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Neuroscience

Isolation und Kultur von Okulomotor, Trochlea, und Spinal Motor Neuronen von pränatalen Islmn:GFP Transgene Mäuse

Published: November 12, 2019
doi:
10.3791/60440
, , , ,
1Department of Neurology,Boston Children’s Hospital, 2FM Kirby Neurobiology Center,Boston Children’s Hospital, 3Department of Neurology,Harvard Medical School, 4Medical Genetics Training Program,Harvard Medical School, 5Department of Ophthalmology,Boston Children’s Hospital, 6Department of Ophthalmology,Harvard Medical School, 7Broad Institute of M.I.T. and Harvard, 8Howard Hughes Medical Institute, 9Department of Neurology,Kokura Memorial Hospital, 10Department of Genetics,Albert Einstein College of Medicine

Summary

Diese Arbeit stellt ein Protokoll vor, um homogene Zellkulturen von primären okulomotorischen, Trochlea- und Spinalmotorneuronen zu ergeben. Diese Kulturen können für vergleichende Analysen der morphologischen, zellulären, molekularen und elektrophysiologischen Eigenschaften von augen- und spinalmotorischen Neuronen verwendet werden.

Abstract

Okulomotorische Neuronen (CN3s) und Trochlea-Neuronen (CN4s) weisen eine bemerkenswerte Resistenz gegen degenerative motorische Neuronenerkrankungen wie amyotrophe Lateralsklerose (ALS) im Vergleich zu Spinalmotorneuronen (SMNs) auf. Die Fähigkeit, primäre Maus-CN3s, CN4s und SMNs zu isolieren und zu kultiieren, würde einen Ansatz zum Untersuchen von Mechanismen bieten, die dieser selektiven Sicherheitsanfälligkeit zugrunde liegen. Bis heute verwenden die meisten Protokolle heterogene Zellkulturen, die die Interpretation experimenteller Ergebnisse verwirren können. Um die Probleme im Zusammenhang mit gemischten Zellpopulationen zu minimieren, sind reine Kulturen unverzichtbar. Hier wird im ersten Protokoll detailliert beschrieben, wie CN3s/CN4s zusammen mit SMNs-Gegenstücken aus denselben Embryonen mit embryonalen Tag 11.5 (E11.5) IslMN:GFP transgene Mausembryonen effizient gereinigt und kultiviert werden können. Das Protokoll enthält Einzelheiten zur Gewebesektion und -dissoziation, zur FACS-basierten Zellisolierung und zur In-vitro-Kultivierung von Zellen aus CN3/CN4- und SMN-Kernen. Dieses Protokoll fügt bestehenden Protokollen ein neuartiges In-vitro-Kultursystem cN3/CN4 hinzu und bietet gleichzeitig eine reine spezies- und altersgerechte SMN-Kultur zum Vergleich. Analysen, die sich auf die morphologischen, zellulären, molekularen und elektrophysiologischen Eigenschaften motorischer Neuronen konzentrieren, sind in diesem Kultursystem möglich. Dieses Protokoll wird die Erforschung der Mechanismen ermöglichen, die die Entwicklung des motorischen Neurons, die selektive Anfälligkeit und die Krankheit definieren.

Introduction

Die Kultur der primären motorischen Neuronen ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das die Untersuchung der neuronalen Entwicklung, Funktion, und Anfälligkeit für exogene Stressoren ermöglicht. Motorische Neuronenkulturen sind besonders nützlich für die Untersuchung neurodegenerativer Erkrankungen wie der amyotrophen Lateralsklerose (ALS)1,2, deren Krankheitsmechanismen unvollständig verstanden werden. Interessanterweise sind trotz des signifikanten Zelltodes von Spinalmotorneuronen (SMNs) bei ALS-Patienten und ALS-Modellmäusen der Zelltod in okulomotorischen Neuronen (CN3s) und Trochlea-Neuronen (CN4s) relativ knapp1,3,4,5,6,7,8,9. Daher könnten vergleichende Analysen reiner Kulturen von CN3s/CN4s und SMN wichtige Hinweise auf Mechanismen liefern, die der relativen Verwundbarkeit zugrunde liegen. Leider war ein großes Hindernis für solche Analysen die Unfähigkeit, gereinigte Kulturen dieser motorischen Neuronen zu züchten.

