אנו מתארים שחפת בקטריאלי מולקולרית בדיקת שיטת העומס שבוצעה לאחר הפעלת החום של sputum. הפעלת החום מספקת דגימות רוק לא זיהומיות וברור את הצורך הבלימה ברמה 3 מעבדות לבדיקות מולקולריות של שחפת.
שחפת נגרמת על ידי שחפת של פטרת (Mtb), פתוגן המסווגים על ידי האו ם (האו מ) כחומר ביולוגי B קטגוריה מסוכן. למען בטיחות העובדים, טיפול של כל הדגימות המשוער לשאת Mtb חייב להתבצע ברמת הבלימה (CL) 3 מעבדה. מבחן העומס חיידקי מולקולרי של TB (TB-MBLA) הבדיקה היא הפוכה הטרנסקריפטאז תגובת שרשרת פולימראז כמותית (RT-qPCR) מבחן כי כימות עומס Mtb הלסת באמצעות התחל ובדיקות כפולות כפול עבור שנות ה-16 rRNA. אנו מתארים את השימוש בחום הפעלה לעיבוד דגימות TB ללא זיהומיות תוך שמירה על RNA עבור TB-MBLA. 1 mL סדרת מחלקים של דגימת רוק סגור היטב 15 מ ל צינורות צנטריפוגה מבושלים 20 דקות ב 80 ° c, 85 ° c, או 95 ° צ’ כדי להשבית Mtb bacilli. טיפוח החום מופעל ושליטה (חי) דגימות עבור 42 ימים אישר את מותו של שחפת. המדגם מופעל ואז מחודדים עם 100 μL של בקרת החילוץ RNA מופק בעקבות הליך רגיל בידוד RNA. לא נצפתה צמיחה בתרבויות הטיפול בחום. RNA מבודד הוא נתון RT-qPCR בזמן אמת, אשר מגבירה מטרה ספציפית ב-Mtb 16S rRNA גן, מניב תוצאות בצורה של מחזורי כימות (Cq). עקום רגיל משמש כדי לתרגם Cq לתוך עומס חיידקי, או המשוער מושבה היווצרות יחידות ל-mL (eCFU/mL). קיים קשר הפוך בין Cq לבין העומס החיידקי של המדגם. המגבלה היא כי חום ההפעלה lyses כמה תאים, חשיפת RNA ל-RNases כי לגרום לאובדן של < 1 יומן10Ecfu/ml (כלומר, < 10 cfu/ml). מחקרים נוספים יקבעו את היחס של מטופלים נמוכים מאוד העמסה הגורמות תוצאות שליליות שווא בשל הפעלת החום.
נגרמת על ידי שחפת של פטרת (Mtb), מעל 7 x 106 מקרים חדשים של שחפת (TB) מדווחים ברחבי העולם אשר מעל 1 x 106 למותבשנה 1,2.1 כדי להפוך את המגמה, ארגון הבריאות העולמי (מי) השיקה גישה שלוש-עמוד כולל פיתוח כלים יעילים אבחון וטיפול3. מסווג כחומר ביולוגי מסוכן B על ידי האו ם, עבודה עם דגימות משוער חיובי עבור Mtb דורש רמת הבלימה (CL) של 3. מעבדות CL3 יקרות לבנות ולתחזק. כתוצאה מכך, ברוב המדינות יש שירותי תרבות של TB ברמות האזוריות או הלאומיות. משמעות הדבר היא כי מיקרוסקופ הכתם הוא כלי האבחון הזמין ביותר במתקני הבריאות ההיקפית.
יש המבקשים ליישם בדיקות מולקולרית מהירות כמו xpert MTB/ריף ברמה 4 מתקני בריאות, הממוקם בעיקר ברמות המחוז4,5. חלק מהמחוזות גדולים למדי ופחות נגישים לחלק מהאנשים. בזמן שהוא מועיל, Xpert MTB/ריף עובד על ידי גילוי ה-DNA Mtb. ה-DNA היא מולקולה יציבה שתשרוד זמן רב לאחר התאים מתו ולכן הוא לא תקן טוב למדידת תאים קיימא קריטי עבור התגובה טיפול בניטור5,6. RNA מבוססי בחני מציעים חלופה למדידה מדויקת של תאים קיימא7,8,9,10,11,12,13. רנ א קיים במינים שונים של יציבות משתנה: הריבוזוממה RNA (rRNA), העברת RNA (tRNA), ו-RNA שליח (mRNA). RNA מסנג קשור לביטוי הגנים ולכן הקשר הקרוב ביותר לפעילות התאים והכדאיות14. חשוב לציין כי היעדר ביטוי גנטי אינו שווה ערך למוות של תאים, כי פתוגנים כמו Mtb ידועים להתקיים במצב לא פעיל (רדום) אבל מדינות קיימא15,16. יציבה מינים RNA כגון rRNA הם ולכן סמנים טובים יותר של מצבים פעילים ובלתי פעילים של תאים קיימא.
