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Neuroscience

出生前イスルmnからのオキュロモータ、トロクレア、脊髄運動ニューロンの単離と培養 :GFPトランスジェニックマウス

Published: November 12, 2019
doi:
10.3791/60440
, , , ,
1Department of Neurology,Boston Children’s Hospital, 2FM Kirby Neurobiology Center,Boston Children’s Hospital, 3Department of Neurology,Harvard Medical School, 4Medical Genetics Training Program,Harvard Medical School, 5Department of Ophthalmology,Boston Children’s Hospital, 6Department of Ophthalmology,Harvard Medical School, 7Broad Institute of M.I.T. and Harvard, 8Howard Hughes Medical Institute, 9Department of Neurology,Kokura Memorial Hospital, 10Department of Genetics,Albert Einstein College of Medicine

Summary

この研究は、原発性オキュロモーター、トロクレア、および脊髄運動ニューロンの均質な細胞培養を生み出すプロトコルを提示する。これらの培養物は、眼および脊髄運動ニューロンの形態学的、細胞的、分子的、および電気生理学的特性の比較分析に使用することができる。

Abstract

オキュロモーターニューロン(CN3s)およびトロクレアニューロン(CN4s)は、脊髄運動ニューロン(SM)と比較して筋萎縮性側索硬化症(ALS)などの変性運動ニューロン疾患に対して顕著な耐性を示す。プライマリ マウス CN3、CN4、および SNN を分離および培養する機能は、この選択的な脆弱性の根底にあるメカニズムを研究するアプローチを提供します。現在までに、ほとんどのプロトコルは異種細胞培養物を使用しており、実験的な結果の解釈を混乱させる可能性があります。混合細胞集団に伴う問題を最小限に抑えるためには、純粋な培養が不可欠です。ここで、第1のプロトコルは、胚発生日11.5(E11.5)Isl MN:GFPトランスジェニックマウス胚を用いて、同じ胚からSMNと一緒にCN3/CN4を効率的に精製および培養する方法を詳細に説明する。このプロトコルは、組織解離および解離、FACSベースの細胞単離、およびCN3/CN4およびSMN核からの細胞のインビトロ培養に関する詳細を提供する。このプロトコルは、既存のプロトコルに新しいインビトロCN3/CN4培養システムを追加し、同時に比較のために純粋な種と年齢に一致するSMN培養を提供します。運動ニューロンの形態学的、細胞的、分子的、電気生理学的特性に着目した解析は、この培養システムにおいて実現可能である。このプロトコルは、運動ニューロンの発達、選択的脆弱性、および疾患を定義するメカニズムの研究を可能にする。

Introduction

一次運動ニューロンの培養は、外因性ストレッサーに対する神経発達、機能、および感受性の研究を可能にする強力なツールです。運動ニューロン培養は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)1、2などの神経変性疾患の研究に特に有用であり、その疾患メカニズムは不完全に理解されている。興味深いことに、ALS患者およびALSモデルマウスの両方における脊髄運動ニューロン(SM)の有意な細胞死にもかかわらず、オキュロ運動ニューロン(CN3s)およびトロクレアニューロン(CN4s)における細胞死は比較的少ない1、3、4、5、6、7、8、9である。したがって、CN3/CN4sおよびSMNの純粋培養の比較分析は、相対的な脆弱性の根底にあるメカニズムに関する重要な手がかりを提供する可能性がある。残念ながら、このような分析の大きな障壁は、これらの運動ニューロンの精製培養を成長させることができないことです。

