Measuring Microbial Mutation Rates with the Fluctuation Assay

Rok Kra&#353;ovec; Huw Richards; Guillaume Gomez; Danna  R. Gifford; Adrien Mazoyer; Christopher  G. Knight

doi:10.3791/60406

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Genetics

Misurazione dei tassi di mutazione microbica con il saggio di fluttuazione

Published: November 28, 2019

doi:

10.3791/60406

Rok Krašovec¹, Huw Richards^2,3, Guillaume Gomez³, Danna R. Gifford¹, Adrien Mazoyer⁴, Christopher G. Knight³

¹School of Biological Sciences,The University of Manchester, ²School of Science,University of Waikato, ³School of Natural Sciences,The University of Manchester, ⁴Department of Mathematics,Université du Québec à Montréal

Summary

Qui, viene presentato un protocollo per eseguire un saggio di fluttuazione e stimare il tasso di mutazione microbica utilizzando marcatori fenotipici. Questo protocollo consentirà ai ricercatori di testare le mutazioni in diversi microbi e ambienti, determinando come il genotipo e il contesto ecologico influenzano i tassi di mutazione spontanea.

Abstract

I saggi di fluttuazione sono ampiamente utilizzati per stimare i tassi di mutazione nei microbi che crescono in ambienti liquidi. Molte culture sono inoculate con poche migliaia di cellule, ognuna sensibile a un marcatore selettivo che può essere analizzato fenotipicamente. Queste culture parallele crescono per molte generazioni in assenza del marcatore fenotipipico. Un sottoinsieme di colture viene utilizzato per stimare il numero totale di cellule a rischio di mutazioni (cioè la dimensione della popolazione alla fine del periodo di crescita, o N_t). Le altre colture sono placcate sull’agar selettivo. La distribuzione di mutanti resistenti osservati tra culture parallele viene quindi utilizzata per stimare il numero previsto di eventi mutazionali, m, utilizzando un modello matematico. Dividendo m per N_t si ottiene la stima del tasso di mutazione per locus per generazione. Il saggio ha tre aspetti critici: il marcatore fenotico scelto, il volume scelto di colture parallele, e garantire che la superficie sull’agar selettivo sia completamente asciutta prima dell’incubazione. Il test è relativamente poco costoso e ha bisogno solo di attrezzature di laboratorio standard. È anche meno laborioso di approcci alternativi, come l’accumulo di mutazioni e i saggi unicellulari. Il saggio funziona su organismi che attraversano rapidamente molte generazioni e dipende da ipotesi circa gli effetti di fitness dei marcatori e la morte cellulare. Tuttavia, gli strumenti sviluppati di recente e gli studi teorici consentono ora di affrontare questi problemi analiticamente. Il saggio consente la stima del tasso di mutazione di diversi marcatori fenotipici nelle cellule con genotipi diversi che crescono in isolamento o in comunità. Conducendo più saggi in parallelo, i test possono essere utilizzati per studiare come il contesto ambientale di un organismo influisce sul tasso di mutazione spontanea, che è fondamentale per comprendere la resistenza antimicrobica, la carcinogenesi, l’invecchiamento e l’evoluzione.

Introduction

Nel 1901 il botanico olandese Hugo de Vries coniò il termine mutazione¹. Ventisei anni dopo, quando Hermann Joseph Muller scoprì l’azione mutagegena dei raggi X^2,le mutazioni erano già percepite come una delle forze trainanti dell’evoluzione. Tuttavia, la natura delle mutazioni non era chiara. Per rispondere alla domanda fondamentale se le mutazioni emergono spontaneamente (cioè una mutazione spontanea) o in risposta alla selezione (cioè una mutazione indotta), era necessario un metodo per osservare gli eventi mutazionali. Tale metodo misurerebbe il numero previsto di mutazioni per divisione cellulare o quello che era già noto come tasso di mutazione³^,⁴.