Viele Protokolle wurden für die Reinigung von SMNs aus Tiermodellen beschrieben. Die meisten dieser Protokolle verwenden Dichtegradientzentrifugation10,11,12 und/oder p75NTR-Antikörper-basierte Zellsortierungs-Schwenktechniken13,14,15,16. Die Dichtegradientenzentrifugation nutzt die größere Größe von SMNs im Vergleich zu anderen Rückenzellen aus, während p75NTR ein extrazelluläres Protein ist, das ausschließlich von SMNs im Rückenmark exprimiert wird. Fast 100% reine SMN-Kulturen wurden von einem oder beiden dieser Protokolle11,12,14erzeugt. Diese Protokolle waren jedoch nicht erfolgreich bei der Erzeugung von CN3/CN4-Kulturen, da CN3s/CN4s p75NTRnicht ausdrücken und andere spezifische CN3/CN4-Marker nicht identifiziert wurden. Sie sind auch kleiner als SMNs und daher schwieriger zu isolieren, basierend auf der Größe. Stattdessen haben sich In-vitro-Studien von CN3s oder CN4s auf dissoziierte17,18,19,20,21, Explant17,22,23,24,25,26und Slice27,28 Kulturen, die aus heterogenen Zelltypen bestehen, und keine Protokolle für die Isolation und Kultur von primären CN3s oder CN4s.

Hier wird ein Protokoll für die Visualisierung, Isolierung, Reinigung und Kultivierung von CN3s, CN4s und SMNs vom selben Embryonaltag 11.5 (E11.5) IslMN:GFP transgene Mäuse29 (Abbildung 1, Abbildung 2A) beschrieben. IslMN:GFP kennzeichnet speziell motorische Neuronen mit einem farnesylierten GFP, das auf die Zellmembran lokalisiert. Dieses Protokoll ermöglicht einen art- und altersgerechten Vergleich mehrerer Arten von motorischen Neuronen, um pathologische Mechanismen bei motorischen Neuronenerkrankungen aufzuklären.

Protocol

Alle Experimente mit Labortieren wurden in Übereinstimmung mit den NIH-Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren und mit Genehmigung des Animal Care and Use Committee des Boston Children es Hospital durchgeführt. 1. Einrichten von zeitierten Matings vor der Zerlegung Um pränatale embryonale Mäuse für die motorische Neuronenernte zu erzeugen, wiegen Sie jede weibliche Maus und richten Sie eine zeitgefällige Paarung zwischen erwachsenen IslMN:GFP</…

Representative Results

Ziel dieses Protokolls war es, sowohl primäre CN3s/CN4s als auch SMNs langfristig hoch zu reinigen und zu kultivieren, um vergleichende Analysen der Mechanismen zu ermöglichen, die motorischen Neuronenstörungen zugrunde liegen (siehe Abbildung 1 und Abbildung 2 zur Übersicht). Sobald Neuronen erfolgreich isoliert und in der Kultur angebaut wurden, wurden fast reine …

Discussion

Historisch gesehen haben sich In-vitro-Studien von CN3- und/oder CN4-Motorneuronen auf heterogene Kulturen wie dissoziierte17,18,19,20,21, Explant17,22,23,24,25,26…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Brigitte Pettmann (Biogen, Cambridge, MA, USA) für den Unterricht in SMN-Sektionstechniken; die Dana Farber Cancer Institute Flow Cytometry Facility, die Immunology Division Flow Cytometry Facility der Harvard Medical School, The Joslin Diabetes Center Flow Cytometry Core, Brigham and Women es Hospital Flow Cytometry Core und Boston Children es Hospital Flow Cytometry Research Facility for FACS isolation of primary motor neurons; A.A. Nugent, A.P. Tenney, A.S. Lee, E.H. Nguyen, M.F. Rose, weitere Engle-Labormitglieder und Mitglieder des Project ALS-Konsortiums für technische Hilfe und nachdenkliche Diskussion. Diese Studie wurde vom Projekt ALS unterstützt. Darüber hinaus wurde R.F. von der Japan Heart Foundation/Bayer Yakuhin Research Grant Abroad und dem NIH Training Grant in Genetics T32 GM007748 finanziert; J.J. wurde durch das NIH/NEI-Schulungsprogramm in den Molekularen Basen von Augenkrankheiten (5T32EY007145-16) durch das Schepens Eye Research Institute und durch das Developmental Neurology Training Program Postdoctoral Fellowship (5T32NS007473-19) durch das Boston Children es Hospital unterstützt; M.C.W wurde von NEI (5K08EY027850) und der Children es Hospital Ophthalmology Foundation (Faculty Discovery Award) unterstützt. und E.C.E. ist ein Howard Hughes Medical Institute Investigator.

