בידוד ותרבות של והעושות, טרוליר, ושדרה מוטוריים נוירונים מ בטרום לידתי : עכברים הטרנסגניים
Summary
עבודה זו מציגה פרוטוקול להניב התרבויות תאים הומוגנית של מנוע התנועה הראשוני, trochlear, ומנועי השדרה נוירונים. תרבויות אלה ניתן להשתמש לניתוחים השוואתיים של מורפולוגית, תאית, מולקולרית, ו אלקטרופיזיולוגיה המאפיינים של נוירונים מנוע העינית השדרה.
Abstract
מניע הנוירונים (CN3s) ו עצב סליל נוירונים (CN4s) התערוכה התנגדות יוצאת דופן למחלות ניווניות מוטוריים מנוע כגון טרשת נפוצה amyotrophic (ALS) כאשר לעומת נוירונים מנוע השדרה (smns). היכולת לבודד את העכבר הראשי CN3s, CN4s ו-SMNs יספק גישה למנגנוני לימוד המשמשים את הפגיעות הסלקטיבית. עד היום, רוב הפרוטוקולים משתמשים בתרביות תאים הטרוגנית, שיכולות לבלבל את הפרשנות של תוצאות נסיוניות. כדי למזער את הבעיות הקשורות לאוכלוסיות מעורבות של תאים, תרבויות טהורות הן חיוניות. כאן, הפרוטוקול הראשון מתאר בפרוטרוט כיצד לטהר ביעילות ולטפח CN3s/CN4s לצד SMNs מקבילים מאותם עוברים באמצעות היום העובריים 11.5 (E 18.5) איי: העוברים העכבר הטרנסגניים gfp . הפרוטוקול מספק פרטים על ניתוח והדיסוציאציה של רקמות, בידוד התא מבוסס FACS, ובטיפוח מחוץ גופית של תאים מ CN3/CN4 ו-SMN גרעיני. פרוטוקול זה מוסיף רומן במערכת התרבות CN3/CN4 מתורבת לפרוטוקולים קיימים ובמקביל מספק תרבות SMN טהורה של מינים וגילאים בהתאמה להשוואה. ניתוח התמקדות במאפיינים מורפולוגיים, סלולר, מולקולריים ואלקטרופיסיולוגיים של נוירונים מוטוריים הם אפשריים במערכת זו תרבות. פרוטוקול זה יאפשר מחקר לתוך המנגנונים המגדירים את פיתוח תא העצב המוטורי, פגיעות סלקטיבית ומחלות.
Introduction
התרבות של הנוירונים המוטוריים העיקרי הוא כלי רב עוצמה אשר מאפשר את המחקר של התפתחות עצבית, תפקוד, ורגישות לטרדוגני. תרביות נוירונים מוטוריים שימושיים במיוחד לחקר מחלות ניווניות כגון טרשת amyotrophic לרוחב (ALS)1,2, אשר מנגנוני המחלות שלהם מובנים לחלוטין. מעניין, למרות מוות משמעותי התא של נוירונים מנוע השדרה (smns) בשני als חולים ו als מודל עכברים, מוות תאים בנוירונים (CN3s) ו עצב סליל נוירונים (CN4s) הם נדירים יחסית1,3,4,5,6,7,8,9. לפיכך, ניתוח השוואתי של תרבויות טהורות של CN3s/CN4s ו-SMNs יכול לספק רמזים חשובים לגבי מנגנונים בעלי פגיעות יחסית. למרבה הצער, מכשול גדול לניתוחים כאלה כבר חוסר יכולת לצמוח תרבויות מטוהרים של אלה נוירונים מוטוריים.
