Isolatie en cultuur van Oculomotor, Trochlear en spinale motor neuronen van prenatale ISLMN: GFP transgene muizen
Summary
Dit werk presenteert een protocol voor het opleveren van homogene celculturen van primaire Oculomotor, trochlear, en ruggengraat motorneuronen. Deze culturen kunnen worden gebruikt voor vergelijkende analyses van de morfologische, cellulaire, moleculaire en elektrofysiologische kenmerken van oculaire en spinale motorneuronen.
Abstract
Oculomotor neuronen (CN3s) en trochlear neuronen (CN4s) vertonen opmerkelijke weerstand tegen degeneratieve motorische neuron ziekten zoals Amyotrofische laterale sclerose (ALS) in vergelijking met spinale motorneuronen (Smn’s). De mogelijkheid om de primaire muis CN3s, CN4s en Smn’s te isoleren en te cultuur zou een aanpak bieden voor het bestuderen van mechanismen die aan deze selectieve kwetsbaarheid ten grondslag liggen. Tot op heden maken de meeste protocollen gebruik van heterogene celculturen, wat de interpretatie van experimentele uitkomsten kan Verdoe- Om de problemen in verband met gemengde celpopulaties te minimaliseren, zijn zuivere culturen onmisbaar. Hier beschrijft het eerste protocol gedetailleerd hoe efficiënt CN3s/CN4s naast SMNs-tegenhangers uit dezelfde embryo’s te zuiveren en te cultiveren met behulp van embryonale dag 11,5 (E 11.5) ISLMN: GFP transgene muis embryo’s. Het protocol bevat details over de weefsel dissectie en dissociatie, FACS-gebaseerde celisolatie, en in vitro teelt van cellen uit CN3/CN4 en SMN kernen. Dit protocol voegt een roman in vitro CN3/CN4 cultuur systeem toe aan bestaande protocollen en biedt tegelijkertijd een zuivere soort en leeftijdsgebonden SMN-cultuur ter vergelijking. Analyses gericht op de morfologische, cellulaire, moleculaire en elektrofysiologische kenmerken van motorneuronen zijn haalbaar in dit cultuur systeem. Dit protocol zal onderzoek mogelijk maken naar de mechanismen die de ontwikkeling van motorische neuron, selectieve kwetsbaarheid en ziekte bepalen.
Introduction
De cultuur van primaire motorneuronen is een krachtig hulpmiddel dat de studie van neuronale ontwikkeling, functie, en gevoeligheid voor exogene stressoren mogelijk maakt. Motorische neuron culturen zijn vooral nuttig voor de studie van neurodegeneratieve ziekten zoals Amyotrofische laterale sclerose (als)1,2, waarvande ziekte mechanismen zijn niet volledig begrepen. Belangwekkend, ondanks de significante celdood van wervelkolom motorneuronen (smn’s) in zowel als patiënten en als model muizen, celdood in Oculomotor neuronen (CN3s) en trochlear neuronen (CN4s) zijn relatief schaars1,3,4,5,6,7,8,9. Daarom kunnen vergelijkende analyses van zuivere culturen van CN3s/CN4s en Smn’s belangrijke aanwijzingen geven over mechanismen die onderliggende relatieve kwetsbaarheid vormen. Helaas is een belangrijke barrière voor dergelijke analyses het onvermogen om gezuiverde culturen van deze motorneuronen te kweken.
Veel protocollen zijn beschreven voor de zuivering van Smn’s uit diermodellen. De meeste van deze protocollen maken gebruik van dichtheidsgradiënt centrifugeren10,11,12 en/of P75NTR-antilichaam-gebaseerde cel-Sorteer pannen technieken13,14,15,16. Met dichtheidsgradiënt centrifugeren wordt de grotere grootte van Smn’s ten opzichte van andere spinale cellen benut, terwijl P75NTR een extracellulair eiwit is dat uitsluitend door smn’s in het ruggenmerg wordt uitgedrukt. Bijna 100% zuivere SMN-culturen zijn gegenereerd door een of beide van deze protocollen11,12,14. Deze protocollen zijn echter niet gelukt bij het genereren van CN3/CN4-culturen omdat CN3s/CN4s geen P75NTRExpress en andere specifieke CN3/CN4-markeringen niet zijn geïdentificeerd. Ze zijn ook kleiner dan de Smn’s en daarom moeilijker te isoleren op basis van grootte. Integendeel, in vitro studies van CN3s of CN4s hebben zich gebaseerd op dissociatie van17,18,19,20,21, explant17,22,23,24,25,26, en slice27,28 culturen, die zijn samengesteld uit heterogene celtypen, en er bestaan geen protocollen voor de isolatie en cultuur van primaire CN3s of CN4s.