Figura 1: Illustrazione schematica di come eseguire il saggio di fluttuazione con un ceppo microbico in una piastra di pozzo profondo 96. (A) Cellule inoculate e climatizzati in tubi da 50 mL contenenti cinque ambienti diversi (‘rosso’, ‘blu’, ‘verde’, ‘viola’ e ‘arancione’). (B) Preparare colture parallele con un piccolo numero di cellule sensibili in una piastra di 96 pozzi profondi. L’analisi “rossa” ha 20 colture parallele, mentre i saggi “blu”, “verde”, “viola” e “arancione” hanno tutte 19 colture parallele. Le posizioni delle culture parallele sulla targa del pozzo profondo 96 sono casuali. La randomizzazione può essere eseguita con lo script Supplementary LayoutGenerator.R o con un altro strumento. Il layout in alto a destra è il risultato della randomizzazione. (C) Incubare la piastra del pozzo profondo 96 e lasciare che le cellule si dividano e mutino spontaneamente. Sei colture provenienti da pozzi profondi A1, B1, C1, E1, F1 e G1 mostrano come il numero di mutanti fluttui: 4, 0, 2, 2, 1 e 4 globuli rossi dopo la terza divisione cellulare, rispettivamente. Il numero di mutanti differisce non solo a causa del diverso numero di mutazioni spontanee (0, 1 o 2 come mostrato dal primo globulo rosso), ma anche perché è importante quando durante un ciclo culturale emerge spontaneamente una mutazione di resistenza (divisione cellulare 1, 2 o 3). (D) Dopo l’incubazione del pozzo profondo 96 il numero di mutanti è determinato dalla placcatura di 81 colture parallele. Sul layout questi sono cerchi senza bordi in grassetto. L’intera coltura parallela è placcata su un pozzo di un pozzo 6 contenente un agar selettivo. (E) Le restanti 15 colture vengono diluite e placcate sull’agar non selettivo per determinare il numero medio di cellule (N_t). Sul layout questi sono etichettati come Ntwells e hanno bordi in grassetto. Per ogni saggio N_t è mediato su tre culture parallele. In basso a destra c’è un piatto Petri contenente un piatto di agar non selettivo con 25 CFU di una cultura diluita coltivata in un pozzo profondo D1 (parte di un saggio ‘verde’). (F) Dopo l’incubazione dei 6 pozze selettive, è stato contato il numero di mutanti osservati e il numero previsto di eventi mutazionali, m, è stato stimato utilizzando uno stimatore di massima probabilità. (G) Conoscere sia il numero di mutazioni, m, sia il numero di cellule per saggio, N_t, il tasso di mutazione è stato stimato come m/N_t. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Salvador Luria e Max Delbràck nel 1943 hanno fornito una soluzione ingegnosa a questo problema con il cavalone di fluttuazione⁵ (vedi Figura 1). L’analisi inizia con più popolazioni (denominate colture parallele) che vengono avviate con un numero ridotto di cellule microbiche (Figura 1A,B). Dopo la crescita in un ambiente benigno e non selettivo (Figura 1C), le colture parallele vengono trasferite su lastre contenenti un marcatore selettivo (fagi, antibiotici, ecc.), dove sopravvivono solo le cellule con mutazione di resistenza che possono produrre una colonia (Figura 1D). L’aspettativa principale era che se le mutazioni di resistenza sono indotte, il numero di cellule che portano una mutazione dovrebbe essere distribuito tra diverse popolazioni con la media uguale alla varianza. Ciò che Luria e Delbràck hanno scoperto con l’analisi della fluttuazione è che il numero di mutanti ha oscillato drasticamente e che la varianza nel numero di mutanti tra le diverse popolazioni era notevolmente maggiore della media. Luria e Delbràck hanno quindi dimostrato che le mutazioni sono spontanee. Hanno dimostrato che le mutazioni emergono spontaneamente ogni volta che il DNA viene replicato, e il numero di mutanti dipende da quando la mutazione si verifica durante la crescita della popolazione. Vedere Figura 1C, in cui sei popolazioni, ognuna avviata con una cellula microbica (in blu), si verificano nessuna, 1 o 2 singole mutazioni. Le popolazioni A1, E1 e F1 hanno sperimentato una singola mutazione (prima cellula rossa), ma poiché una singola mutazione emerge spontaneamente in vari punti temporali durante un ciclo culturale, le popolazioni hanno finito con un numero molto diverso di mutanti osservati (quattro, due e uno, rispettivamente). D’altra parte, le popolazioni C1 e G1 hanno finito con lo stesso numero di mutanti osservati come E1 e A1, nonostante abbiano sperimentato due eventi mutazionali piuttosto che uno. La fluttuazione dei mutanti osservati tra le popolazioni non solo ha dato il nome all’analisi, ma ha anche mostrato che una frequenza mutante (cioè la proporzione di cellule mutanti) è un indicatore inadeguato del tasso di mutazione.

L’obiettivo generale del saggio di fluttuazione è quello di stimare il tasso di mutazione spontanea di un particolare genotipo di batteri o di altri organismi unicellulari che crescono in un particolare ambiente liquido. Il test di fluttuazione rimane lo strumento più appropriato per studiare la dipendenza ambientale dei tassi di mutazione microbica e consente una stima rapida e poco costosa del tasso di mutazione. Approcci alternativi alla stima del tasso di mutazione, come il sequenziamento di massima profondità⁶, il sequenziamento della popolazione⁷, gli esperimenti di accumulo di mutazioni⁸o il confronto delle sequenze genomiche di una prole con quelle dei genitori⁹ sono molto più laboriosi e quindi poco adatti a rilevare potenziali dipendenze ambientali. Tuttavia, gli aspetti dinamici della generazione e della riparazione di una mutazione sono in gran parte inaccessibili a un saggio di fluttuazione o a uno qualsiasi dei metodi per valutare un tasso di mutazione sopra elencato. Per studiare come il numero di mutazioni cambia nel tempo, nello spazio o tra le singole cellule all’interno di una popolazione,^sono necessarie le¹²cellule singole, che, oltre ad essere più laboriose dei saggi di fluttuazione, richiedono competenze e attrezzature altamente specializzate.

In pratica, un saggio di fluttuazione sta contando le cellule che ottengono un marcatore fenotipica a causa di una mutazione che si verifica in un ambiente privo di selezione per quel marcatore. La meta-analisi di centinaia di saggi pubblicati¹⁰ mostra che almeno 39 diversi marcatori fenotipici sono stati utilizzati dall’inizio del saggio nel 1943. Il test di fluttuazione può essere utilizzato per confrontare le medie e la dipendenza ambientale dei tassi di mutazione tra i ceppi di laboratorio, clinici, non mutatori e mutatori che crescono in ambienti permissivi. Il test consente la stima del tasso di mutazione in cellule con diversi background genetici che crescono in ambienti minimi o ricchi. Il saggio è adatto non solo per le popolazioni che crescono come monocoltura, ma può anche essere utilizzato per studiare gli effetti delle interazioni cellula-cellula sui tassi di^{mutazione 11}. Quando il ceppo di interesse è cocolto con un secondo ceppo, e un marcatore neutro viene utilizzato per distinguere i ceppi, i tassi di mutazione possono essere analizzati per due ceppi nello stesso tubo allo stesso tempo.

I saggi di fluttuazione hanno rivelato che il tasso di mutazione spontanea dipende sia dal genotipo di una cellula che dal suo ambiente¹² ed è un tratto che si evolve^{a sé 13}. Ogni volta che il tasso di mutazione di un particolare genotipo cambia con l’ambiente, è descritto come plasticità del tasso di mutazione¹¹. I tassi di mutazione plastica sono stati affrontati in modo più accurato per la mutagenesi indotta dallo stress (SIM)¹⁴. Inoltre, usando saggi di fluttuazione, è stato recentemente dimostrato che la densità a cui cresce una popolazione di cellule (in genere una coltura batch a capacità di trasporto) è strettamente associata ai tassi di mutazione tra batteri ed eucarioti unicellulari. Il tasso di mutazione per genoma per generazione diminuisce in popolazioni dense di ben 23 volte^10,¹¹. Questa plasticità del tasso di mutazione associata alla densità (DAMP) può dipendere da un sistema di rilevamento del quorum¹⁵ e agire indipendentemente dalla SIM¹⁶.