פרוטוקולים רבים תוארו לטיהור של SMNs מדגמי בעלי חיים. רוב הפרוטוקולים הללו משתמשים בדחיסות מעבר הצבע צנטריפוגה10,11,12 ו/או p75ntr-נוגדנים מבוססי-מיון-הנוגדן טכניקות13,14,15,16. צפיפות מעבר הצבע צנטריפוגה לנצל את הגודל הגדול של SMNs יחסית לתאי השדרה האחרים, בעוד p75Ntr הוא חלבון מתוך מסחטות מבוטא בלעדית על ידי smns בחוט השדרה. כמעט 100% התרביות smn טהור נוצרו על ידי אחד או שניהם פרוטוקולים11,12,14. עם זאת, פרוטוקולים אלה לא הצליחו ביצירת CN3/CN4 בתרבויות משום שCN3s/CN4s אינם מבטאים p75Ntrוסמנים CN3/CN4 ספציפיים אחרים לא זוהו. הם גם קטנים יותר SMNs, ולכן, קשה יותר לבודד בהתבסס על גודל. במקום זאת, במחקרים חוץ גופית של CN3s או CN4s הסתמך על הנתק17,18,19,20,21, לחקור17,22,23,24,25,26, ו פרוסה27,28 התרבויות, אשר מורכב סוגי תאים הטרוגנית, ולא קיימים פרוטוקולים עבור ה בידוד ותרבות של CN3s ראשי או CN4s.
כאן, פרוטוקול מתואר עבור ההדמיה, בידוד, טיהור, וטיפוח של CN3s, CN4s, ו SMNs מאותו יום עובריים 11.5 (E 11.5) איי: העכברים gfp הטרנסגניים29 (איור 1, איור 2א). איי. איי. אם : gfp במיוחד לתוויות נוירונים מוטוריים עם gfp מקומי המונע את קרום התא. פרוטוקול זה מאפשר למינים-ולגיל השוואה בין סוגים מרובים של נוירונים מוטוריים כדי להבהיר מנגנונים פתולוגיים במחלת העצב המוטורי.
Protocol
Representative Results
Discussion
היסטורית, במחקרים חוץ גופית של CN3 ו/או נוירונים מוטוריים CN4 הסתמך על תרבויות הטרוגנית כגון הנתק17,18,19,20,21, לחקור17,22,23,24,<sup class="x…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לבריז פטימן (ביוגן, קיימברידג ‘, MA, ארה ב) להוראה בשיטות הניתוח של SMN; דנה פרבר סרטן המכון זרימה Cy, מתקן לטיפול באימונולוגיה, מתקן המחקר של החטיבה לרפואה של הרווארד, מרכז הסוכרת של חוסה ליבה cy, ובריגהם ובית החולים לנשים הארגון cy, ובוסטון החולים לילדים זרימה cy, מחקר מתקן לבידוד FACS של נוירונים מוטוריים ראשי; א. א. נוג’נט, א. צ. טניי, א. י., א סמולר נגוין, M.F. רוז, מעבדה נוספת Engle, ו-Project ALS הקונסורציום חברים לסיוע טכני ודיון מתחשב. מחקר זה נתמך על ידי Project ALS. בנוסף, ממומן על ידי קרן לב יפן/באייר יאקוהין מחקר מענק בחו ל ומענק הכשרה NIH בגנטיקה T32 GM007748; ג’יג’י נתמכת על ידי תוכנית ההכשרה של NIH/ניי בבסיסים המולקולריים של מחלות עיניים (5T32EY007145-16) דרך מכון מחקר עין של שיעטים ועל ידי הכשרה נוירולוגיה התפתחותית תוכנית מלגת פוסט דוקטורט (5T32EY007145-19) דרך בית החולים לילדים של בוסטון; M. C. W היה נתמך על ידי בני (5K08EY027850) והילדים של בית החולים לרפואת עיניים (פרס דיסקברי הפקולטה); ו-E.C.E. הוא חוקר מכון רפואי הווארד יוז.