Materials

Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) Thermo Fisher Scientific A-11001 1:400
Alexa Fluor 594-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG (H+L) Thermo Fisher Scientific A-11072 1:400
B27 Supplement (50X), serum free Thermo Fisher Scientific 17504-044
BD FACSAria llu SORP Flow Cytometer BD Bioscience – This has 4 laser system equipped with 405, 488, 594, and 640 nm lasers.
BD Falcon 70μm Nylon Cell Strainers CORNING 352350 For filtering the dissociating cells before FACS.
BD Falcon Round Bottom Test Tubes With Snap Cap CORNING 352054
BDNF Human ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. CYT-207
Cell Culture microplate, 96 well, PS, F-bottom (Chimney Well) Greiner Bio-One International 655090 We tried multiple 96-well dishes and this was the best one for culture and analyses after ICC
Circular Cover Glasses for microscopy Karl Hecht & Assistent 1001/14 We used this coverslip since the area was large (diamater: 14 mm).
CNTF Human ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. CYT-272
Cyclopiazonic acid from Penicillium cyclopium Sigma-Aldrich C1530 CPA. One of ER stressors.
4′,6-diamidino-2-phenylinodole (DAPI) Thermo Fisher Scientific D1306
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2650 DMSO
Dumont #5 Forceps Inox Tip Size .05 x .01 mm Biologie Tips Roboz Surgical Instrument RS-5015
Forskolin Thermo Fisher Scientific BP25205
GDNF Human ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. CYT-305
GlutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific 35050-061
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) Thermo Fisher Scientific 14175-095
Hibernate E BrainBits HE
Hibernate E low fluorescence BrainBits HELF Fluorescence which hinders observation of embryo's GFP expressions should be low.
Horse serum, heat inactivated, New Zealand origin Thermo Fisher Scientific 26050-070
IBMX Tocris Cookson 2845 Isobutylmethylxanthine
Laminin Thermo Fisher Scientific 23017-015
Leibovitz’s L15 medium Thermo Fisher Scientific 11415064
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
Micro Dissecting Scissors Roboz Surgical Instrument RS-5913
Micro Knife 4.75" 1.7 x 27 mm blade Roboz Surgical Instrument RS-6272
Moria Mini Perforated Spoon Fine Science Tools 10370-19
mouse monoclonal antibody to neuronal class III β-tubulin (TUBB3) BioLegend 801202 1:500, TUJ1
Nikon Perfect Focus Eclipse Ti live cell fluorescence microscope and Elements software Nikon – Differential interference contrast images and immunocytochemistry images of the cell cultures were captured with these equipments
Nitric Acid 90%, Fuming (Certified ACS) Fisher Scientific A202-212 For rinsing coverslips
Olympus 1.7ml Microtubes, Clear Genesee Scientific 22-281 These are the tubes that we described "1.7 mL microcentrifuge tubes" in the context.
Papain Dissociation System Worthington Biochemical Corp LK003150 Papain solution and alubumin-ovomucoid inhibitor solution are prepared from this kit.
Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml) Thermo Fisher Scientific 15140-122
Phosphate buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010-023
Poly D-lysin (PDL) MilliporeSigma A-003-E
rabbit monoclonal antibody to Islet1 Abcam ab109517 1:200
SMZ18 and SMZ1500 zoom stereomicroscopes with DS-Ri1 camera Nikon – Dissection was performed and images of dissected embryos and tissues are captured under these fluorescence microscopes.
Sylgard 170 Black Silicone Encapsulant – A+B 0.9 Kg kit Dow Corning 1696157 We make dissection dishes using this kit.
TC treated Dishes, 100 x 20 mm Genesee Scientific 25-202 We make dissection dishes using this dish.
Thum Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width Roboz Surgical Instrument RS-8100
Transducer for LOGOQ e VET GE Healthcare L8-18i-RS For ultrasound on female mice
Veterinary ultrasound machine GE Healthcare LOGOQ e VET For ultrasound on female mice
Zeiss LSM 700 series laser scanning confocal microscope and Zen Software Carl Zeiss – Confocal image of the embryo was captured with these equipments
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References

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Fujiki, R., Lee, J. Y., Jurgens, J. A., Whitman, M. C., Engle, E. C. Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice. J. Vis. Exp. (153), e60440, doi:10.3791/60440 (2019).
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