Qui, viene presentato un protocollo dettagliato per il saggio di fluttuazione utilizzato per studiare escherichia coli ceppo K-12 guadagnando resistenza alla rifampicina antibiotica in un ambiente mediatico minimo glucosio. Tuttavia, questo protocollo dovrebbe essere visto come un modello di base che può essere utilizzato per studiare un’ampia varietà di microbi semplicemente modificando le condizioni di coltura e i marcatori fenotipici della mutazione. Il protocollo si è evoluto dalla sua nascita⁵^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹^,²²^,²³^,²⁴^,²⁵,²⁶^,²⁷^,²⁸^,²⁹ attraverso il suo utilizzo su una vasta gamma di microbi e anche le cellule tumorali³⁰ ed è stato modificato per aumentare la produttività, che era essenziale per testare correttamente le dipendenze ambientali dei tassi di^mutazionemicrobica 10^,¹¹^,¹⁶. Il protocollo qui descritto non copre tutte le questioni metodologiche e analitiche del saggio di fluttuazione che sono già state ben discusse nella letteratura, in particolare gli effetti di fitness delle mutazioni resistenti³¹, ritardo fenotipico³², morte cellulare³³, e l’idoneità di vari algoritmi disponibili per stimare i tassi di mutazione²⁶^,³⁴. Ciò può essere importante, ad esempio, quando la dipendenza ambientale degli effetti del fitness può provocare variazioni errate nelle stime del tasso di mutazione³⁵. Tuttavia, notiamo che gli strumenti analitici che usiamo qui possono affrontare la variazione nella forma fisica mutante e nella morte cellulare. Come affrontato nelle note e nella discussione, si raccomanda anche di considerare più marcatori fenotipici che difficilmente avrà gli stessi effetti di fitness dipendenti dall’ambiente. Questo protocollo consentirà alle persone di testare regolarmente le dipendenze ambientali dei tassi di mutazione nella diversità dei ceppi e degli ambienti microbici. Affermare che le mutazioni in ambienti diversi non sono ancora state testate a fondo e, una volta presa in considerazione la densità della popolazione, i test di fluttuazione possono fornire una stima più precisa del tasso di^{mutazione 10}. Questo protocollo consentirà di eseguire più saggi di fluttuazione, come è necessario per comprendere i meccanismi alla base dei tassi di mutazione, che a loro volta è vitale per comprendere l’evoluzione, la carcinogenesi, l’invecchiamento e la resistenza agli antimicrobici.

