Measuring Microbial Mutation Rates with the Fluctuation Assay

Rok Kra&#353;ovec; Huw Richards; Guillaume Gomez; Danna  R. Gifford; Adrien Mazoyer; Christopher  G. Knight

doi:10.3791/60406

JoVE Journal > Genetics

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Genetics

قياس معدلات الطفرة الميكروبية مع مقايسة التذبذب

Published: November 28, 2019

doi:

10.3791/60406

Rok Krašovec¹, Huw Richards^2,3, Guillaume Gomez³, Danna R. Gifford¹, Adrien Mazoyer⁴, Christopher G. Knight³

¹School of Biological Sciences,The University of Manchester, ²School of Science,University of Waikato, ³School of Natural Sciences,The University of Manchester, ⁴Department of Mathematics,Université du Québec à Montréal

Summary

هنا ، يتم تقديم بروتوكول لاجراء فحص التذبذب وتقدير معدل الطفرة الميكروبية باستخدام علامات النمط الظاهري. سيمكن هذا البروتوكول الباحثين من فحص الطفرات في الميكروبات والبيئات المتنوعة ، وتحديد كيفيه تاثير النمط الجيني والسياق الايكولوجي علي معدلات الطفرة العفوية.

Abstract

وتستخدم علي نطاق واسع اختبارات التذبذب لتقدير معدلات الطفرة في الميكروبات التي تنمو في البيئات السائلة. العديد من الثقافات هي كل تطعيم مع بضعة آلاف من الخلايا ، كل حساسة لعلامة انتقائية التي يمكن ان تكون الاشعه الظاهرية. تنمو هذه الثقافات الموازية لأجيال عديده في غياب العلامة الظاهرية. وتستخدم مجموعه فرعيه من الثقافات لتقدير العدد الإجمالي للخلايا المعرضة لخطر الطفرات (اي حجم السكان في نهاية فتره النمو ، أو N_t). الثقافات المتبقية مطليه علي أجار انتقائي. ثم يتم استخدام توزيع المسوخ المقاومة المرصودة بين الثقافات الموازية لتقدير العدد المتوقع من الاحداث المتحولة ، m، باستخدام نموذج رياضي. تقسيم m بواسطة N_t يعطي تقدير معدل الطفرة لكل موضع لكل جيل. يحتوي الفحص علي ثلاثه جوانب حاسمه: العلامة الظاهرية المختارة ، والحجم المختار من الثقافات الموازية ، وضمان ان السطح علي أجار انتقائي جاف تماما قبل الحضانة. والفحص غير مكلف نسبيا ويحتاج فقط إلى معدات مختبريه قياسيه. كما انه اقل إرهاقا من النهج البديلة ، مثل تراكم الطفرات واختبارات الخلايا الاحاديه. الفحص يعمل علي الكائنات التي تذهب من خلال العديد من الأجيال بسرعة وانه يعتمد علي الافتراضات حول اثار اللياقة البدنية من علامات وموت الخلايا. غير ان الاداات والدراسات النظرية التي استحدثت مؤخرا تعني ان هذه المسائل يمكن الآن معالجتها تحليليا. ويسمح الفحص بتقدير معدل الطفرة لعلامات النمط الظاهري المختلفة في الخلايا ذات الأنماط الجينية المختلفة التي تنمو في عزله أو في مجتمع محلي. ومن خلال اجراء اختبارات متعددة بالتوازي ، يمكن استخدام المقايسات لدراسة كيف يؤثر السياق البيئي للكائن الحي علي معدل الطفرة العفوية ، وهو أمر حاسم لفهم مقاومه مضادات الميكروبات ، والسرطان ، والشيخوخة ، والتطور.

Introduction

في 1901 صاغ ال [بوتننيست] هولندية هيقو [د] [فريس] العبارة طفرة¹. بعد سته وعشرين عاما ، عندما اكتشف هيرمان جوزيف مولر عمل الطفرات من الاشعه السينية²، كان ينظر إلى الطفرات بالفعل باعتبارها واحده من القوي الدافعة للتطور. ومع ذلك ، فان طبيعة الطفرات ليست واضحة. للاجابه علي السؤال الأساسي عما إذا كانت الطفرات تظهر تلقائيا (اي طفرة عفويه) أو استجابه للاختيار (اي طفرة مستحثه) ، كانت هناك حاجه إلى طريقه لمراقبه الاحداث المتحولة. ومن شان هذه الطريقة ان تقيس العدد المتوقع من الطفرات في كل شعبه من الخلايا أو ما يعرف بالفعل بمعدل الطفرة³^،⁴.