באמצעות es, הכלאיים coli, שרידן הראה כי 16 s rrna באופן פרופורציונלי גדל עם צמיחה בקטריאלי הנמדד על ידי מושבה היוצרים יחידות (cfu) ספירות17. הייתה ירידה בו בספירות CFU ו-16 rRNA כאשר חיידקים E. coli נחשפו אנטיביוטיקה. הנפילה ב rrna לאחר מוות התאים היה אינדיקטור כי ניתן להשתמש בו כסמן עבור הכדאיות התאית13,17. רישום מתוך עיקרון זה, שחפת מולקולרית העמסה בקטריאלי העומס (TB-mbla) פותחה עבור מיקוד M. שחפת 16s rrna כדי למדוד את העומס שחפת קיימא באמצעות הלסת כסמן של תגובת הטיפול עבור חולים נגד שחפת טיפול11,18,19. פיתחנו עוד ואופטימיזציה של TB-MBLA לשלב שליטה החילוץ הסלולר המשקף הליזה של M. שחפת באקל והוא חזק בהגדרות סביבתיות שונות20. ההליך TB-MBLA דורש את הצעדים הראשונים של בידוד RNA מ Mtb להתנהל במעבדה CL3 עד Mtb תאים הם לגמרי להבטיח כדי לוודא את ביטחונם של העובדים. כמו כן, הוא כולל שימור לדוגמה לניתוח רטרוספקטיבי לצורך הטיפול ב-80 ° c בguanidine thiocyanate, חומר רעיל ברמה 4. לצורך זה, השתמשנו בחום כדי השבית Mtb ולהפוך דגימות בטוח עבור TB-mbla להתבצע במעבדות ברמה מיקרוסקופ להכפיש.
השימוש בחום ביישומים מעבדתיים וקליניים כבר במשך מאות שנים21,22. עם זאת, כמה מיקרואורגניזמים כמו Mtb קשה להרוג, וחשיפה קצרה יותר לחום אינו מספיק כדי להרוג את כל התאים23,24. מחקר עולה כי 20 דקות חימום של שחפת התרבויות ב 80 ° c הרג את כל Mtb חיידקים בלי להרוס את הדנ א הדרושים ל-PCR25. לאחר מכן, מספר טכניקות הוצאת DNA מעבדה כיום חום 95 ° c. יש לנו את אותו עיקרון להראות כי הרתיחה דגימות שחפת ב-80 ° c, 85 ° צ’, או 95 ° c מפעיל Mtb תוך שמירה על RNA מספיק עבור TB-MBLA להתבצע. תרבות או רוק ניתן לשמור במיכלים סגורים היטב בטמפרטורת החדר או בקירור במשך 7 ימים מבלי להקטין את כמות rrna.
TB-MBLA, המשמש כיום לשימוש מחקר בלבד (RUO) הבדיקה היא הסתגלות והוחל על סוגים שונים לדוגמה כולל sputum, רקמת ריאות, ונוזל השדרה מוחין. זה עדיין להחיל על ברונכיט מכתשי נוזל, דם, וסוגים אחרים לדוגמה. באמצעות רוק כמו המדגם, תוצאות הערכת ריבוי אתרים באפריקה (נתונים שלא פורסמו) ואת הפרסומים הקודמים18, 26 להראות26 כי הרגישות של mbla הוא עקבי עם מחוון הצמיחה של המחוון הגדילה של פטרת (mgit) נוזלי. עם זאת, TB-MBLA הוא מהיר יותר, מתן תוצאות בשעות בניגוד לימים או שבועות של תרבות, ספציפי, לא מושפע מיקרואורגניזמים שאינם TB במדגם, ונותן מידה כמותית של חומרת המחלה. מי שזיהה לאחרונה TB-MBLA כמועמד להחליף מיקרוסקופ הכתם ותרבות עבור ניטור הטיפול בשחפת2.
במאמר זה אנו מתארים בפירוט את ההפעלה החום ואת TB-MBLA הפרוטוקול שפורסם ב Sabiiti et al.27. פרוטוקול מפורט זה יספק משאב חזותי של עצירה אחת עבור משתמשי TB-MBLA ברחבי העולם.