Hier wordt een protocol beschreven voor de visualisatie, isolatie, zuivering en teelt van CN3s, CN4s en Smn’s van dezelfde embryonale dag 11,5 (E 11.5) ISLMN: GFP transgene muizen29 (Figuur 1, Figuur 2a). ISLMN: GFP heeft specifiek betrekking op motorneuronen met een door farnesylated GFP die naar het celmembraan lokaliseert. Dit protocol maakt het mogelijk om soorten en leeftijdgebonden vergelijkingen van meerdere soorten motorische neuronen te verhelderen om pathologische mechanismen in de motorische neuron ziekte uit te leggen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Historisch gezien, in vitro studies van CN3 en/of CN4 motorneuronen hebben vertrouwd op heterogene culturen zoals gezien17,18,19,20,21, explant17,22,23,24,25,26, e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken Brigitte Pettmann (Biogen, Cambridge, MA, VS) voor instructie in SMN dissectie technieken; het Dana Farber Cancer Institute flow Cytometrie faciliteit, de immunologie divisie flow Cytometry faciliteit van Harvard Medical School, de Joslin Diabetes Center flow Cytometrie kern, Brigham en Women’s Hospital flow Cytometrie kern, en Boston Children’s Hospital flow Cytometrie onderzoek faciliteit voor FACS isolatie van primaire motorneuronen; A.A. Nugent, A.P. Tenney, A.S. Lee, E.H. Nguyen, M.F. Rose, extra Engle laboratorium leden en project ALS consortium leden voor technische assistentie en doordachte discussie. Deze studie werd ondersteund door project ALS. Daarnaast werd R.F. gefinancierd door de Japan Heart Foundation/Bayer Yakuhin Research Grant in het buitenland en NIH training Grant in genetica T32 GM007748; J.J. werd gesteund door het NIH/NEI trainingsprogramma in de moleculaire basissen van oogziekten (5T32EY007145-16) via het Schepens Eye Research Institute en door het ontwikkelingsneurologie trainingsprogramma Postdoctoral Fellowship (5T32NS007473-19) via het Boston Children’s Hospital; M. C. W werd gesteund door NEI (5K08EY027850) en Children’s Hospital Ophthalmologie Foundation (Faculty Discovery Award); en E.C.E. is een onderzoeker van het Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | 1:400 |
| Alexa Fluor 594-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11072 | 1:400 |
| B27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| BD FACSAria llu SORP Flow Cytometer | BD Bioscience | – | This has 4 laser system equipped with 405, 488, 594, and 640 nm lasers. |
| BD Falcon 70μm Nylon Cell Strainers | CORNING | 352350 | For filtering the dissociating cells before FACS. |
| BD Falcon Round Bottom Test Tubes With Snap Cap | CORNING | 352054 | |
| BDNF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-207 | |
| Cell Culture microplate, 96 well, PS, F-bottom (Chimney Well) | Greiner Bio-One International | 655090 | We tried multiple 96-well dishes and this was the best one for culture and analyses after ICC |
| Circular Cover Glasses for microscopy | Karl Hecht & Assistent | 1001/14 | We used this coverslip since the area was large (diamater: 14 mm). |
| CNTF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-272 | |
| Cyclopiazonic acid from Penicillium cyclopium | Sigma-Aldrich | C1530 | CPA. One of ER stressors. |
| 4′,6-diamidino-2-phenylinodole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | DMSO |
| Dumont #5 Forceps Inox Tip Size .05 x .01 mm Biologie Tips | Roboz Surgical Instrument | RS-5015 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | BP25205 | |
| GDNF Human | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-305 | |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14175-095 | |
| Hibernate E | BrainBits | HE | |
| Hibernate E low fluorescence | BrainBits | HELF | Fluorescence which hinders observation of embryo's GFP expressions should be low. |