動物モデルからのSNNの精製については、多くのプロトコルが記載されている。これらのプロトコルのほとんどは、密度勾配遠心分離10、11、12および/またはp75NTR-抗体ベースの細胞ソートパンニング技術13、14、15、16を使用する。密度勾配遠心分離は、他の脊椎細胞に対してSNNのより大きなサイズを利用するのに対し、p75NTRは脊髄内のSNNによって排他的に発現される細胞外タンパク質である。ほぼ100%純粋なSMN培養物は、これらのプロトコル11、12、14の一方または両方によって生成されている。ただし、CN3/CN4s は p75NTRを表せず、その他の特定の CN3/CN4 マーカーが特定されていないため、これらのプロトコルは CN3/CN4 カルチャの生成に成功していません。また、SNN よりも小さいため、サイズに基づいて分離するのが難しくなります。代わりに、CN3sまたはCN4のインビトロ研究は、解剖された17、18、19、20、21、エクスプラント17、22、23、24、25、26、およびスライス27、28の異種細胞タイプで構成され、プロトコルが存在しなかった。プライマリCN3またはCN4の分離と培養。

ここでは、同じ胚発生日11.5(E11.5)Isl MN:GFPトランスジェニックマウス29(図1、図2A)からのCN3、CN4、およびSNNの可視化、単離、精製、および培養のためのプロトコルについて説明するプロトコルである。IslMN:GFPは、細胞膜に局在するファルネシル化 GFP を有する運動ニューロンを特異的に標識します。このプロトコルは、運動ニューロン疾患の病理学的メカニズムを解明するために、複数のタイプの運動ニューロンの種および年齢マッチング比較を可能にする。

Protocol

実験動物を利用した実験はすべて、実験動物のケアと使用に関するNIHガイドラインに従い、ボストン小児病院の動物ケア・利用委員会の承認を得て行った。 1. 解剖前のタイミング交配の設定 運動ニューロンの収穫のために出生前胚性マウスを生成するには、各雌マウスの体重を量り、ニューロン単離の日の11.5日前に成人IslMN:GFPトランスジェニック…

Representative Results

このプロトコルの目的は、運動ニューロン障害の基礎となるメカニズムの比較分析を可能にするために、プライマリCN3/CN4s/CN4とSNNの両方を長期的に高度に浄化および培養するものでした(概要については図1と図2を参照)。 ニューロンが正常に単離され、培養中に成長すると、ほ?…

Discussion

歴史的に、CN3および/またはCN4運動ニューロンのインビトロ研究は、解離された17、18、19、20、21、エクスプラント17、22、23、24、25、26、および</…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ブリジット・ペットマン(バイオジェン、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国)のSMN解剖技術の指導に感謝します。ダナ・ファーバー癌研究所フローサイトメトリー施設、ハーバード大学医学部免疫部門フローサイトメトリー施設、ジョスリン糖尿病センターフローサイトメトリーコア、ブリガムと女性病院フローサイトメトリーコア、ボストン小児病院フローサイトメトリー研究施設A.A.ニュージェント、A.P.テニー、A.S.リー、E.H.グエン、M.F.ローズ、追加のエングル研究所メンバー、プロジェクトALSコンソーシアムメンバーは、技術的な支援と思慮深い議論のために。この研究はプロジェクトALSによって支持されました。また、海外の国際心臓財団/バイエルヤチン研究助成、遺伝学T32 GM007748のNIH研修助成金を受け、R.F.は資金提供を受けました。J.J.は、シペンス眼科学研究所を通じて眼疾患分子基盤(5T32EY007145-16)のNIH/NEIトレーニングプログラム、ボストン小児病院を通じて発達神経学研修プログラム博士研究員(5T32NS007473-19)によって支援されました。M.C.WはNEI(5K08EY027850)と小児病院眼科財団(教員発見賞)によって支援されました。そしてE.C.E.はハワード・ヒューズ医学研究所の研究者です。