الشكل 1: توضيح تخطيطي لكيفيه اجراء فحص التذبذب مع سلاله ميكروبيه في لوحه عميقة 96. (ا) تطعيم وتاقلم الخلايا في أنابيب 50 mL التي تحتوي علي خمس بيئات مختلفه (‘ الأحمر ‘ ، ‘ الأزرق ‘ ، ‘ الأخضر ‘ ، ‘ الأرجواني ‘ ، والاختبارات ‘ البرتقالي ‘). (ب) اعداد ثقافات موازيه مع عدد صغير من الخلايا الحساسة في صفيحه عميقة 96. ويحتوي الفحص “الأحمر” علي 20 ثقافة موازيه ، في حين ان الاختبارات “الزرقاء” و “الخضراء” و “الارجوانيه” و “البرتقالية” تحتوي جميعها علي 19 ثقافة موازيه. الموقعات من الثقافات موازيه علي ال 96 عميقة بئر لوحه بشكل عشوائي. ويمكن ان يتم العشوائية مع البرنامج النصي لايوتجينيراتور التكميلية أو من قبل بعض الاداات الأخرى. التخطيط في اعلي اليمين هو نتيجة العشوائية. (ج) احتضان لوحه البئر العميقة 96 والسماح للخلايا بالانقسام والتحول بشكل عفوي. ست ثقافات من الآبار العميقة A1 ، B1 ، C1 ، E1 ، F1 ، و G1 تظهر كيف يتقلب عدد المسوخ: 4 ، 0 ، 2 ، 2 ، 1 ، و 4 خلايا حمراء بعد تقسيم الخلية الثالثة ، علي التوالي. عدد المسوخ يختلف ليس فقط بسبب عدد مختلف من الطفرات العفوية (0, 1, أو 2 كما هو مبين من قبل الخلية الحمراء الاولي), ولكن أيضا لأنه من المهم عندما اثناء دوره الثقافة طفرة المقاومة يظهر تلقائيا (تقسيم الخلية 1, 2, أو 3). (د) بعد احتضان لوحه البئر العميقة 96 يتم تحديد عدد المسوخ عن طريق الطلاء 81 الثقافات الموازية. علي التخطيط هذه هي الدوائر دون حواف الغامق. يتم طلاء الثقافة الموازية بأكملها علي بئر واحد من 6 لوحه جيدا تحتوي علي أجار انتقائي. (ه) يتم تخفيف الثقافات ال 15 المتبقية وطلاءها علي أجار غير انتقائي لتحديد متوسط عدد الخلايا (N_t). علي التخطيط يوصف هذا ك [نتولس] ويتلقى حواف [بولدد]. ل كل فحص _{[ن] [ت} ] متوسطه علي ثلاثه ثقافات موازيه. في الجزء السفلي الأيمن هو طبق بتري يحتوي علي لوحه أجار غير انتقائية مع 25 CFUs من الثقافة المخففة المزروعة في بئر عميق D1 (جزئيا ‘ الأخضر ‘ مقايسة). (و) بعد احتضان لوحات البئر 6 انتقائية تم حساب عدد المسوخ المرصودة والعدد المتوقع من الاحداث المتحولة ، m، تم تقديرها باستخدام مقدر الاحتمال الأقصى. (ز) معرفه عدد الطفرات ، م، وعدد الخلايا لكل فحص ، N_t، وقد قدر معدل الطفرة بأنه m/N_t. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