Protocol

1. Giorno 1: Inoculazione e acclimatazione delle culture Inoculare 3 mL di brodo di lisogenia liquida (LB, vedi tabella supplementare 1) con un graffio di ghiaccio proveniente dallo stock di glicerolo di E. coli MG1655 (18% di glicerolo, -80 gradi centigradi). Agitare la coltura LB a 120 giri/min per 7 h a 37 gradi centigradi. NOT:</ In questo esperimento, viene utilizzato E. coli K12 MG1655 che cresce in LB, ma questo saggio può essere eseguito con qualsiasi ceppo E. coli o qualsiasi altra specie microbica culturable. La temperatura di incubazione, i tempi di incubazione e il livello nutritivo dei mezzi di crescita possono essere tutti soggetti a variazioni per specie o ceppi. Diluire la cultura di 2.000 volte utilizzando la soluzione salina. Aggiungete 100 l di soluzione diluita a tre tubi polimerici conici a berretto a vite da 50 mL (50 mL) con 10 mL di minimo medio liquido Davis (DM, vedi la tabella supplementare 1), contenenti rispettivamente 80 mg/L, 125 mg/L o 250 mg/L di glucosio. Questo è lo stesso mezzo (cioè l’ambiente) in cui sarà stimato il tasso di mutazione. Agitare le colture a 120 giri/mdurante. NOT:</ La scelta dei mezzi di comunicazione è soggetta a variazioni per specie, ceppo o domanda di ricerca. 2. Giorno 2: Generazione di mutanti nelle culture parallele In primo luogo, preparare gli ambienti in cui i batteri saranno coltivati. Preparare sempre il 10% in più del necessario (cioè, venti colture da 1 ml richiedono 22 mL). Preparare 22 mL di 1) DM con 80 mg/L di glucosio, 2) DM con 125 mg/L di glucosio, 3) DM con 250 mg/L di glucosio, 4) DM con 80 mg/L di glucosio e 5) DM con 250 mg/L di glucosio in cinque tubi da 50 mL. Etichettarli rispettivamente come GLC-80A, GLC-125, GLC-250A, GLC-80B e GLC-250B. Preparare inocula per gli ambienti. Assicurarsi che l’inoculum per 1 mL dell’ambiente contenga 1.000-5.000 celle. A tale scopo, attenersi alla seguente procedura. Misurare la densità ottica (OD) delle colture notturne (dal punto 1.2) a 600 nm. Diluire ogni coltura durante la notte al fine di raggiungere una densità finale di 1.000-5.000 cellule per mL di DM con glucosio. Nelle nostre mani, se l’OD misurato in 2.2.1 è 0.3, questo significa fare una diluizione 100 volte (in soluzione salina) della cultura notturna, quindi aggiungendo 11l di questa soluzione all’ambiente 22 mL. Preparare culture parallele.NOTA: Questo protocollo è scritto per una piastra di pozzo profondo 96, eseguendo cinque saggi di fluttuazione (il numero massimo ragionevole su un 96 bene piastra), utilizzando tre ambienti. Con l’esperienza, più piastre di pozzi profondi possono essere eseguite in parallelo. Creare un layout casuale di impostazioni cultura parallele per una piastra di pozzo profondo 96. Lo script Supplementary R LayoutGenerator.R (vedere il layout in Figura 1B) può essere utilizzato per questo. Posizionare ogni coltura parallela sulla piastra 96 pozzo profondo in base al layout. NOT:</ L’esecuzione di LayoutGenerator.R garantisce che il primo saggio abbia 20 impostazioni cultura parallele e che il secondo, il terzo, il quarto e il quinto saggio abbiano 19 impostazioni cultura parallele ciascuna. Trasferire 1 mL di supporti inoculati in ogni pozzo di una piastra di pozzo profondo 96 secondo il layout randomizzato. Fissare il coperchio della piastra del pozzo profondo con il nastro. Non fissare il coperchio strettamente, perché la crescita della cultura è sensibile alla quantità di aerazione. Pesare l’intera piastra con il coperchio e il nastro e scuotere la piastra a 250 rpm per 24 h a 37 gradi centigradi. Mettere 2 L di acqua distillata nell’incubatrice per stabilizzare la quantità di evaporazione tra i set sperimentali. Determinare la dimensione dell’inoculum placcando 10 l di ciascun supporto inoculato sulla piastra di agar Tetrazolium (TA) non selettiva (TA) (vedere Tabella supplementare 1). Utilizzare uno spalmatore sterile a forma di L fino a quando la superficie dell’agar non è asciutta. Incubare il coperchio delle piastre di agar TA durante la notte a 37 gradi centigradi. NOT:</ TA agar è un agar ricco che contiene lo zucchero L-arabinose e il colorante solubile in acqua 2,3,3,5 tripiltetrazolium cloruro cloruro, che è incolore nella sua forma ossidante. Quando i batteri riducono il tinrito, diventa rosso a causa della formazione di formazan. Le colonie su TA agar che non possono utilizzare L-arabinose sono di colore rosso scuro. Altri ceppi, come MG1655, sono rosati. L’uso di TA agar piuttosto che agar LB standard è raccomandato perché le colonie batteriche colorate sono più facili da individuare, il che rende il conteggio delle colonie più affidabile e più veloce. Preparare l’agar TA selettivo contenente rifampicina in 6 piatti di pozzo. Pipetta 5 mL del selettivo agar TA in ogni pozzetto delle 6 piastre del pozzo. Preparare l’antibiotico rifampicina poco prima che venga aggiunto all’agar TA.NOTA: Quando la cicloserina viene utilizzata come marcatore, utilizzare Davis mezzo minimo con 250 mg/L di glucosio integrato con agar e L-arabinose e 2,3,5-tripiltetrazolium cloruro di cloruro come agar selettivo. Vale adire TA non seleziona solo le cellule che sono resistenti alla cicloserina, perché tryptone e lievito estratto (entrambi i componenti essenziali di TA agar) contengono l’amminoacido D-alanina. Questo aminoacido antagonizza l’effetto antimicrobico della cicloserine e permette a tutte le cellule di fare una colonia. Lasciare le piastre selettive e rimanenti non selettive al buio (ad esempio, in una scatola) a temperatura ambiente. 3. Giorno 3: placcatura delle colture su piastre di Agar selettive e non selettive Contare le unità formanti colonia (CFU) sulle piastre di agar non selettive e determinare la dimensione dell’inocula moltiplicando la CFU per 100. Si tratta di un rapporto tra un volume della coltura parallela (1 mL e 1.000 l) e il volume piallato (10 l). NOT:</ Se le piastre non selettive sono conservate refrigerate, la CFU può essere conteggiata in un secondo momento. Dopo 24 h di incubazione, pesare l’intera piastra del pozzo profondo per determinare la quantità di evaporazione. È probabile che si tratti di circa il 10%. Calcolare il volume medio di una coltura parallela dopo 24 h di incubazione (V[24h]) nei microlitri utilizzando un volume iniziale V[0h] e il peso della piastra convertito in microlitri, dove la densità del mezzo di crescita è misurata in mg/l. Questo studio utilizza una densità di 1 mg/l: Trasferire le tre colture scelte casualmente per analisi (15 in totale, evidenziate con un cerchio nero nel layout in Figura 1B) in tubi di microcentrismoazione etichettati. Lasciarli sul banco per essere utilizzati in seguito (vedere il passaggio 3.6) per determinare la dimensione finale della popolazione (o Nt). Piastrare le restanti 81 colture parallele dalla piastra del pozzo profondo sul selettivo TA agar contenente rifampicina. Pipette un intero cultura parallela dal 96 piastra profondo pozzo in un pozzo di una piastra di 6 pozzetti. Assicurarsi che qualsiasi piastra 6 pozzi contenga colture parallele da più di un’analisi di fluttuazione. Rimuovere i coperchi dalle piastre selettive di agar e lasciare scoperti in condizioni sterili. Asciugare tutto il liquido sulla superficie dell’agar TA selettivo. NOT:</ L’agar essendo completamente asciutto è fondamentale. Tuttavia, non asciugare l’agar TA selettivo, perché non deve essere permesso di rompere. Mentre le piastre selettive di TA agar si stanno asciugando, che possono richiedere fino a diverse ore, determinare Nt delle 15 culture preparate nel passo 3.4 utilizzando unità formanti colonia (CFU). Determinare la CFU diluendo le colture dai tubi di microcentrifuga. Utilizzare cinque gradini di diluizione di 10 volte, mescolando e vortice 900 l di soluzione salina con 100 gradi della coltura su ogni passo. Piastra 40 -L dell’ultima diluizione (con un fattore di diluizione di 105)sull’agar TA non selettivo e il coperchio delle piastre di incubazione verso il basso durante la notte a 37 gradi centigradi. NOT:</ La serie di diluizione in 96 piastre ben può essere eseguita con una pipetta multicanale, che può aumentare la velocità di questo passo. Una volta che tutti i pozzi su un 6 pozze sono liberi dal liquido di coltura, mettere il coperchio e mettere la piastra 6 pozzo con il coperchio giù sulla panca fino a quando tutti i 6 piatti del pozzo sono asciutti. Una volta che tutte sono asciutte, incubare il coperchio delle piastre a 37 gradi centigradi per 44-48 h. NOT:</ Per altri marcatori (acido nalidixico, cicloserine, igromicina B o 5-FOA) incubano le piastre per 68-72 ore. Assicurarsi che l’umidità nell’incubatrice sia alta. È fondamentale che le piastre selettive di agar non si asciughino durante il periodo di incubazione. 4. Giorno 4: Determinazione del numero di cellule nelle culture Contare la CFU sulle piastre di agar non selettive. Stimare il numero di cellule vitali nella coltura moltiplicando la CFU con il fattore di diluizione (105) e il rapporto tra il volume medio calcolato V[24h] nei microlitri (vedi passo 3.3) e il volume placcato (40: Nt di un particolare genotipo che cresce in un particolare ambiente è la media di questi valori dalle tre culture. 5. Giorno 5: Stima del tasso di mutazione Contare il numero di colonie resistenti all’antibiotico sulle piastre selettive di TA agar (cioè il numero di cellule resistenti che sono sorte per mutazione spontanea nella piastra del pozzo profondo nei giorni 2/3). Registrare la distribuzione tra le colture parallele del numero osservato di mutanti per un particolare saggio (ad esempio, 16 o 17 valori, compresi i conteggi zero).NOTA: Se le piastre selettive vengono conservate refrigerate, le colonie resistenti all’antibiotico possono essere conteggiate in un secondo momento. Utilizzare ogni distribuzione per stimare il numero di eventi mutazionali, m, utilizzando il pacchetto R flan36. NOT:</ C’è anche il R-package rSalvador con funzionalità simili29. Salvare la distribuzione dei mutanti osservati per un saggio in un file di testo come una singola colonna. Utilizzare il software Shinyflan (http://shinyflan.its.manchester.ac.uk/) per stimare m come descritto di seguito. Nella scheda Ipotesi test lasciare i valori come valori predefiniti (ad esempio, Idoneità Sconosciuta selezionata, Metodo di stima – Massima probabilità (ML), Distribuzione della durata dell’mutante – Esponenziale (modello LD), parametro di Winsor : 1,024, Numero di mutazione e fitness n. 1, Livello di confidenza – 0,95, Numero di classe e Valore massimo 100). Fare clic su Sfoglia e selezionare il file di testo con la distribuzione dei mutanti osservati. Provare prima con il file di dati supplementari. Dopo aver caricato il file, fare clic su Esegui test. Sul lato destro sotto il risultato del test, sotto il modello One Sample ML-Test (LD), trovare il numero di mutazione. Questo è m, il numero previsto di eventi mutazionali. Sotto l’intervallo di confidenza del 95% per il numero di mutazione trovare il limite superiore e inferiore di m. Una volta che m e Nt (determinati dalla CFU) sono disponibili, stimare il tasso di mutazione di un particolare genotipo in un particolare ambiente come . Dividere i limiti superiore e inferiore su m per Nt nello stesso modo per generare intervalli di confidenza sul tasso di mutazione (NB questo non tiene conto dell’incertezza in Nt). NOT:</ I risultati sono presentati come il tasso di mutazione per locus rpoB per generazione. Il tasso di mutazione per coppia di basi è generato dividendo il tasso di mutazione per locus rpoB per 79, che è la nostra conoscenza attuale di quante mutazioni puntiformi all’interno di un gene rpoB conferiscono resistenza alla rifampicina37. Moltiplicando il tasso di mutazione per nucleotide per la dimensione del cromosoma (E. coli K-12 MG1655 , 4.639.675 bp), si ottiene il tasso di mutazione per genoma. Ripetete i passaggi 5,1 e 5,3 con i restanti quattro saggi di fluttuazione.