| Horse serum, heat inactivated, New Zealand origin | Thermo Fisher Scientific | 26050-070 | |
| IBMX | Tocris Cookson | 2845 | Isobutylmethylxanthine |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017-015 | |
| Leibovitz’s L15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5913 | |
| Micro Knife 4.75" 1.7 x 27 mm blade | Roboz Surgical Instrument | RS-6272 | |
| Moria Mini Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | |
| mouse monoclonal antibody to neuronal class III β-tubulin (TUBB3) | BioLegend | 801202 | 1:500, TUJ1 |
| Nikon Perfect Focus Eclipse Ti live cell fluorescence microscope and Elements software | Nikon | – | Differential interference contrast images and immunocytochemistry images of the cell cultures were captured with these equipments |
| Nitric Acid 90%, Fuming (Certified ACS) | Fisher Scientific | A202-212 | For rinsing coverslips |
| Olympus 1.7ml Microtubes, Clear | Genesee Scientific | 22-281 | These are the tubes that we described "1.7 mL microcentrifuge tubes" in the context. |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corp | LK003150 | Papain solution and alubumin-ovomucoid inhibitor solution are prepared from this kit. |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Poly D-lysin (PDL) | MilliporeSigma | A-003-E | |
| rabbit monoclonal antibody to Islet1 | Abcam | ab109517 | 1:200 |
| SMZ18 and SMZ1500 zoom stereomicroscopes with DS-Ri1 camera | Nikon | – | Dissection was performed and images of dissected embryos and tissues are captured under these fluorescence microscopes. |
| Sylgard 170 Black Silicone Encapsulant – A+B 0.9 Kg kit | Dow Corning | 1696157 | We make dissection dishes using this kit. |
| TC treated Dishes, 100 x 20 mm | Genesee Scientific | 25-202 | We make dissection dishes using this dish. |
| Thum Dressing Forceps 4.5" Serrated 2.2 mm Tip Width | Roboz Surgical Instrument | RS-8100 | |
| Transducer for LOGOQ e VET | GE Healthcare | L8-18i-RS | For ultrasound on female mice |
| Veterinary ultrasound machine | GE Healthcare | LOGOQ e VET | For ultrasound on female mice |
| Zeiss LSM 700 series laser scanning confocal microscope and Zen Software | Carl Zeiss | – | Confocal image of the embryo was captured with these equipments |
References
- Kiernan, M. C., et al. Amyotrophic lateral sclerosis. Lancet. 377 (9769), 942-955 (2011).
- Wood-Allum, C., Shaw, P. J. Motor neurone disease: a practical update on diagnosis and management. Clinical Medicine (London, England). 10 (3), 252-258 (2010).
- Nijssen, J., ComLey, L. H., Hedlund, E. Motor neuron vulnerability and resistance in amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathologica. 133 (6), 863-885 (2017).
- Gizzi, M., DiRocco, A., Sivak, M., Cohen, B. Ocular motor function in motor neuron disease. Neurology. 42 (5), 1037-1046 (1992).
- Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annual Review of Neuroscience. 33, 409-440 (2010).
- Nimchinsky, E. A., et al. Differential vulnerability of oculomotor, facial, and hypoglossal nuclei in G86R superoxide dismutase transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 416 (1), 112-125 (2000).
- Angenstein, F., et al. Age-dependent changes in MRI of motor brain stem nuclei in a mouse model of ALS. Neuroreport. 15 (14), 2271-2274 (2004).
- Niessen, H. G., et al. In vivo quantification of spinal and bulbar motor neuron degeneration in the G93A-SOD1 transgenic mouse model of ALS by T2 relaxation time and apparent diffusion coefficient. Experimental Neurology. 201 (2), 293-300 (2006).
- Spiller, K. J., et al. Selective Motor Neuron Resistance and Recovery in a New Inducible Mouse Model of TDP-43 Proteinopathy. The Journal of Neuroscience. 36 (29), 7707-7717 (2016).
