変動アッセイを用いて微生物突然変異率を測定する

突然変異率の任意の推定は、^研究34内および研究間の再現性および再現性を確保するために達成される精度を最大化する必要がある。変動アッセイには、3つの重要な考慮事項があります。最初の 2 つは、指定されたプロトコルで設定されていますが、プロトコルが異なる株または環境で動作するように適合している場合は、トラブルシューティングが必要です (図 3参照)。まず、適切なフェチピックマーカーを選択する。細菌の場合、rpoBまたはgyrAの2つのマーカーロチのいずれかで速度を推定することをお勧めします, 抗生物質リファンピシンとナリジキシン酸に対する耐性をそれぞれ与えます.これら2つの遺伝子座における抗生物質耐性に対する突然変異の標的サイズは異なる。リファンピ^シン37およびナリジキシン^酸40に対する耐性をそれぞれ付与する79および20のユニークな突然変異がある。実際には、これは平均して、リファンピシン耐性変異体がより頻繁に観察されることを意味する。したがって、最初に答える必要がある質問 (図 3の Q1) は、ひずみがミューテーションターであるかどうかです。多くの観察された変異コロニーが予想される構成変異体を研究する場合、より小さい標的サイズ(例えば、ナリジキシング酸)を有するマーカーを使用する方が良い。図2Bを参照し、構成変異体大腸菌K-12 BW25113ΔmutTの変異率を、ナリジキシング酸をマーカーとして用いて推定した。野生型(すなわち、通常)突然変異率を有する非変異体細菌株を用いて作業する場合、リファンピシンはより良い選択である(図2Aを参照)。何らかの理由でより多くの観察された突然変異体が必要な場合、関連するマーカーは、ヒクロセリンに対する耐性である。このマーカーの場合、抵抗突然変異は10個以上の^遺伝子41で出現する可能性があり、標的サイズがリファンピシンよりもさらに大きいことを意味する。酵母と古素を研究する場合は、25Sリボソームタンパク質とURA3の突然変異率を推定し、それぞれハイグロマイシンBおよび5-フルオロオロオロ酸(5-FOA)に対する耐性を与えることをお勧めします。

2 番目に重要な考慮事項は、並列カルチャのボリュームです。使用するボリュームは、実際に観測された突然変異体の数によって異なります。観測された突然変異体の予想数は、選択したフェオチピックマーカーの目標サイズ、突然変異を修復して回避する株の能力(平均突然変異率)、および使用される媒体と培養体積の両方によって影響を受ける環境の運搬能力の影響を受ける。並行培養物にリファンピシンに耐性のある変異コロニーが含まれていない場合は、シクロセリンを使用するか、めっき細胞の数を増やす必要があります。これは、最小限の培地にブドウ糖を追加するか、より豊かな(または完全な)環境で細胞を成長させることによって達成することができる。しかしながら、多くの場合、このような集団密度の増加は突然変異率の低下に関連しており、その結果、限られた結果、存在する場合^には、10を観察する変異コロニーの数の増加が生じる。栄養素を増やすことが解決策でない場合は、各並行培養の体積を増やすことで細胞数を増やすことが選択肢である。炭素とエネルギーの唯一の供給源として砂糖を含む最小限の塩が含まれている場合(すなわち、図3のQ2に対する答えは「最小媒体」)、0.5~1.5mLの体積を使用する必要があります。環境が豊富な場合、並列カルチャのボリュームは 0.35-1 mL の間である必要があります。最後の質問は、耐性コロニーの中央値に関するものです。あまりにも少ない突然変異コロニーが観察され(すなわち、図3のQ3に対する答えは0である)、環境が改変されない場合は、並列培養物の量を増やすか、より大きな標的サイズ(例えば、cycloserine)を有する抗生物質を使用すべきである。一方、すべての選択プレートで多くの変異コロニーが観察される場合(1プレートあたり〜150以上、図3を参照)、めっき細胞の数を減らすべきである。

ボリュームが選択されると、1つの96の深い井戸板上のすべての平行培養物が同じ体積を持つことをお勧めします。これは、プレートの重量から並列培養の実際の体積のより正確な決定を可能にします。特定の遺伝子型の突然変異率を異なる環境間で比較する場合、すべての環境で同じ量の並列培養を使用するのが最善です。野生型(すなわち、正常)突然変異率または他の表現型マーカーの推定にナリジキシング酸を使用する場合は、ナリジキシング酸よりもさらに小さい目標サイズを有するが、体積をさらに増加させる必要がある。1つのオプションは、最大15 mLの容積を有する50 mLチューブで並列培養を行うことです。例えば、10mLの並列培養物を、大腸菌K-12 MG1655変異率をナリジキシン酸に推定する際に50mLチューブで調製した(図2A参照)。平行な10 mL培養物を選択的TA寒天にめっきし、標準の90mmペトリ皿の代わりに大きな150mmプレートに注いだ。50 mLチューブで並列培養を調製する欠点は、96の深い井戸板のアッシャリ突然変異率に比べてスループットがかなり低いことです。1 つの解決策は、並列カルチャの数を減らすことです。ただし、これは mの推定値の精度に影響を与^えます。14-17並列培養(図2で行われたように)で観察された変異体の分布を得ることは、固体スループットと許容可能な精度^レベル26の20%との間の良好なバランスである。中央値の精度レベルが 17.5% は、はるかに大きなデータセット¹⁰から計算された四分位範囲が 16.4% (5.7%-38.9% n = 580) の中央値精度に似ています。したがって、96の深いウェルプレートまたは50mLチューブで並列培養を調製する場合、観察された変異体の分布は、少なくとも14の並列培養で得られることをお勧めします。異なる環境で突然変異率が推定される場合は、1つのプレート上のすべての96の並列培養が同じ環境で成長するマルチプレート実験を行って、精度レベルをテストすることをお勧めします。また、並列培養物を調製する際には、接種菌に耐性細胞が存在する可能性が低いため、イノクラに含まれる細胞数が少ないほど重要です。既存の耐性変異体は、数が増加し、選択的プレート上に芝生を作成し、突然変異率の推定が不可能であるため、接種体では望まれていません。例えば、ほとんどの非変異体大腸菌集団において、リファンピシン耐性に対する突然変異率は〜10−8の順である。したがって、既存の耐性変異体で培養物を接種しないように、108細胞未満(例えば、10³⁻¹⁰⁴細胞)で接種しなければならない。 最後の重要なステップは、選択的寒天プレートがインキュベートされる前に、選択的寒天上の表面が完全に乾燥していることを確認することです。たとえば、6 ウェルプレートを使用し、並列培養の初期体積が 1 mL の場合、スプレッダは使用できません。プレートは、表面の液体を乾燥させるために滅菌条件で覆い隠しておく必要があります。この時間は、周囲の条件とプレートの状態に応じて、非常に可変にすることができます。この時間は最小限に抑える必要がありますが、最大時間を使用できます。