وقدمت سلفادور لوريا وماكس ديلبروك في 1943 حلا بارعا لهذه المشكلة مع مقايسة التذبذب⁵ (انظر الشكل 1). يبدا الفحص مع العديد من السكان (تسمي الثقافات الموازية) التي بدات مع عدد قليل من الخلايا الميكروبية (الشكل 1ا ، ب). بعد النمو في بيئة حميده وغير انتقائية (الشكل 1ج) ، يتم نقل الثقافات الموازية علي لوحات تحتوي علي علامة انتقائية (phages ، والمضادات الحيوية ، وما إلى ذلك) ، حيث الخلايا فقط مع طفرة المقاومة البقاء علي قيد الحياة ويمكن ان تنتج مستعمره (الشكل 1د). وكان التوقع الرئيسي هو انه إذا حفزت طفرات المقاومة ، فان عدد الخلايا التي تحمل طفرة ينبغي ان يوزع بين فئات سكانية مختلفه بمتوسط يساوي الفرق. ما وجدته لوريا وديبروك مع مقايسة التذبذب هو ان عدد المسوخ تذبذب بشكل كبير وان الفرق في عدد المسوخ بين مختلف السكان كان أكبر بكثير من المتوسط. وبذلك أثبتت لوريا وديبروك ان الطفرات عفويه. واظهروا ان الطفرات تظهر تلقائيا كلما يتكرر الحمض النووي ، ويعتمد عدد المسوخ علي وقت حدوث الطفرة اثناء نمو السكان. انظر الشكل 1جيم، حيث ان سته من السكان ، كل منهم بدا بخليه جرثوميه (باللون الأزرق) ، لا يختبرون أيا منها ، أو 1 ، أو 2 طفرة واحده. السكان A1 ، E1 ، و F1 شهدت طفرة واحده (الخلية الحمراء الاولي) ، ولكن لان طفرة واحده تظهر تلقائيا في نقاط زمنيه مختلفه خلال دوره الثقافة ، انتهي السكان مع عدد مختلف جدا من المسوخ لوحظ (أربعه ، اثنين ، واحد ، علي التوالي). من ناحية أخرى ، السكان C1 و G1 انتهي بهم الأمر مع نفس العدد من المسوخ المرصودة ك E1 و A1 ، علي الرغم من انها شهدت اثنين من الاحداث المتحولة بدلا من واحد. ان تذبذب المسوخ الملاحظ بين السكان لم يعط الاسم فحسب ، بل اظهر أيضا ان تردد المتحول (اي نسبه الخلايا المتحولة) هو مؤشر غير كاف لمعدل الطفرة.

والهدف العام لمقايسة التذبذب هو تقدير معدل الطفرة العفوية لنمط جيني معين من البكتيريا أو الكائنات الحية الوحيدة التي تنمو في بيئة سائله معينه. ولا يزال فحص التذبذب هو الاداه الأنسب لدراسة الاعتماد البيئي علي معدلات الطفرة الميكروبية ويسمح بتقدير معدل الطفرة السريع وغير المكلف. النهج البديلة لتقدير معدل الطفرة ، مثل التسلسل الأقصى العمق⁶، والتسلسل السكاني⁷، وتجارب تراكم الطفرات⁸، أو مقارنه متواليات الجينوم لذريه لأبناء الوالدين⁹ هي أكثر شاقه بكثير ، التالي غير مناسبه للكشف عن التبعيات البيئية المحتملة. ومع ذلك ، فان الجوانب الدينامية لتوليد الطفرة وإصلاحها لا يمكن الوصول اليها إلى حد كبير لاختبار التذبذب أو لأي من طرق تحديد معدل الطفرة المذكور أعلاه. لدراسة كيفيه تغير عدد الطفرات في الوقت والفضاء ، أو بين الخلايا الفردية داخل السكان ، والنهج خليه واحده¹¹^،¹² ضرورية ، والتي ، بالاضافه إلى كونها أكثر مشقة من اختبارات التذبذب ، تتطلب مهارات عاليه التخصص والمعدات.

في الممارسة العملية ، والمقايسة التذبذب هو عد الخلايا تكتسب علامة النمط الظاهري بسبب طفرة التي تحدث في بيئة تفتقر إلى اختيار لتلك العلامة. ويبين التحليل التلوي لمئات من المقايسات المنشورة¹⁰ انه قد تم استخدام ما لا يقل عن 39 علامة ظاهريه مختلفه منذ بداية الفحص في 1943. ويمكن استخدام مقايسة التذبذب لمقارنه المتوسطات والتبعية البيئية لمعدلات الطفرة بين المختبرات ، والسريرية ، والسلالات غير المتحولة ، والمتحولة التي تنمو في بيئات متساهلة. ويسمح الفحص بتقدير معدل الطفرة في الخلايا ذات الخلفيات الوراثية المختلفة التي تنمو في بيئات ضئيله أو غنيه. والفحص مناسب ليس فقط للسكان الذين ينموون كمحصول واحد ولكن يمكن أيضا استخدامه لدراسة اثار تفاعلات الخلايا الخلوية علي معدلات الطفرة¹¹. عندما يتم خياطه سلاله الفائدة مع سلاله ثانيه ، ويتم استخدام علامة محايده لتمييز السلالات ، يمكن ان تكون معدلات الطفرة لسلالين في نفس الأنبوب في نفس الوقت.