מאמר זה מראה כי טיפול בחום 20 דקות ב 80 ° c, 85 ° c, ו 95 ° c מפעיל דגימות שחפת ביעילות, מה שמאפשר TB-MBLA להתבצע במתקן non-CL3 ללא סיכון של זיהום לעובדי מעבדה. הממצאים לאשר תצפיות שנעשו במחקרים קודמים תוך מנוגדים עם כמה על האפקטיביות של הפעלת חום של Mtb25,30. לדוגמה, דיווחים מסוימים מצביעים על כך שהחימום ב-80 ° c אינו יעיל בדוגמאות לעומס בלסת גבוהה25,31,32,33. אפקט בצפיפות גבוהה השפעה נמנעה במחקר שלנו על ידי להבטיח כי כל רוק ותרבויות טהור התחממו באמצעי אחסון 1 מ ל 15 שפופרת צנטריפוגה לספק מקום מספיק כדי לחשוף כל חלק של המדגם כדי הרתיחה27.
שימור RNA לאחר הפעלת החום מאפשר שחפת-MBLA להתבצע. זה ממצא לדעה עם שני מחקרים שהפגינו שימור RNA לאחר חום12איון פעלה 12,34. הראנו כי רנ א בדגימות חום המופעל יציב ב 37 ° c עבור 4 ימים, רומז כי מעבדות יכול בדיקות אצווה על ידי שמירה על דגימות מופעלות בטמפרטורת החדר במשך שבוע. על ידי החלת ערכות החילוץ RNA הדורשים קירור או הקפאה, היכולת לשמור על החום דגימות מופעל בטמפרטורת החדר ברור את הצורך הן שרשרת קר, קטגוריה 3 מעבדות לבצע TB-MBLA בהגדרות מוגבלות משאב.
פחות מ-1 עומס בקטריאלי של יומן הרישום אבד באמצעות rRNA 16S כסמן. למרות שהיה הבדל בין מדגם בשידור חי לחום, הכמות שאבדה להפעלת חום קטנה מדי כדי לפגוע בתוצאות הזרם. הגדלת הטמפרטורה לא להגדיל את כמות ה-RNA איבד, רומז כי אובדן נצפתה תלויה בטיפול בחום. טיפול חום בטמפרטורות גבוהות ככל הנראה גורם לפירוק תאים, חשיפת RNA לירידה על ידי RNases. אכן, תוספת אקסוגני של RNase A כדי החום השבר המופעל עלה את שיעור השפלה RNA. רתיחה לא להפחית את הפעילות של RNase, רומז שזה חלבון גמיש מאוד.
חשוב לציין כי השפלה ממוצעת RNA של 1.5 יומן10 ecfu/mL הוא לא אובדן גדול. לשם כך אנו ההשערה כי חימום ליסס חלק קטן של Mtb bacilli, ובכך חשיפת כמות קטנה של RNA כדי RNase. באמצעות TEM הראנו כי מורפולוגיה תא Mtb ויושרה של קירות התא מושפע בקושי על ידי חימום ב 95 ° c. משמעות הדבר היא כי זה עשוי לדרוש גורמים פיזיולוגיים שונים ואספקה מספקת של rnases כגון במחשב המארח לבזות באופן משמעותי RNA35,36. יתר על כן, להיות ריבוחלק מבנית, 16s rrna היא פוטנציאלית פחות רגישים rnase37,38. תא Mtb יחיד מכיל ~ 700 ריבוזומים/0.1 מ”מ3 של ציטופלסמה37, רומז כי יש כמויות גבוהות יותר של rrna לכל תא. כך, כמויות קטנות יותר של RNase עשוי להיות השפעה קטנה יותר38. קיומו של מספר גבוה של ריבוזומים נותן יתרון ל-TB-MBLA במונחים של רגישות ויכולת לזהות נטל נמוך שחפת חולים.