Materials

Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) Thermo Fisher Scientific A-11001 1:400
Alexa Fluor 594-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG (H+L) Thermo Fisher Scientific A-11072 1:400
B27 Supplement (50X), serum free Thermo Fisher Scientific 17504-044
BD FACSAria llu SORP Flow Cytometer BD Bioscience – This has 4 laser system equipped with 405, 488, 594, and 640 nm lasers.
BD Falcon 70μm Nylon Cell Strainers CORNING 352350 For filtering the dissociating cells before FACS.
BD Falcon Round Bottom Test Tubes With Snap Cap CORNING 352054
BDNF Human ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. CYT-207
Cell Culture microplate, 96 well, PS, F-bottom (Chimney Well) Greiner Bio-One International 655090 We tried multiple 96-well dishes and this was the best one for culture and analyses after ICC
Circular Cover Glasses for microscopy Karl Hecht & Assistent 1001/14 We used this coverslip since the area was large (diamater: 14 mm).
CNTF Human ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. CYT-272
Cyclopiazonic acid from Penicillium cyclopium Sigma-Aldrich C1530 CPA. One of ER stressors.
4′,6-diamidino-2-phenylinodole (DAPI) Thermo Fisher Scientific D1306
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2650 DMSO
Dumont #5 Forceps Inox Tip Size .05 x .01 mm Biologie Tips Roboz Surgical Instrument RS-5015
Forskolin Thermo Fisher Scientific BP25205
GDNF Human ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. CYT-305
GlutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific 35050-061
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) Thermo Fisher Scientific 14175-095
Hibernate E BrainBits HE
Hibernate E low fluorescence BrainBits HELF Fluorescence which hinders observation of embryo's GFP expressions should be low.
Horse serum, heat inactivated, New Zealand origin Thermo Fisher Scientific 26050-070
IBMX Tocris Cookson 2845 Isobutylmethylxanthine
Laminin Thermo Fisher Scientific 23017-015
Leibovitz’s L15 medium Thermo Fisher Scientific 11415064
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
Micro Dissecting Scissors Roboz Surgical Instrument RS-5913
Micro Knife 4.75" 1.7 x 27 mm blade Roboz Surgical Instrument RS-6272
Moria Mini Perforated Spoon Fine Science Tools 10370-19
mouse monoclonal antibody to neuronal class III β-tubulin (TUBB3) BioLegend 801202 1:500, TUJ1
Nikon Perfect Focus Eclipse Ti live cell fluorescence microscope and Elements software Nikon – Differential interference contrast images and immunocytochemistry images of the cell cultures were captured with these equipments
Nitric Acid 90%, Fuming (Certified ACS) Fisher Scientific A202-212 For rinsing coverslips
Olympus 1.7ml Microtubes, Clear Genesee Scientific 22-281 These are the tubes that we described "1.7 mL microcentrifuge tubes" in the context.
Papain Dissociation System Worthington Biochemical Corp LK003150 Papain solution and alubumin-ovomucoid inhibitor solution are prepared from this kit.
Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml) Thermo Fisher Scientific 15140-122
Phosphate buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010-023
Poly D-lysin (PDL) MilliporeSigma A-003-E
rabbit monoclonal antibody to Islet1 Abcam ab109517 1:200
SMZ18 and SMZ1500 zoom stereomicroscopes with DS-Ri1 camera Nikon – Dissection was performed and images of dissected embryos and tissues are captured under these fluorescence microscopes.
Sylgard 170 Black Silicone Encapsulant – A+B 0.9 Kg kit Dow Corning 1696157 We make dissection dishes using this kit.
TC treated Dishes, 100 x 20 mm Genesee Scientific 25-202 We make dissection dishes using this dish.
Thum Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width Roboz Surgical Instrument RS-8100
Transducer for LOGOQ e VET GE Healthcare L8-18i-RS For ultrasound on female mice
Veterinary ultrasound machine GE Healthcare LOGOQ e VET For ultrasound on female mice
Zeiss LSM 700 series laser scanning confocal microscope and Zen Software Carl Zeiss – Confocal image of the embryo was captured with these equipments
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References

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Fujiki, R., Lee, J. Y., Jurgens, J. A., Whitman, M. C., Engle, E. C. Isolation and Culture of Oculomotor, Trochlear, and Spinal Motor Neurons from Prenatal Islmn:GFP Transgenic Mice. J. Vis. Exp. (153), e60440, doi:10.3791/60440 (2019).
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