وقد كشفت اختبارات التذبذب ان معدل الطفرة العفوية يعتمد علي كل من النمط الجيني للخلية وبيئتها¹² وهو سمه تتطور في حد ذاتها¹³. كلما تغير معدل الطفرة لنمط جيني معين واحد مع البيئة ، يوصف بأنه اللدونة معدل الطفرة¹¹. وقد عولجت معدلات الطفرة البلاستيكية بشكل شامل للطفرة المستحثة بالإجهاد (SIM)¹⁴. الاضافه إلى ذلك ، وباستخدام اختبارات التذبذب ، فقد تبين مؤخرا ان الكثافة التي ينمو فيها عدد الخلايا (عاده ما تكون ثقافة الدفعات في قدره الحمل) ترتبط ارتباطا وثيقا بمعدلات الطفرة عبر البكتيريا والنواة أحاديه الخلية. وينخفض معدل الطفرة لكل جينوم في الجيل الواحد من السكان الكثيفين بنسبه تصل إلى 23 ضعفا¹⁰^و¹¹. يمكن ان تعتمد مرونة معدل الطفرة المرتبط بالكثافة (الرطوبة) علي نظام استشعار النصاب¹⁵ والتصرف بشكل مستقل عن SIM¹⁶.

هنا ، يتم تقديم بروتوكول مفصل لمقايسة التذبذب المستخدمة لدراسة البكتيريا القولونية السلالة K-12 التي تكتسب مقاومه للمضادات الحيوية ريفاميسين في بيئة إعلاميه الحد الأدنى من الجلوكوز. ومع ذلك ، ينبغي ان ينظر إلى هذا البروتوكول باعتباره نموذجا أساسيا يمكن استخدامه لدراسة مجموعه واسعه من الميكروبات ببساطه عن طريق تعديل الظروف الثقافية وعلامات النمط الظاهري للتحول. وقد تطور البروتوكول منذ بدايته⁵^،¹⁷^،¹⁸^،¹⁹^،²⁰^،²¹^،²²^،²³^،²⁴^،²⁵^،²⁶^،²⁷^،²⁸^،²⁹ من خلال استخدامه علي مجموعه واسعه من الميكروبات وحتى الخلايا السرطانية³⁰ وتم تعديلها لزيادة الانتاجيه ، والتي كانت ضرورية لاختبار بشكل صحيح التبعيات البيئية لمعدلات الطفرة الميكروبية¹⁰^،¹¹^،¹⁶. البروتوكول الموصوف هنا لا يغطي جميع القضايا المنهجية والتحليلية لمقايسة التذبذب التي تم مناقشتها بشكل جيد بالفعل في الأدبيات ، وخاصه اثار اللياقة البدنية من الطفرات المقاومة³¹، النمط الظاهري تاخير³²، وفاه الخلية³³، وملاءمة خوارزميات مختلفه المتاحة لتقدير معدلات الطفرة²⁶^،³⁴. وهذا يمكن ان يكون مهما ، علي سبيل المثال ، عندما الاعتماد البيئي للآثار اللياقة البدنية يمكن ان يؤدي إلى اختلاف خاطئ في تقديرات معدل الطفرة³⁵. ومع ذلك ، نلاحظ ان الاداات التحليلية التي نستخدمها هنا يمكن ان تتعامل مع الاختلاف في اللياقة البدنية متحولة وموت الخلايا. وكما هو وارد في الملاحظات والمناقشة ، يوصي أيضا بالنظر في عده علامات النمط الظاهري التي من غير المرجح ان يكون لها نفس تاثيرات اللياقة البدنية المعتمدة علي البيئة. سيمكن هذا البروتوكول الناس من فحص التبعيات البيئية لمعدلات الطفرة بشكل روتيني في تنوع السلالات والبيئات الميكروبية. لم يتم بعد اختبار الطفرات في بيئات مختلفه بدقه وبعد النظر في الكثافة السكانية ، يمكن ان تعطي اختبارات التذبذب تقديرا أدق لمعدل الطفرة¹⁰. سيتيح هذا البروتوكول اجراء المزيد من اختبارات التذبذب ، كما هو ضروري لفهم أليات التي تقوم عليها معدلات الطفرة ، والتي هي بدورها حيوية لفهم التطور ، والسرطان ، والشيخوخة ، ومقاومه مضادات الميكروبات.