היה מתאם חזק בין עומס חיידקי שנמדד על ידי TB-MBLA ו MGIT התרבות של מיגית טרומבוציטופניה. זה מאשר את עומס חיידקי כמו הנהג של התרבות חיוביות במידה מסוימת. עם זאת, היתרון של TB-MBLA הוא שזה ישירות לכמת טען בלסת הנוכחית נוכח המדגם ואינו דורש התפשטות התא Mtb לפני האיתור. זה ניגודים עם התרבות אשר הזמן לחיוביות תלוי ברמה של עומס חיידקי ושיעור של התפשטות התא Mtb. מחקרים עתידיים יעריכו את זרימת העבודה של TB-MBLA, כולל הפעלת חום, במסגרות קליניות שגרתיות. המחקר יהיה גם לחקור דגימות עם מגוון של המון חיידקים כדי להבין את המספר שעשוי להשתנות מחיובי לשלילי (כלומר, אלה עם פחות חיידקים לאחר הפעלת החום).
הפרוטוקול TB-MBLA לקוונפיקציה מולקולרית של עומס חיידקי הוא הראשון מסוגו בתוך בדיקות. השיטה מכמת באופן ישיר את העומס Mtb הלסת מפני המטופל החולה ולא דורש שום תרבות לעשות זאת. זה עושה את זה מהר יותר ומגביר את הפוטנציאל שלה כדי להודיע על החלטה קלינית על התקדמות המטופל. שלב הפעלת החום מפחית את הסיכון של זיהום ומגביר את הישימות של TB-MBLA בהגדרות שאין להם קטגוריה 3 מעבדה. לאחר הפעלת החום של המדגם, ישנם שלושה שלבי הפרוטוקול כדי להשיג TB-MBLA תוצאות: חילוץ RNA, היפוך הטרנסקריפטאז (RT)-qPCR, ו qPCR ניתוח תוצאות.
ככל שהיעילות של בידוד Mtb RNA ממדגם מטופל, גבוהה יותר איכות התוצאות. חשוב לציין כי האיכות של המדגם רוק משפיע על כמות ה-RNA מבודדים. לדוגמה, רוק הרוק נחשב באיכות נמוכה והוא נקשר עם עומס בלסת נמוכה. משמעות הדבר היא כי אימון החולה לצפות באיכות מצפה הרוק חשוב. כדי להעריך את היעילות של תהליך החילוץ, בקרת החילוץ (כלומר, המספר הידוע של תאים שאינם Mtb) הוא זינק לתוך המדגם לפני חילוץ RNA. החזרת בקרת החילוץ מאשרת את היעילות של תהליך הפקת ה-RNA. תהליך בידוד ה-RNA אינו יכול להיות חוקי אלא אם כן בקרת החילוץ אוחזרו. בהתחשב בעובדה כי Mtb הוא אורגניזם גמיש גורם לפירוק מכני חלק מכריע בתהליך. הומוגון של המדגם במהירות גבוהה (600 rpm) בנוכחות חרוזים (כלומר, ליסינג מטריצה) ביעילות לסדר את התאים. טיהור ליפוסט מניב תמצית המכילה גם RNA ו-DNA. הסרת ה-DNA היא הצעד האחרון המכריע של חילוץ RNA. TB-MBLA שואפת למדוד ברולה קיימא על ידי כימות RNA. כך, כישלון להסיר דנ א גנומית פירושו כי התוצאות יהיה אות מן ה-DNA, וזה לא סמן טוב עבור הכדאיות התא6.
ה-RT-qPCR הוא דופלקס המפעיל בדיקה כפולה לMtb ושליטה בחילוץ. זה כולל שלושה צעדים: 30 דקות היפוך שעתוק על ידי היפוך הטרנססקריפט ב 50 ° c, 15 דקות דנטורציה ב 95 ° c, ו 40 מחזורי הגברה בשעה 94 ° c ו-60 ° c. רכישת קרינה מהגששים מתרחשת ב-60 ° צ’ (כלומר, שלב התארכות הקטע). חשוב לציין כי TB-MBLA כבר אופטימיזציה באמצעות מכונת qPCR מסוים, כך אופרטורים באמצעות פלטפורמות qPCR אחרים צריך למטב את התנאים עבור הציוד שלהם. היעילות של הסרת DNA נשלטת על ידי הפעלת תגובה אחת לכל מדגם בהעדר RT. תוצאה חיובית מתגובה זו מרמזת על הסרה לא מלאה של דנ א. דגימות נטל גבוה כי יש כמויות גבוהות של דנ א עשוי לדרוש כפול כמות האנזים DNase כדי להסיר לחלוטין DNA. למרבה המזל, בדגימות עומס גבוה של הלסת העליונה, הנוכחות של כמויות קטנות של דנ א סביר פחות להשפיע על התוצאה של RNA. רנ א ריבוזומיום, היעד TB-MBLA, באופן טבעי מתרחשת כפול כמות ה-DNA37. ב-PCR, אין בקרת תבנית (NTC), שהיא המים המשמשים לפזר את הריאגנטים PCR, שולטת עבור זיהום צולב עם DNA אקסוגני או RNA. אות חיובי ב-NTC מרמז על זיהום צולב והתוצאה נחשבת לבלתי חוקית. משמעות הדבר היא שכל הפתרונות היוו שימוש במים אלה צריך להיות מושלך וחדשים שנעשו באמצעות בקבוקון טרי של מים. מומלץ לשמור על המים של ה-PCR באמצעות שומרים נפרדים כדי למנוע זיהום של כל המים. שליטה חיובית (Mtb RNA) משמשת לשליטה ביעילות הכוללת של ה-PCR.