Representative Results

I risultati sono stati raccolti con il protocollo segnalato in quattro settimane diverse da tre diversi ricercatori individuali, dove ogni settimana veniva utilizzata una placca di 96 pozzi profondi per generare cinque stime del tasso di mutazione. Complessivamente tre 96 piastre di pozzi profondi hanno generato 15 stime del tasso di mutazione (intervallo di confidenza del 95%, CI) in E. coli K-12 MG1655(Figura 2A, come utilizzato nel protocollo), mentre una piastra di pozzo profondo 96 è stata utilizzata per cinque stime (95% CI) di E. coli K-12 BW251113 – mutmut mut(Figura 2B). Nella Figura 2 la precisione mediana con intervallo interquartile di stima m è 17,5% (1,00% , 28,9%, n , 20). La precisione è un coefficiente della variazione del numero previsto di eventi mutazionali (m) calcolato come m / m x 100% (dove viene calcolato come mostrato in precedenza38). I dati non elaborati per la figura 2 sono disponibili nel file di dati supplementari “Krasovec_etal_JoVE_data.csv”. Il File di dati supplementari è accompagnato da uno script R per generare la figura 2. Vedere anche tabella supplementare 2 per ulteriori dettagli sui ceppi batterici e Tabella supplementare 3, in cui vengono illustrate le colonne del file di dati. I punti di dati acquisiti con rifampicina e acido nalidixico sono stati precedentemente pubblicati in Kraovec et al.10 e hanno gli stessi ID qui come quando sono stati pubblicati per la prima volta. Nella Figura 2A vengono presentati i tassi di mutazione MG1655 di tre diversi marcatori fenotipici, cicloserine, rifampicina e acido nalidixico. Qui, i tassi di mutazione sono stati valutati in Davis mezzo minimo con 80, 125, e 250 mg/L di glucosio, come spiegato nel protocollo. In un caso sono stati utilizzati 1.000 mg/L di glucosio (Figura 1B). In pratica, può essere utilizzato qualsiasi concentrazione iniziale di glucosio. Come previsto, i tassi di mutazione erano più alti per la resistenza alla cicloserina, più bassi per la resistenza all’acido nalidixico, e il tasso di resistenza alla rifampicina era nel mezzo. Questo è in conformità con le dimensioni di destinazione noti per queste tre resistenze, dove la più grande è per la cicloserina e la più piccola per l’acido nalidixico. La discussione e la figura 3 forniscono dettagli su come sfruttare le dimensioni degli obiettivi, i volumi di colture parallele e il livello di nutrienti nell’ambiente per ottimizzare la misurazione dei tassi di mutazione microbica con l’analisi della fluttuazione. L’essenza di un saggio di fluttuazione mostra chiaramente quale ceppo è un mutatore di stivigli e quale ha tassi di mutazione normali. Il ceppomutT aumentava di circa 50 volte a resistenza dell’acido nalidixico (Figura 2B) come MG1655 (Figura 2A). Tuttavia, per determinare il tasso di mutazione di un particolare genotipo in ambienti diversi, si consiglia di fare almeno cinque repliche per genotipo per ambiente utilizzando un solo marcatore fenotipico. Per una descrizione dettagliata dei metodi statistici precedentemente utilizzati per analizzare questo tipo di esperimento, vedere le informazioni supplementari in Kraovec etal. Figura 2: Figura rappresentativa dei tassi di mutazione stimati dalla oscillazione del saggio nelle popolazioni di Escherichia coli. (A) Il tasso di mutazione determinato dal protocollo riportato nel tipo selvaggio MG1655 (cerchi). La figura mostra i tassi di mutazione in presenza di rifampicina (cerchi azzurri), acido nalidixico (cerchi rossi) e cicloserine (cerchi blu scuro) resistenza. Per l’acido nalidixico, sono stati utilizzati volumi di coltura più grandi di 10 mL (vedere File di dati supplementari). I dati relativi al rifampicin e all’acido nalidixico vengono ritracciati dalla Figura 2a in Kraovec et al.10. (B) Il tasso di mutazione della resistenza dell’acido nalidixico nel mutante Keio39 -mutT (triangoli rossi). Si noti la scala logaritmica sull’asse del tasso di mutazione. Barre di errore: intervalli di confidenza del 95% calcolati come spiegato nel protocollo. I dati vengono ritracciati dalla Figura 4a in Kraovec etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Un diagramma di flusso per la risoluzione dei problemi relativi all’esempio di fluttuazione. Il diagramma di flusso deve essere seguito dall’alto, affrontando le tre domande nei diamanti gialli a sua volta, regolando il protocollo in base al contenuto delle caselle verdi risultanti e implementando il protocollo come indicato negli ovali rossi. Vedere i primi tre paragrafi della discussione per ulteriori dettagli su come risolvere i problemi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Tabella supplementare 1: formule per i supporti utilizzati nel protocollo. Fare clic qui per visualizzare questa tabella (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare). Tabella supplementare 2: ceppi batterici. Fare clic qui per visualizzare questa tabella (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare). Tabella supplementare 3: descrizione dettagliata delle colonne nel file di dati non elaborati Krasovec_etal_JoVE_data.csv. Fare clic qui per visualizzare questa tabella (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare). File di dati supplementari. Fare clic qui per scaricare questi file.