Protocol

1. اليوم الأول: تلقيح وتاقلم الثقافات تطعيم 3 مل من مرق lysogeny السائل (LB, انظر الجدول التكميلي 1) مع كشط من الجليد من e. القولونية MG1655 الجلسرين الأسهم (18 ٪ الجلسرين ،-80 درجه مئوية). هز ثقافة LB في 120 لفه في الدقيقة ل ~ 7 ح في 37 درجه مئوية.ملاحظه: في هذه التجربة ، يتم استخدام e. كولاي K12 MG1655 المتنامية في LB ، ولكن يمكن اجراء هذا الفحص مع اي سلاله كولاي أو اي أنواع أخرى من الجراثيم القابلة للثقافات. قد تكون درجه حرارة الحضانة ، وأوقات الحضانة ، ومستوي المغذيات لوسائل الاعلام النمو عرضه للتغير من قبل الأنواع أو سلاله. تمييع الثقافة 2,000 اضعاف باستخدام محلول ملحي. أضافه 100 μL من المحلول المخفف إلى 3 50 mL المسمار سقف المخروطية أنابيب البوليمر أسفل (50 mL أنابيب) مع 10 مل من السائل ديفيس الحد الأدنى المتوسطة (DM, انظر الجدول التكميلي 1), تحتوي علي التوالي 80 Mg/l, 125 Mg/l, أو 250 Mg/l من الجلوكوز. وهذه هي نفس الوسيلة (اي البيئة) التي سيتم فيها تقدير معدل الطفرة. يهز الثقافات في 120 دوره في الدقيقة بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية.ملاحظه: ويخضع اختيار وسائل الاعلام للتغير حسب الأنواع أو السلالات أو الاسئله البحثية. 2. اليوم الثاني: توليد المسوخ في الثقافات الموازية أولا ، اعداد البيئات التي سيتم استزراع البكتيريا. دائما اعداد 10 ٪ أكثر من المطلوب (اي ، 20 1 الثقافات مل تتطلب 22 مل). اعداد 22 مل من 1) DM مع 80 ملغ/لتر من الجلوكوز ، 2) DM مع 125 مغ/لتر من الجلوكوز ، 3) DM مع 250 ملغ/لتر من الجلوكوز ، 4) DM مع 80 mg/L من الجلوكوز ، و 5) DM مع 250 mg/L من الجلوكوز في أنابيب 5 50 mL. قم بتسميتها علي انها GLC-80A ، GLC-125 ، GLC-250A ، GLC-80A ، و GLC-250A ، علي التوالي. اعداد التطعيم للبيئات. تاكد من ان العجان لمده 1 مل من البيئة يحتوي علي 1000 − 5000 خليه. القيام بذلك عن طريق اتباع الخطوات التالية. قياس الكثافة البصرية (OD) من الثقافات بين عشيه وضحيها (من الخطوة 1.2) في 600 nm. تمييع كل ثقافة بين عشيه وضحيها من أجل الوصول إلى الكثافة النهائية من 1000-5000 خليه لكل مل من DM مع الجلوكوز. في ايدينا ، إذا كان OD تقاس في 2.2.1 هو 0.3 ، وهذا يعني جعل تخفيف 100 اضعاف (في محلول ملحي) من الثقافة بين عشيه وضحيها ، ثم أضافه 11μl من هذا الحل إلى بيئة 22 مل. اعداد الثقافات الموازية.ملاحظه: يتم كتابه هذا البروتوكول ل 1 96 لوحه البئر العميقة ، وأداء خمسه اختبارات التذبذب (الحد الأقصى لعدد معقول علي 1 96 لوحه جيدا) ، وذلك باستخدام ثلاث بيئات. مع الخبرة ، قد يتم تشغيل عده لوحات عميقة البئر في نفس الوقت. إنشاء تخطيط عشوائي من الثقافات الموازية ل 1 96 لوحه البئر العميق. يمكن استخدام البرنامج النصي r الاضافيه لايوتجينيراتور (راجع التخطيط في الشكل 1B) لهذا. وضع كل ثقافة موازيه علي لوحه البئر العميق 96 وفقا للتخطيط.