ניתוח תוצאות כרוך ההמרה של PCR Cqs לתוך עומס חיידקי (כלומר, המושבה המשוער להרכיב יחידות ל-mL) באמצעות עקומת רגיל. הגדרה ואופטימיזציה של העקומה הסטנדרטית היא חיונית לשלב זה. מומלץ לעשות יעילות בעקומה רגילה של 0.95 – 1. עקומות סטנדרטיות עבור MTb ובקרת החילוץ צריך להיות מוגדר אופטימיזציה לפני חולים או דגימות בדיקה אחרות מופעל במחשב. דגימות סטנדרטיות מסופקות עם ערכת TB-MBLA. דילול של 10 מקפלים של תמצית RNA מומלצת ל-PCR. זה מרמז כי תוצאת עומס חיידקי צריך להיות מוכפל על ידי גורם של 10 כדי להשיג את תוצאת העומס החיידקי הסופי לכל mL. חשוב לציין כי Cqs מעל 30 נחשבים שליליים עבור TB-MBLA. מינימום של שני תוצאות עומס בקטריאלי פוטנציאליים נמדד בנקודות זמן שונות נדרש לעשות היסק על תגובת הטיפול. מומלץ מאוד שאחת משתי התוצאות צריכה להיות בסיסית, לפני תחילת הטיפול. עם זאת, אם החולה יזמה הערכת עומס חיידקי מתרחשת באמצע דרך הטיפול, יש להיות נקודת זמן השנייה עומס חיידקי להעריך את תגובת הטיפול. TB-MBLA יכול להבחין עומס חיידקי בחלל של 3 ימים על הטיפול אבל האידיאל הוא שני מדידות עומס בקטריאלי נלקח 7 ימים בנפרד.
בעוד הפרוטוקול מייצר תוצאות כמותיים אינפורמטיבי לתגובה לטיפול, זה עדיין בעיקר ידני ודורש ידיים משמעותיות בזמן להפקת RNA. ייתכן שהפעם לא תהיה לטכנאים במעבדות עסוקות. סידורים מתבצעת כדי להפוך את תהליכי החילוץ והPCR של RNA.
The authors have nothing to disclose.
המחקר נעשה אפשרי על ידי מימון ממדינות אירופה ומדינות מתפתחות ניסויים קליניים שותפות (EDCTP) – פאן אפריקה ביוארקר הרחבה תוכנית (PanBIOME) גרנט SP. 2011.41304.008. התמיכה הושגה גם באוניברסיטת סנט אנדרוז בית הספר לרפואה של מלגת מחקר. הפרסום של כתב יד זה ופרוטוקול TB-MBLA כמשאב חזותי התאפשר על ידי המימון ממועצת המימון הסקוטית וקרן המחקר העולמי אתגרים לאוניברסיטת סנט אנדרוז. תודות בית החולים מאפואל אימהית מרכז הבריאות Mavalane אשר סיפק את דגימות הרוק הקליני, ואת יחידת הטיפול מאפול שחפת הצוות שעזר עם החום ניסויים הפעלה של דגימות ליחה קלינית.