Discussion

Qualsiasi stima di un tasso di mutazione deve massimizzare la precisione raggiunta al fine di garantire ripetibilità e riproducibilità all’interno e tra gli studi³⁴. Per un saggio di fluttuazione, ci sono tre considerazioni critiche. I primi due sono stati impostati nel protocollo indicato, ma sarà necessario risolvere i problemi (vedere la figura 3) se il protocollo è adattato per funzionare con ceppi o ambienti diversi. In primo luogo è quello di scegliere il marcatore fenotipica appropriato. Per i batteri, si raccomanda di stimare i tassi a uno dei due loci marcatori, rpoB o gyrA, conferendo resistenza agli antibiotici rifampicina e acido nalidixico, rispettivamente. La dimensione bersaglio delle mutazioni alla resistenza agli antibiotici a questi due loci è diversa. Ci sono 79 e 20 mutazioni uniche che conferiscono resistenza al rifampicina³⁷ e all’acido nalidixico⁴⁰ rispettivamente. In pratica, ciò significa che, in media, i mutanti resistenti alla rifampicina sono osservati più frequentemente. Quindi, la prima domanda (Q1 in Figura 3) che deve essere risolta è se il ceppo è o meno un mutatore. Quando si studiano i mutatori di stitutive, dove si prevedono molte colonie mutanti osservate, è meglio usare un marcatore con una dimensione bersaglio più piccola (ad esempio, acido nalidixico). Vedere la Figura 2B, in cui i tassi di mutazione del mutatore costitutivo E. coli K-12 BW25113-mut T sono stati stimati utilizzando l’acido nalidixico come marcatore. Quando si lavora con ceppi batterici non mutatori che hanno un tasso di mutazione di tipo selvaggio (cioè normale), la rifampicina è una scelta migliore (vedi Figura 2A). Se per qualche motivo sono necessari più mutanti osservati, un marcatore rilevante è la resistenza a una cicloserina. Per questo marcatore, le mutazioni di resistenza possono emergere in più di dieci geni⁴¹, il che significa che la dimensione del bersaglio è ancora maggiore rispetto alla rifampicina. Quando si studia lievito e archea si raccomanda di stimare i tassi di mutazione in 25S proteine ribosomiche e URA3, conferendo resistenza rispettivamente all’igromicina B e all’acido 5-fluoro-orotico (5-FOA).

La seconda considerazione critica è il volume delle culture parallele. Il volume da utilizzare dipende dal numero effettivo di mutanti osservati. Il numero previsto di mutanti osservati è influenzato dalla dimensione bersaglio del marcatore fenotipico prescelto, dalla capacità del ceppo di riparare ed evitare le mutazioni (il tasso medio di mutazione) e dalla capacità di trasporto dell’ambiente, che è influenzato sia dai media utilizzati che dal volume culturale. Se non esistono colture parallele concolonie mutanti resistenti alla rifampicina, allora si dovrebbe usare la cicloserina o aumentare il numero di cellule placcate. Questo può essere ottenuto aggiungendo più glucosio a un mezzo minimo o crescendo le cellule in un ambiente più ricco (o completo). Tuttavia, in molti casi, tale aumento della densità di popolazione è associato a una riduzione del tasso di mutazione, con conseguente aumento limitato, se del caso, del numero di colonie mutanti osservate¹⁰. Se aumentare i nutrienti non è una soluzione, allora aumentare il numero di cellule aumentando il volume di ogni coltura parallela è un’opzione. Quando l’ambiente include sali minimi con zucchero come unica fonte di carbonio ed energia (cioè, la risposta al secondo trimestre nella Figura 3 è “mezzo minimo”), si dovrebbero utilizzare volumi compresi tra 0,5 e 1,5 mL. Se l’ambiente è ricco, i volumi di impostazioni cultura parallele devono essere compresi tra 0,35 e 1 mL. L’ultima questione riguarda il numero mediano di colonie resistenti. Se si osservano troppo poche colonie mutanti (cioè la risposta al terzo in Figura 3 è 0) e l’ambiente non deve essere modificato, è necessario aumentare il volume delle colture parallele o utilizzare l’antibiotico con una dimensione target maggiore (ad esempio, la cicloserina). D’altra parte, se molte colonie mutanti sono osservate su tutte le placche selettive (più di 150 dollari per piastra, vedi Figura 3), allora il numero di cellule placcate dovrebbe essere diminuito, il che di solito significa utilizzare un volume inferiore o passare a un antibiotico con una dimensione bersaglio più piccola (ad esempio, acido nalidisstico).