変動アッセイには固有の制約があります。それは、ゲノムの小さなサブセットでのみ突然変異の表現マーカーをアッセイする。したがって、アッセイは、十分な数の世代を経て、速度を全く推定するのに十分な突然変異を観察する大きな集団を必要とする。これは、変動アッセイは、細菌、パン酵^母42、または液体培養哺乳動物^細胞30のような多数の世代を急速に通過することができる生物に対してのみ使用できることを意味する。また、突然変異は、特定の細胞の特定の生化学的状況で発生する稀な事象である。変動アッセイが時間の経過とむほどに大量の細胞に見えるということは、それらの状況が大きく異なる可能性があることを意味します。このアッセイを用いて、ラグ相から早期および後期指数位相、そして最終的に静止相までの特定の集団の突然変異率の進行を研究することは困難である。集団内の単一細胞間の突然変異率の分化は、変動アッセイから完全に隠されています。単細胞突然変異ダイナミクスは、DNA修復タンパク^質MutS43の単一分子追跡または蓄積されたMutLタンパク^質44の病巣をカウントすることによって研究することができる。ハイスループットシーケンシングの最近の進歩はまた、親子孫^{トリオ9、45および}多世代血^統46からの突然変異率を直接推定することを可能にした。このような方法論的進歩は、単一世代内で起こる突然変異の直接カウントを可能にし始めている。しかし、この直接的なアプローチには、蛍光顕微鏡、マイクロ流体、全ゲノムシーケンシングなどの高価で最先端の技術が必要です。一方、変動アッセイは比較的安価であり、標準的な実験装置のみが必要である。より多くの変動アッセイを行うことは、より直接的な単一細胞アプローチでテストされる可能性のある新しい仮説の生成を容易にします。

突然変異の研究には長年の関心があるので、変動アッセイは広く用いられている方法のままである可能性が高い。過去4年間(2015-2018年)のルリアとデルブ^{リュック5}によるセミナルペーパーの引用数は、すべてこの論文の引用のトップ5に入っています。しかし、変動アッセイを適切に行うために必要な精密な手作業が多いため、ほとんどの研究はほんの一握りの変動アッセイしか行っていない。しかしながら、これは突然変異率の環境依存性を明らかにするには不十分である。本論文で説明したように、マルチウェルプレートを用いて変動アッセイを合理化することにより、現在可能な最大スループットは、ここで説明するように11個の深井戸プレート(55変動アッセイ)を並行して行う。1日ずつずらした2組の変動アッセイを並行して実行することで、週に最大110のアッセイを行うことができます。スループットの別のステップの変化は、与えられた純粋に手動プロトコルから変動アッセイの様々なステップを自動化することによってまだ可能であり得る。また、突然変異率の環境依存性を研究するためには、集団密度を考慮する必要がある。前の^結果10は、突然変異率に影響を与える既知の因子が考慮されると、母集団密度を制御することで、突然変異率推定値の変動を90%以上減少させることができることを示している。密度を制御するには、集団密度の決定に使用される方法とは別に、N_t (突然変異率の推定に使用) を決定することをお勧めします。細菌において、Ntは、例えば、ATPベースの発光アッ^セイ10を用いてCFUおよび密度によって決定することができる。

生物の生態学的文脈が自発的突然変異率に及ぼす影響を調べるとき、高いスループットと制御密度は両方とも不可欠です。突然変異率可塑性の存在を知ることは重要であるが、その原因と効果を理解することは、変異率可塑性をより広い生物学的文脈に組み込む場合に満たす必要がある重要な課題である。変動アッセイは、結果が急速に得られ、アッセイは他の方法に比べて安価であるため、多くの仮説をテストするために使用できる素晴らしいツールです。ステージは、例えば、細菌群集および微生物叢における突然変異率の環境依存性を研究するために設定される。変動アッセイを共培養に適応させることで、株が小分子を介して互いの突然変異率に影響を与えるという仮説をテストできる。共培養で何千もの変動アッセイを行うことで、株が互いの突然変異率を変更する能力と、他の人によって突然変異率を改変する感受性の両方で変化するかどうかを判断できます。おそらく、突然変異速度操作に対する感受性における株間の変動は、特定の遺伝的変異に起因する。これは、抗菌性がどのように出現するかなど、広い重要性の例では、複雑なコミュニティにおける進化の仕組みに関する我々の見解を変えるかもしれない。