- Graham, J. M. Isolation of a mouse motoneuron-enriched fraction from mouse spinal cord on a density barrier. Scientific World Journal. 2, 1544-1546 (2002).
- Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord. Journal of Neuroscience Methods. 163 (1), 111-118 (2007).
- Beaudet, M. J., et al. High yield extraction of pure spinal motor neurons, astrocytes and microglia from single embryo and adult mouse spinal cord. Scientific Reports. 5, 16763 (2015).
- Camu, W., Henderson, C. E. Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor. Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).
- Arce, V., et al. Cardiotrophin-1 requires LIFRbeta to promote survival of mouse motoneurons purified by a novel technique. Journal of Neuroscience Research. 55 (1), 119-126 (1999).
- Wiese, S., et al. Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos. Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).
- Conrad, R., et al. Lectin-based isolation and culture of mouse embryonic motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Lerner, O., et al. Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles. Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).
- Ferrario, J. E., et al. Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).
- Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. α2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection. The Journal of Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).
- Theofilopoulos, S., et al. Cholestenoic acids regulate motor neuron survival via liver X receptors. The Journal of Clinical Investigation. 124 (11), 4829-4842 (2014).
- Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling. Methods in Molecular Biology. 1493, 403-416 (2017).
- Porter, J. D., Hauser, K. F. Survival of extraocular muscle in long-term organotypic culture: differential influence of appropriate and inappropriate motoneurons. Developmental Biology. 160 (1), 39-50 (1993).
- Serafini, T., et al. Netrin-1 is required for commissural axon guidance in the developing vertebrate nervous system. Cell. 87 (6), 1001-1014 (1996).
- Varela-Echavarría, A., Tucker, A., Püschel, A. W., Guthrie, S. Motor axon subpopulations respond differentially to the chemorepellents netrin-1 and semaphorin D. Neuron. 18 (2), 193-207 (1997).
- Irving, C., Malhas, A., Guthrie, S., Mason, I. Establishing the trochlear motor axon trajectory: role of the isthmic organiser and Fgf8. Development. 129 (23), 5389-5398 (2002).
- Chen, J., Butowt, R., Rind, H. B., von Bartheld, C. S. GDNF increases the survival of developing oculomotor neurons through a target-derived mechanism. Molecular and Cellular Neurosciences. 24 (1), 41-56 (2003).
- Whitman, M. C., et al. Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (12), 5201-5209 (2018).
- Whitman, M. C., Bell, J. L., Nguyen, E. H., Engle, E. C. Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth. Journal of Visualized Experiments. , e59911 (2019).
- Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics. Neuron. 56, 604-620 (2007).
- Bibel, M., Richter, J., Lacroix, E., Barde, Y. A. Generation of a defined and uniform population of CNS progenitors and neurons from mouse embryonic stem cells. Nature Protocols. 2 (5), 1034-1043 (2007).
- An, D., et al. Stem cell-derived cranial and spinal motor neurons reveal proteostatic differences between ALS resistant and sensitive motor neurons. eLife. 8, e44423 (2019).
- Huber, A. B., et al. Distinct roles for secreted semaphorin signaling in spinal motor axon guidance. Neuron. 48 (6), 949-964 (2005).
- Plachta, N., et al. Identification of a lectin causing the degeneration of neuronal processes using engineered embryonic stem cells. Nature Neuroscience. 10 (6), 712-719 (2007).
- Eide, L., McMurray, C. T. Culture of adult mouse neurons. BioTechniques. 38 (1), 99-104 (2005).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nature Protocols. 2 (6), 1490-1498 (2007).
- Seibenhener, M. L., Wotten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Hanson, M. G., Shen, S., Wiemelt, A. P., McMorris, F. A., Barres, B. A. Cyclic AMP elevation is sufficient to promote the survival of spinal motor neurons in vitro. The Journal of Neuroscience. 18 (18), 7361-7371 (1998).
- Lamas, N. J., et al. Neurotrophic requirements of human motor neurons defined using amplified and purified stem cell-derived cultures. Plos One. 9 (10), (2014).
- Mazzoni, E. O., et al. Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity. Nature Neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).