Una volta scelto il volume, è meglio che tutte le colture parallele su una piastra di pozzo profondo 96 abbiano lo stesso volume. Ciò consente una determinazione più precisa del volume effettivo delle colture parallele dal peso della piastra. Quando i tassi di mutazione di un particolare genotipo vengono confrontati tra ambienti diversi, è ancora meglio utilizzare lo stesso volume di colture parallele in tutti gli ambienti. Se l’acido nalidixico viene utilizzato per stimare i tassi di mutazione di tipo selvatico (cioè normale) o qualche altro marcatore fenotipipico che ha una dimensione bersaglio ancora più piccola dell’acido nalidixico, il volume deve essere aumentato ancora di più. Un’opzione è quella di fare colture parallele in tubi da 50 mL con volumi fino a 15 mL. Ad esempio, le colture parallele da 10 mL sono state preparate in tubi da 50 mL durante la stima del tasso di mutazione di E. coli K-12 MG1655 sull’acido nalidixico (vedi Figura 2A). Le colture parallele da 10 mL sono state poi placcate sull’agar TA selettivo e versate in grandi piastre da 150 mm invece di piatti Petri standard da 90 mm. Lo svantaggio della preparazione di colture parallele in tubi da 50 mL è che la produttività è notevolmente inferiore rispetto ai tassi di mutazione di 96. Una soluzione consiste nel ridurre il numero di impostazioni cultura parallele. Tuttavia, ciò influirà sulla precisione per la stima di m, che dipende dal numero previsto di eventi mutazionali e dal numero di colture parallele²⁶. Ottenere una distribuzione di mutanti osservati con 14-17 culture parallele (come è stato fatto nella Figura 2), è un buon equilibrio tra una velocità effettiva solida e un livello di precisione accettabile²⁶ del 20%. Un livello di precisione mediano del 17,5% è simile alla precisione mediana con un intervallo interquartile del 16,4% (5,7%, 38,9%, n – 580) calcolato da un set di dati molto più grande¹⁰. Pertanto, si raccomanda che quando si preparano colture parallele in 96 piastre di pozzi profondi o tubi da 50 mL la distribuzione dei mutanti osservati si ottiene con almeno 14 colture parallele. Quando i tassi di mutazione sono stimati in ambienti diversi, si raccomanda di testare i livelli di precisione facendo un esperimento di multiplate, in cui tutte le 96 colture parallele su una piastra vengono coltivate nello stesso ambiente. Inoltre, quando si preparano colture parallele, è fondamentale che l’inoculo contenga un basso numero di cellule, perché riduce le probabilità che le cellule resistenti siano presenti nell’inoculo. I mutanti resistenti preesistenti non sono voluti nell’inoculo, perché aumenteranno di numero e creeranno un prato su piastre selettive e la stima del tasso di mutazione non sarà possibile. Ad esempio, nella maggior parte delle popolazioni non mutator E. coli, il tasso di mutazione alla resistenza alla rifampicina è nell’ordine di 10^-8. Così, per evitare di inoculare la coltura con un mutante resistente preesistente, si deve inoculare con meno di 10⁸ cellule (ad esempio, 10³.10⁴ cellule). Il passo finale critico è quello di garantire che prima che le piastre selettive di agar vengano incubate, la superficie sull’agar selettivo sia completamente asciutta. Gli spalmatori non possono essere utilizzati se vengono utilizzate piastre a 6 pozze e il volume iniziale di una coltura parallela è, ad esempio, di 1 mL. Le piastre devono essere lasciate scoperte in condizioni sterili per far asciugare il liquido superficiale. Il tempo necessario può essere molto variabile, a seconda delle condizioni ambientali e delle condizioni delle piastre. Questo tempo dovrebbe essere ridotto al minimo, ma può essere fino a diverse ore.

Il saggio di fluttuazione ha vincoli intrinseci. : forma marcatori fenotipici di mutazione solo in un piccolo sottoinsieme del genoma. Il saggio richiede quindi grandi popolazioni che attraversano un numero sufficiente di generazioni per osservare abbastanza mutazioni per stimare un tasso a tutti. Ciò significa che i saggi di fluttuazione possono essere utilizzati solo su organismi che sono in grado di passare attraverso un gran numero di generazioni rapidamente, come batteri, lievito di panettiere⁴², o cellule di mammiferi a coltura liquida³⁰. Inoltre, le mutazioni sono eventi rari che si verificano nelle circostanze biochimiche specifiche di una particolare cellula. Il fatto che i saggi di fluttuazione guardino attraverso grandi popolazioni di cellule nel tempo significa che tali circostanze possono differire sostanzialmente. Usando questo saggio, è quindi difficile studiare la progressione dei tassi di mutazione di una particolare popolazione dalla fase di ritardo alla fase esponenziale precoce e tardiva e infine ad una fase stazionaria. Qualsiasi differenziazione dei tassi di mutazione tra le singole cellule all’interno della popolazione è completamente nascosta dall’asino della fluttuazione. La dinamica della mutazione unicellulare può essere studiata con un monitoraggio a singola molecola della proteina di riparazione del DNA MutS⁴³ o contando i foci delle proteine MutL accumulate⁴⁴. I recenti progressi nel sequenziamento ad alto valore di throughput hanno anche permesso di stimare direttamente i tassi di mutazione dai tre trio genitore-prole⁹^,⁴⁵ e pedigree multigenerazionali⁴⁶. Tali progressi metodologici stanno cominciando a consentire il conteggio diretto delle mutazioni che si verificano all’interno di una singola generazione. Tuttavia, questo approccio diretto richiede tecnologie costose e all’avanguardia come la microscopia a fluorescenza, la microfluidica o il sequenziamento dell’intero genoma. D’altra parte, il saggio di fluttuazione è relativamente poco costoso ed è necessaria solo attrezzature di laboratorio standard. Fare più saggi di fluttuazione faciliterà anche la generazione di nuove ipotesi che possono essere testate con approcci più diretti a singola cellula.