Materials
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | 1:400 |
| Alexa Fluor 594-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11072 | 1:400 |
| B27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| BD FACSAria llu SORP Flow Cytometer | BD Bioscience | – | This has 4 laser system equipped with 405, 488, 594, and 640 nm lasers. |
| BD Falcon 70μm Nylon Cell Strainers | CORNING | 352350 | For filtering the dissociating cells before FACS. |
| BD Falcon Round Bottom Test Tubes With Snap Cap | CORNING | 352054 | |
| BDNF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-207 | |
| Cell Culture microplate, 96 well, PS, F-bottom (Chimney Well) | Greiner Bio-One International | 655090 | We tried multiple 96-well dishes and this was the best one for culture and analyses after ICC |
| Circular Cover Glasses for microscopy | Karl Hecht & Assistent | 1001/14 | We used this coverslip since the area was large (diamater: 14 mm). |
| CNTF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-272 | |
| Cyclopiazonic acid from Penicillium cyclopium | Sigma-Aldrich | C1530 | CPA. One of ER stressors. |
| 4′,6-diamidino-2-phenylinodole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | DMSO |
| Dumont #5 Forceps Inox Tip Size .05 x .01 mm Biologie Tips | Roboz Surgical Instrument | RS-5015 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | BP25205 | |
| GDNF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-305 | |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14175-095 | |
| Hibernate E | BrainBits | HE | |
| Hibernate E low fluorescence | BrainBits | HELF | Fluorescence which hinders observation of embryo's GFP expressions should be low. |
| Horse serum, heat inactivated, New Zealand origin | Thermo Fisher Scientific | 26050-070 | |
| IBMX | Tocris Cookson | 2845 | Isobutylmethylxanthine |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017-015 | |
| Leibovitz’s L15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5913 | |
| Micro Knife 4.75" 1.7 x 27 mm blade | Roboz Surgical Instrument | RS-6272 | |
| Moria Mini Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | |
| mouse monoclonal antibody to neuronal class III β-tubulin (TUBB3) | BioLegend | 801202 | 1:500, TUJ1 |
| Nikon Perfect Focus Eclipse Ti live cell fluorescence microscope and Elements software | Nikon | – | Differential interference contrast images and immunocytochemistry images of the cell cultures were captured with these equipments |
| Nitric Acid 90%, Fuming (Certified ACS) | Fisher Scientific | A202-212 | For rinsing coverslips |
| Olympus 1.7ml Microtubes, Clear | Genesee Scientific | 22-281 | These are the tubes that we described "1.7 mL microcentrifuge tubes" in the context. |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corp | LK003150 | Papain solution and alubumin-ovomucoid inhibitor solution are prepared from this kit. |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Poly D-lysin (PDL) | MilliporeSigma | A-003-E | |
| rabbit monoclonal antibody to Islet1 | Abcam | ab109517 | 1:200 |
| SMZ18 and SMZ1500 zoom stereomicroscopes with DS-Ri1 camera | Nikon | – | Dissection was performed and images of dissected embryos and tissues are captured under these fluorescence microscopes. |
| Sylgard 170 Black Silicone Encapsulant – A+B 0.9 Kg kit | Dow Corning | 1696157 | We make dissection dishes using this kit. |
| TC treated Dishes, 100 x 20 mm | Genesee Scientific | 25-202 | We make dissection dishes using this dish. |
| Thum Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz Surgical Instrument | RS-8100 | |
| Transducer for LOGOQ e VET | GE Healthcare | L8-18i-RS | For ultrasound on female mice |
| Veterinary ultrasound machine | GE Healthcare | LOGOQ e VET | For ultrasound on female mice |
| Zeiss LSM 700 series laser scanning confocal microscope and Zen Software | Carl Zeiss | – | Confocal image of the embryo was captured with these equipments |
References
- Kiernan, M. C., et al. Amyotrophic lateral sclerosis. Lancet. 377 (9769), 942-955 (2011).
- Wood-Allum, C., Shaw, P. J. Motor neurone disease: a practical update on diagnosis and management. Clinical Medicine (London, England). 10 (3), 252-258 (2010).
- Nijssen, J., ComLey, L. H., Hedlund, E. Motor neuron vulnerability and resistance in amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathologica. 133 (6), 863-885 (2017).
- Gizzi, M., DiRocco, A., Sivak, M., Cohen, B. Ocular motor function in motor neuron disease. Neurology. 42 (5), 1037-1046 (1992).
- Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annual Review of Neuroscience. 33, 409-440 (2010).
- Nimchinsky, E. A., et al. Differential vulnerability of oculomotor, facial, and hypoglossal nuclei in G86R superoxide dismutase transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 416 (1), 112-125 (2000).
- Angenstein, F., et al. Age-dependent changes in MRI of motor brain stem nuclei in a mouse model of ALS. Neuroreport. 15 (14), 2271-2274 (2004).
- Niessen, H. G., et al. In vivo quantification of spinal and bulbar motor neuron degeneration in the G93A-SOD1 transgenic mouse model of ALS by T2 relaxation time and apparent diffusion coefficient. Experimental Neurology. 201 (2), 293-300 (2006).