ملاحظه: سيضمن تشغيل لايوتجينيراتور ان الفحص الأول يحتوي علي 20 ثقافة موازيه ، وان الاختبارات الثانية والثالثة والرابعة والخامسة لها 19 ثقافة موازيه لكل منها. نقل 1 مل من وسائل الاعلام الملقحة في كل بئر من لوحه البئر العميق 96 وفقا للتخطيط العشوائي. إصلاح غطاء لوحه البئر العميقة مع الشريط. لا تصلح الغطاء باحكام ، لان نمو الثقافة حساس لكميه التهوية. تزن اللوحة بأكملها مع الغطاء والشريط ويهز لوحه في 250 دوره في الدقيقة لمده 24 ساعة في 37 درجه مئوية. ضع 2 لتر من الماء المقطر في الحاضنة لتثبيت كميه التبخر بين المجموعات التجريبية. تحديد حجم المسحة عن طريق الطلاء 10 μL من كل من وسائل الاعلام الملقحة علي لوحه أجار (TA) غير انتقائية (انظر الجدول التكميلي 1). استخدم مفرشا معقما علي شكل حرف L حتى يجف سطح الاجار. احتضان لوحات أجار TA أسفل بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية.ملاحظه: تا أجار هو أجار الغنية التي تحتوي علي السكر L-arabinose وصبغ للذوبان في الماء 2 ، 3 ، 5-كلوريد ثلاثي فينيلبيراسيتام ، وهو عديم اللون في شكله المؤكسد. عندما تقلل البكتيريا من الصبغة ، تتحول إلى اللون الأحمر بسبب تشكيل الشكل الشكلي. مستعمرات علي أجار TA التي لا يمكن الاستفادة من L-arabinose هي حمراء داكنه. سلالات أخرى ، مثل MG1655 ، والوردي. ينصح باستخدام أجار TA بدلا من أجار LB القياسية لان المستعمرات البكتيرية الملونة هي أسهل لبقعه ، مما يجعل العد مستعمره أكثر موثوقيه وأسرع. اعداد أجار TA انتقائية تحتوي علي ريفاميسين في 6 لوحات جيدا. ماصه 5 مل من أجار TA انتقائية في كل بئر من لوحات 6 جيدا. اعداد ريفاميسين المضادات الحيوية فقط قبل اضافته إلى أجار TA.ملاحظه: عندما يستخدم السيكلوسبورين كعلامة ، استخدم الحد الأدنى ديفيس المتوسطة مع 250 ملغ/لتر من الجلوكوز تستكمل مع أجار و L-arabinose و 2 ، 3 ، 5-كلوريد تريفينيلتيتراازول كاجار انتقائي. اي ، أجار TA لا يحدد فقط الخلايا التي تقاوم السيكلوسبورين ، لان التريتون واستخراج الخميرة (كل من المكونات الاساسيه من أجار TA) تحتوي علي الأحماض الامينيه د-الأنين. هذه الأحماض الامينيه تعارض تاثير مضادات الميكروبات من السيكلوسبورين ويسمح لجميع الخلايا لجعل مستعمره. ترك لوحات انتقائية والمتبقية غير انتقائية في الظلام (علي سبيل المثال ، في مربع) في درجه حرارة الغرفة. 3. اليوم 3: الثقافات الطلاء علي لوحات أجار انتقائية وغير انتقائية عد وحدات تشكيل مستعمره (كفو) علي لوحات أجار غير انتقائية وتحديد حجم التطعيم عن طريق ضرب CFU ب100. هذا هو نسبه بين حجم الثقافة الموازية (1 مل = 1,000 μL) وحجم مطلي (10 μL).