C’è un interesse di lunga data nello studio delle mutazioni, quindi l’esame di fluttuazione rimarrà probabilmente un metodo ampiamente utilizzato. Il numero di citazioni del documento seminale di Luria e Delbràck⁵ negli ultimi 4 anni (2015-2018) sono stati tutti tra i primi cinque per le citazioni di questo documento. Tuttavia, a causa di una grande quantità di lavoro manuale preciso necessario per eseguire correttamente un test di fluttuazione, la maggior parte degli studi conduce solo una manciata di analisi di fluttuazione. Questo, tuttavia, non è sufficiente a rivelare le dipendenze ambientali del tasso di mutazione. Semplificando i saggi di fluttuazione utilizzando piastre multiwell, come spiegato in questo documento, la velocità effettiva massima possibile è di 11 lastre di pozzo profondo (55 analisi di fluttuazione) in parallelo, come descritto qui. L’esecuzione di due serie di analisi di fluttuazione scaglionate di un giorno in parallelo, permette di eseguire fino a 110 analisi a settimana. Un altro cambiamento di passo nella velocità effettiva può ancora essere possibile automatizzando varie fasi dei saggi di fluttuazione dal protocollo puramente manuale dato. Inoltre, per studiare le dipendenze ambientali del tasso di mutazione, è necessario prendere in considerazione la densità di popolazione. I risultati precedenti¹⁰ mostrano che quando si calcolano fattori noti che influenzano il tasso di mutazione, il controllo della densità della popolazione può ridurre la variazione nelle stime del tasso di mutazione di oltre il 90%. Per controllare la densità, si consiglia di determinare N_t (utilizzato per stimare il tasso di mutazione) indipendentemente dal metodo utilizzato per determinare la densità di popolazione. Nei batteri, N_t può essere determinato dalla CFU e dalla densità, ad esempio, con un analisi di luminescenza basata su ATP¹⁰.

L’elevata produttività e il controllo della densità sono entrambi essenziali quando si studia come il contesto ecologico di un organismo influenzi il tasso di mutazione spontanea. Conoscere l’esistenza della plasticità del tasso di mutazione è importante, ma comprenderne le cause e gli effetti sono sfide fondamentali che devono essere affrontate se si vuole integrare la plasticità del tasso di mutazione in un contesto biologico più ampio. Il test di fluttuazione è un ottimo strumento che può essere utilizzato per testare molte ipotesi, perché i risultati sono ottenuti rapidamente, e i saggi sono poco costosi rispetto ad altri metodi. Lo stadio è impostato, ad esempio, per studiare le dipendenze ambientali del tasso di mutazione nelle comunità batteriche e nei microbiomi. L’adattamento dell’analisi della fluttuazione alle coculture può testare l’ipotesi che i ceppi influenzino i tassi di mutazione reciproci tramite piccole molecole. Fare migliaia di saggi di fluttuazione con le coculture può determinare se i ceppi variano sia nella loro capacità di modificare i tassi di mutazione reciproci sia nella loro suscettibilità ad avere il loro tasso di mutazione modificato da altri. Forse la variazione tra i ceppi nella suscettibilità alla manipolazione del tasso di mutazione è attribuibile a una variazione genetica specifica. Questo può trasformare le nostre opinioni su come funziona l’evoluzione in comunità complesse, non da ultimo in esempi di grande importanza, come ad esempio come emerge la resistenza agli antimicrobici.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

RK è stata sostenuta da BB/M020975/1 e dalla University of Manchester School of Biological Sciences. HR era supportato da BB/J014478/1. GG è stato supportato da BBSRC Doctoral Training Partnership BB/M011208/1. DRG è stato supportato dal numero di premio UKRI MR/R024936/1.

Materials

1.5 ml Microcentrifuge tubes	Starlab International GmbH	S1615-5550
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	Sigma-Aldrich	T8877-10g
6-well plates	Greiner Bio-One	REF 657102
90mm Petri Dishes Triple Vented	ThermoFisher Scientific	REF 120189
96 deep-well plate (Masterblock 2 ml)	Greiner Bio-One	REF 780270
Ammonium sulfate	Fisher Chemical	A/6440/53
Bacto Agar	Becton, Dickinson and Company	REF 214010
Bacto yeast extract	Becton, Dickinson and Company	REF 212750
Cycloserine	Sigma-Aldrich	1158005-250MG	Only for assaying an alternative phenotypic marker
D-Glucose anhydrous	Fisher Chemical	G/0500/61
50 ml Centrifuge Tube	Corning	REF 430828
L-(+)-Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256-500g
Magnesium sulfate heptahydrate	Fisher Chemical	M/1050/53
Nalidixic acid	Sigma-Aldrich	N8878-5G	Only for assaying an alternative phenotypic marker
Potassium phosphate dibasic trihydrate	Sigma-Aldrich	P5504-500g
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662-500g
Rifampicin	EMD Millipore Corp, USA	557303-1GM
Sodium chloride	Fisher Chemical	S/3160/60
Spectophotometer	Jenway	6320D
Thiamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	T4625-25g
Trisodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	S1804-500g
Tryptone	Fisher Chemical	1278-7099

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Krašovec, R., Richards, H., Gomez, G., Gifford, D. R., Mazoyer, A., Knight, C. G. Measuring Microbial Mutation Rates with the Fluctuation Assay. J. Vis. Exp. (153), e60406, doi:10.3791/60406 (2019).

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