherapy. American Journal of Respiratory Critical Care Medicine. 160, 203-210 (1999).
- Hellyer, T. J., et al. Detection of Viable Mycobacterium tuberculosis by Reverse Transcriptase-Strand Displacement Amplification of mRNA. Journal of Clinical Microbiology. 37, 518-523 (1999).
- Honeyborne, I., et al. Molecular Bacterial Load Assay , a Culture-Free Biomarker for Rapid and Accurate Quantification of Sputum Mycobacterium tuberculosis Bacillary Load during Treatment. Journal of Clinical Microbiology. 49, 3905-3911 (2011).
- Li, L., et al. Sputum Mycobacterium tuberculosis mRNA as a Marker of Bacteriologic Clearance in Response to Antituberculosis Therapy. Journal of Clinical Microbiology. 48, 46-51 (2010).
- Honeyborne, I., et al. The Molecular Bacterial Load Assay Replaces Solid Culture for Measuring Early Bactericidal Response to Antituberculosis Treatment. Journal of Clinical Microbiology. 52, 3064-3067 (2014).
- Hellyer, T. J., Jardin, L. E. D. E. S., Hehman, G. L., Cave, M. D. Quantitative Analysis of mRNA as a Marker for Viability of Mycobacterium tuberculosis. Journal of Clinical Microbiology. 37, 290-295 (1999).
- Aellen, S., Que, Y., Guignard, B., Haenni, M., Moreillon, P. Detection of Live and Antibiotic-Killed Bacteria by Quantitative Real-Time PCR of Specific Fragments of rRNA. Antimicrobial agents chemotherapy. 50, 1913-1920 (2006).
- Deutscher, M. P. Degradation of RNA in bacteria: Comparison of mRNA and stable RNA. Nucleic Acids Research. 34, 659-666 (2006).
- Gupta, R. K., Srivastava, R. Resuscitation Promoting Factors: A Family of Microbial Proteins in Survival and Resuscitation of Dormant Mycobacteria. Indian Journal of Microbiology. 52, 114-121 (2012).
- Mukamolova, G. V., Turapov, O., Malkin, J., Woltmann, G., Barer, M. R. Resuscitation-promoting factors reveal an occult population of tubercle bacilli in sputum. American Journal of Respiratory Critical Care Medicine. 181, 174-180 (2010).
- Sheridan, G. E. C., Masters, C. I., Shallcross, J. A., Mackey, B. M. Detection of mRNA by Reverse Transcription-PCR as an Indicator of Viability in Escherichia coliCells Detection of mRNA by Reverse Transcription-PCR as an Indicator of Viability in Escherichia coli Cells. Applied Environment Microbiology. 64, 1313-1318 (1998).
- Honeyborne, I., et al. Molecular bacterial load assay, a culture-free biomarker for rapid and accurate quantification of sputum Mycobacterium tuberculosis bacillary load during treatment. Journal of Clinical Microbiology. 49, 3905-3911 (2011).
- Sabiiti, W., et al. Molecular Bacterial Load Assay: a Fast and Accurate Means for Monitoring Tuberculosis Treatment Response. BMJ Global Health. 2, 1-8 (2017).
- Gillespie, H., Stephen, S. W., Oravcova, K., Bishop, A. K. Mybacterial Load Assay. Diagnostic Bacteriology. Methods and Protocols. , 89-105 (2017).
- Juffs, H., Deeth, H. Scientific Evaluation of Pasteurisation for Pathogen Reduction in Milk and Milk Products. Food Standards Australia New Zealand. , (2007).
- Holmes, C. J., Degremont, A., Kubey, W. Effectiveness of Various Chemical Disinfectants versus Cleaning Combined with Heat Disinfection on Pseudomonas Biofi lm. Blood Purification. 22, 461-468 (2004).
- Chedore, P., et al. Method for inactivating and fixing unstained smear preparations of Mycobacterium tuberculosis for improved laboratory safety. Journal of Clinical Microbiology. 40, 4077-4080 (2002).
- Cardoso, C. L., et al. Survival of Tubercle Bacilli in Heat-fixed and Stained Sputum Smears. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 96, 277-280 (2001).
- Doig, C., Seagar, A. L., Watt, B., Forbes, K. J. The efficacy of the heat killing of Mycobacterium tuberculosis. Journal of Clinical Pathology. 55, 778-779 (2002).
- Honeyborne, I., et al. The molecular bacterial load assay replaces solid culture for measuring early bactericidal response to antituberculosis treatment. Journal of Clinical Microbiology. 52, 3064-3067 (2014).
- Sabiiti, W., et al. Heat Inactivation Renders Sputum Safe and Preserves Mycobacterium tuberculosis RNA for Downstream Molecular tests. Journal of Clinical Microbiology. , 1-8 (2019).
- Griffiths, G., McDowall, A., Back, R., Dubochet, J. On the preparation of cryosections for immunocytochemistry. Journal of Ultrasructure Research. 89, 65-78 (1984).
- Kumar, V. G., Urs, T. A., Ranganath, R. R. MPT 64 Antigen detection for Rapid confirmation of M. tuberculosis isolates. BMC Research Notes. 4, 79 (2011).
- Zwadyk, P., Down, J. A., Myers, N., Dey, M. S. Rendering of mycobacteria safe for molecular diagnostic studies and development of a lysis method for strand displacement amplification and PCR. Journal of Clinical Microbiology. 32, 2140-2146 (1994).
- Blackwood, K. S., et al. Viability testing of material derived from Mycobacterium tuberculosis prior to removal from a Containment Level-III Laboratory as part of a Laboratory Risk Assessment Program. BMC Infectious Diseases. 5, 3-9 (2005).
- Somerville, W., Thibert, L., Schwartzman, K., Behr, M. A. Extraction of Mycobacterium tuberculosis DNA: a Question of Contaiment. Journal of Clinical Microbiology. 43, 2996-2997 (2005).
- Bemer-Melchior, P., Drugeon, H. B. Inactivation of Mycobacterium tuberculosis for DNA typing analysis. Journal of Clinical Microbiology. 37, 2350-2351 (1999).
- McKillip, J. L., Jaykus, L. A., Drake, M. rRNA stability in heat killed and UV-irradiated enterotoxigenic Staphylococcus aureus and Escherichia coli O157:H7. Journal of Appied Environmental Microbiology. 64, 4264-4268 (1998).
- Blank, A., Dekker, C. A. Ribonucleases of Human Serum, Urine, Cerebrospinal Fluid, and Leukocytes. Activity Staining following Electrophoresis in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gels. Biochemistry. 20, 2261-2267 (1981).
- O’Leary, T. J. Reducing the impact of endogenous ribonucleases on reverse transcription-PCR assay systems. Clinical Chemistry. 45, 449-450 (1999).
- Yamada, H., Yamaguchi, M., Chikamatsu, K., Aono, A., Mitarai, S. Structome analysis of virulent Mycobacterium tuberculosis, which survives with only 700 ribosomes per 0.1 fl of cytoplasm. PLoS One. 10, 1-14 (2015).
- Yang, K., et al. Structural insights into species-specific features of the ribosome from the human pathogen Mycobacterium tuberculosis. Nucleic Acids Research. 45, 10884-10894 (2017).