- Spiller, K. J., et al. Selective Motor Neuron Resistance and Recovery in a New Inducible Mouse Model of TDP-43 Proteinopathy. The Journal of Neuroscience. 36 (29), 7707-7717 (2016).
- Graham, J. M. Isolation of a mouse motoneuron-enriched fraction from mouse spinal cord on a density barrier. Scientific World Journal. 2, 1544-1546 (2002).
- Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord. Journal of Neuroscience Methods. 163 (1), 111-118 (2007).
- Beaudet, M. J., et al. High yield extraction of pure spinal motor neurons, astrocytes and microglia from single embryo and adult mouse spinal cord. Scientific Reports. 5, 16763 (2015).
- Camu, W., Henderson, C. E. Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor. Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).
- Arce, V., et al. Cardiotrophin-1 requires LIFRbeta to promote survival of mouse motoneurons purified by a novel technique. Journal of Neuroscience Research. 55 (1), 119-126 (1999).
- Wiese, S., et al. Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos. Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).
- Conrad, R., et al. Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Lerner, O., et al. Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles. Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).
- Ferrario, J. E., et al. Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).
- Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. α2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection. The Journal of Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).
- Theofilopoulos, S., et al. Cholestenoic acids regulate motor neuron survival via liver X receptors. The Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4829-4842 (2014).
- Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling. Methods in Molecular Biology. 1493, 403-416 (2017).
- Porter, J. D., Hauser, K. F. Survival of extraocular muscle in long-term organotypic culture: differential influence of appropriate and inappropriate motoneurons. Developmental Biology. 160 (1), 39-50 (1993).
- Serafini, T., et al. Netrin-1 is required for commissural axon guidance in the developing vertebrate nervous system. Cell. 87 (6), 1001-1014 (1996).
- Varela-Echavarría, A., Tucker, A., Püschel, A. W., Guthrie, S. Motor axon subpopulations respond differentially to the chemorepellents netrin-1 and semaphorin D. Neuron. 18 (2), 193-207 (1997).
- Irving, C., Malhas, A., Guthrie, S., Mason, I. Establishing the trochlear motor axon trajectory: role of the isthmic organiser and Fgf8. Development. 129 (23), 5389-5398 (2002).
- Chen, J., Butowt, R., Rind, H. B., von Bartheld, C. S. GDNF increases the survival of developing oculomotor neurons through a target-derived mechanism. Molecular and Cellular Neurosciences. 24 (1), 41-56 (2003).
- Whitman, M. C., et al. Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (12), 5201-5209 (2018).
- Whitman, M. C., Bell, J. L., Nguyen, E. H., Engle, E. C. Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth. Journal of Visualized Experiments. , e59911 (2019).
- Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics. Neuron. 56, 604-620 (2007).
- Bibel, M., Richter, J., Lacroix, E., Barde, Y. A. Generation of a defined and uniform population of CNS progenitors and neurons from mouse embryonic stem cells. Nature Protocols. 2 (5), 1034-1043 (2007).
- An, D., et al. Stem cell-derived cranial and spinal motor neurons reveal proteostatic differences between ALS resistant and sensitive motor neurons. eLife. 8, e44423 (2019).
- Huber, A. B., et al. Distinct roles for secreted semaphorin signaling in spinal motor axon guidance. Neuron. 48 (6), 949-964 (2005).
- Plachta, N., et al. Identification of a lectin causing the degeneration of neuronal processes using engineered embryonic stem cells. Nature Neuroscience. 10 (6), 712-719 (2007).
- Eide, L., McMurray, C. T. Culture of adult mouse neurons. BioTechniques. 38 (1), 99-104 (2005).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nature Protocols. 2 (6), 1490-1498 (2007).
- Seibenhener, M. L., Wotten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Hanson, M. G., Shen, S., Wiemelt, A. P., McMorris, F. A., Barres, B. A. Cyclic AMP elevation is sufficient to promote the survival of spinal motor neurons in vitro. The Journal of Neuroscience. 18 (18), 7361-7371 (1998).
- Lamas, N. J., et al. Neurotrophic requirements of human motor neurons defined using amplified and purified stem cell-derived cultures. Plos One. 9 (10), (2014).
- Mazzoni, E. O., et al. Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity. Nature Neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).