Heat inactivation: | |||
15 mL Centrifuge tubes | Fisher-Scientific | 10136120 | 50 mL tubes may be used if larger sample volumes are involved |
15 mL Wire Tube rack | Fisher-Scientific | 11749128 | Other brands with similar make can be used |
Water bath | Fisher-Scientific | 15700619 | Other brands with similar make can be used |
RNA extraction: | |||
Chloroform | Sigma | 372978-1L | Not necessary in other RNA extraction kit brands |
Ethanol, absolute 99-100% | Sigma | 51976-500ML-F | Larger volume available |
Extraction control | SOI group St Andrews | VitalbacteriaEC | Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit |
FASTRNA Pro blue Kit | MP Biomedicals | 116025050 | Supplied with lysing matrix tubes |
Molecular grade water (RNase free) | Sigma | W4502-1L | Qiagen, Fisherscientific can also supply same product |
Precellys 24 homogeniser | VWR | 432-3750 | FastPrep MP Biomedicals can be used too |
Refrigerated micro-centrifuge, Fresco 21, Heraeus | Fisher-Scientific | 15352117 | Other brands with similar capacity can be used |
Thermomixer | Eppendorf | BLD-455-010C | Works with 1-2 mL tubes |
TURBO DNA-free | Fisher-Scientific | AM1907M | Takes longer but more effective than shorter DNA removal procedures. |
RT-qPCR: | |||
Primers and Taqman probes | SOI group St Andrews | VitalbacteriaPP | Supplied with the TB-MBLA Vitalbacteria kit. Probe fluorophores are FAM (green) for Mtb and HEX (yellow) for Extraction control (EC). Applied Biosystems qPCR platforms use VIC instead of HEX. |
QuantiTect Multiplex RT-PCR NR Kit | Qiagen | 204845 | PCR mix plus the RT enzyme |
RotorGene Q 5plex machine | Qiagen | 9001580 | Other qPCR machines: Vii7, Quantistudio, Steponelus etc can be used |
Strip Tubes and Caps, 0.1 ml | Qiagen | 981103 | Other tube sizes available depending on the rotor size. For other PCR platforms 96 well PCR plates are needed. |
Non-heat inactivation Sample preservation materials | |||
1M Tris-HCl pH 7.5 | Sigma | 93313 | Supplied ready to use |
2-Mercaptoethanol | Sigma | 63689 | Many competent suppliers |
Guanidine thiocyanate (GTC) | Promega | V2791 | Promega brand recommended for quality |
Molecular grade water (RNase free) | Sigma | W4502-1L | Ensures that GTC solution is free of nucleases |
General materials (used but not specific to TB-MBLA) | |||
500 mL plastic containers | 734-5087 | Nalgene brand recommeded | |
Biological waste discard jars | Many competent suppliers | ||
Chemical waste discard jars | Many competent suppliers | ||
Disposable gloves, chemical resistant | Many competent suppliers | ||
Freezer (-20 °C) | Many competent suppliers | ||
Freezer (-80 °C) | Many competent suppliers | ||
Fridge (0-8 °C) | Many competent suppliers | ||
Fume hood | For safe handling of toxic reagents | ||
Laboratory scales | For accurate measurement of reagents | ||
Measuring cylinders, plastic | To ensure accurate measurement of reagents | ||
PCR reaction tubes | Should be suitable to the PCR instrument used | ||
Pipettes and matching sterile filtered pipette tips, | DNAse and RNAse-free, range: P1000, P200, P10, P2 recommended | ||
Qiagility loading plates | Qiagen | 5-well master mix plate, 16-well reagent plate, 32-well sample plate, 72-well and 96-well reaction plates | |
QIAgility Pipetting Robot | Qiagen | Important for high throughput pipetting | |
Racks for 1.5 mL and 2 mL microtubes and for 15 mL and 50 mL Falcon tubes | Chemical-resistant and autoclavable recommended | ||
RNase Away (Removes RNases enzymes from working space) | Fisher Scientific | 10666421 | Important to ensure services and devices are free from RNase enzyme |
Safety goggles, chemical resistant | Fisher Scientific | Can also be got from Sigma. Protect eyes from toxic reagents. | |
Sterile Pasteur pipettes, 1.5 mL – 3 mL | Many competent suppliers | ||
Sterile RNAse-free microtubes | 1.5 mL tubes suitable for freezing at -80 °C recommended | ||
TB disinfectant, e.g. Tristel Fuse | Ensure it is freshly prepared or prepared within a week | ||
Vortex | Genie 2 brand recommended | ||
Transmission electron microscopy | |||
Glutaldehyde (8%) | Sigma | G7526-10ML | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
HEPES (pH 7.4, 100 mM) | Sigma | H4034-25G | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
Leica FCS ultracryo | Leica | Cryomicrotome for tissue sectioning | |
Methyl cellulose | Agar Scientific | AGG6425 | Cold mounting resin |
Paraformaldehyde (4% in PBS) | Sigma | P6148-500G | Part of the Cell fixation buffer (HEPES buffer) |
Sucrose | Sigma | 84097-250G | Preservation and mounting medium |
Uranyl acetate | Agar Scientific | AGR1260A | Universal Electron microscopy stain |