ملاحظه: إذا تم تخزين لوحات غير انتقائية المبردة يمكن حساب CFU في وقت لاحق. بعد 24 ساعة من الحضانة ، تزن كامل صفيحه البئر العميقة لتحديد كميه التبخر. وهذا من المرجح ان يكون حوالي 10 ٪. احسب متوسط حجم الثقافة الموازية بعد 24 ساعة من الاحتضان (v[24h]) في microliters باستخدام وحده التخزين الابتدائية V[0h] = 1,000 ميكرولتر ووزن اللوحة المحول إلى ميكروليتر ، حيث يتم قياس كثافة متوسط النمو في mg/ميكرولتر. تستخدم هذه الدراسة كثافة 1 مغ/μl: نقل الثقافات الثلاثة المختارة عشوائيا لكل مقايسة (15 في المجموع ، وأبرز مع دائره سوداء في التخطيط في الشكل 1ب) في أنابيب الطرد المركزي المسمي. ترك لهم علي مقاعد البدلاء لاستخدامها في وقت لاحق (انظر الخطوة 3.6) لتحديد حجم السكان النهائي (أو Nt). لوحه الثقافات الموازية 81 المتبقية من لوحه بئر عميقة علي أجار TA انتقائية تحتوي علي ريفاميسين. ماصه واحده ثقافة متوازية كامله من ال 96 عميقة بئر لوحه داخل واحده بئر من 6-بئر لوحه. تاكد من ان اي 6 لوحه جيده تحتوي علي ثقافات موازيه من أكثر من اختبار تذبذب واحد. أزاله الاغطيه من لوحات أجار انتقائية ، وترك كشف في ظروف معقمه. تجفيف كل السائل علي سطح أجار TA انتقائية.ملاحظه: أجار يجري الجافة تماما أمر بالغ الاهميه. ومع ذلك ، لا overdry أجار TA انتقائية ، لأنه يجب ان لا يسمح للقضاء. بينما الانتقائية [تا] أجار لوحات ينشفون, اي يستطيع أخذت [أوب-ون] عده ساعات, حددت ن [ت] من ال 15 ثقافات يعد في خطوه 3.4 يستعمل مستعمره يشكل وحدات ([كفو]). تحديد كفو عن طريق تمييع الثقافات من أنابيب الطرد المركزي الصغير. استخدام 5 10 اضعاف الخطوات التخفيف ، وخلط و vortexing 900 μL من محلول ملحي مع 100 μL من الثقافة علي كل خطوه. لوحه 40 μL من التخفيف الماضي (مع عامل التخفيف من 105) علي أجار TA غير انتقائية والحضن لوحات غطاء أسفل بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية.ملاحظه: ويمكن اجراء سلسله التخفيف في 96 لوحات جيدا مع ماصه متعددة القناات ، والتي يمكن ان تزيد من سرعه هذه الخطوة. مره واحده كل الآبار علي 6 لوحه جيده خاليه من السائل الثقافة ، ووضع الغطاء مره أخرى علي ووضع لوحه 6 جيدا مع الغطاء أسفل علي مقاعد البدلاء حتى جميع لوحات جيده 6 جافه. مره واحده كل الجافة ، احتضان لوحات غطاء أسفل في 37 درجه مئوية ل 44-48 h.ملاحظه: لعلامات أخرى (حمض الناليديكسيك ، السيكلوسبورين ، هيجرومايسين ب ، أو 5-FOA) احتضان لوحات لساعات 68-72. تاكد من ان الرطوبة في الحاضنة عاليه. ومن الاهميه بمكان ان لوحات أجار انتقائية لا تجف خلال فتره الحضانة. 4-اليوم الرابع: تحديد عدد الخلايا في الثقافات عد كفو علي لوحات أجار غير انتقائية. تقدير عدد الخلايا القابلة للاستمرار في الثقافة عن طريق ضرب CFU مع عامل التخفيف (105) والنسبة بين المتوسط المحسوب للحجم الخامس[24h] في microliters (انظر الخطوة 3.3) وحجم المطلي (40 μl): Nt من نمط جيني معين ينمو في بيئة معينه هو متوسط هذه القيم من الثقافات الثلاث. 5-اليوم الخامس: تقدير معدل الطفرة عد عدد المستعمرات المقاومة للمضادات الحيوية علي لوحات أجار TA الانتقائية (اي اعداد الخلايا المقاومة التي نشات من خلال الطفرة العفوية في صفيحه البئر العميقة في الأيام من 2 − 3). تسجيل التوزيع بين الثقافات الموازية للعدد المرصود من المسوخ لمقايسة معينه (علي سبيل المثال ، 16 أو 17 القيم ، بما في ذلك صفر التهم).ملاحظه: إذا تم تخزين لوحات انتقائية مبرده ، يمكن حساب مستعمرات مقاومه للمضادات الحيوية في وقت لاحق. استخدام كل توزيع لتقدير عدد الاحداث الانتقالية ، m، باستخدام R-حزمه فطيره36.ملاحظه: وهناك أيضا R-حزمه rSalvador مع وظائف مماثله29. حفظ توزيع المسوخ المرصودة لفحص واحد في ملف نصي كعمود واحد. استخدم برنامج Shinyflan (http://shinyflan.its.manchester.ac.uk/) لتقدير m كما هو مفصل أدناه. في علامة التبويب فرضيه اختبار ترك القيم كافتراض 100ات (اي ، اللياقة البدنية غير معروف ، وتقدير الأسلوب = الحد الأقصى لاحتمال (ML) ، وتوزيع المتحولة العمر = الاسي (نموذج LD) ، ومعلمه Winsor = 1,024 ، وعدد الطفرة واللياقة البدنية = 1 ، مستوي الثقة = 0.95 انقر فوق استعراض وحدد الملف النصي مع توزيع المسوخ المرصودة. حاول أولا مع ملف “البيانات التكميلية”. بعد تحميل الملف ، انقر علي تنفيذ الاختبار. علي الجانب الأيمن تحت نتيجة الاختبار، تحت عينه واحده ML-اختبار (LD نموذج) ، والعثور علي رقم الطفرة. هذا m، العدد المتوقع من الاحداث الانتقالية. تحت الفاصل الزمني للثقة 95 في المئة لرقم الطفرة العثور علي الجزء العلوي والسفلي من m. مره واحده m و Nt (التي تحددها CFU) متوفرة ، تقدير معدل الطفرة من النمط الجيني معين في بيئة معينه كما. تقسيم الحدود العليا والسفلي علي m بواسطة Nt بنفس الطريقة لتوليد فترات الثقة علي معدل الطفرة (NB هذا لا يمثل عدم اليقين في Nt).ملاحظه: يتم عرض النتائج علي انها معدل الطفرة لكل من التوليد. يتم توليد معدل الطفرة لكل زوج أساس عن طريق تقسيم معدل الطفرة في الموضع rpob من قبل 79 ، وهو معرفتنا الحالية لكيفيه العديد من الطفرات نقطه داخل الجينات rpob تمنح مقاومه ريفاميسين37. ضرب معدل الطفرة لكل النيوكليوتيد بحجم الكروموسوم (e. كولاي K-12 MG1655 = 4,639,675 bp) ، يعطي معدل الطفرة لكل جينوم. كرر الخطوات 5.1 − 5.3 مع اختبارات التذبذب الاربعه المتبقية.

Representative Results

وقد تم جمع النتائج مع البروتوكول الذي تم الإبلاغ عنه في أربعه أسابيع مختلفه من قبل ثلاثه باحثين مختلفين ، حيث تم استخدام لوحه البئر العميقة 96 في كل أسبوع لتوليد خمسه تقديرات لمعدل الطفرة. بالإجمال 3 96 لوحات بئر عميقة ولدت 15 معدل الطفرة التقديرات (± 95 ٪ فاصل الثقة ، CI) في e. القولونية ك-12 MG1655 (الشكل 2ا، كما هو مستخدم في البروتوكول) ، في حين استخدمت 1 96 لوحه بئر عميق لخمسه تقديرات(±95 ٪CI) من e. القولونية BW25113 Δالمغفل في الشكل 2 الدقة المتوسطة مع نطاق الربع الشهري من تقدير m هو 17.5 ٪ (1.00 ٪ − 28.9 ٪ ، ن = 20). الدقة هي معامل اختلاف العدد المتوقع للاحداث المتغيرة (m) المحسوبة علي انها σm / m x 100% (حيث يتم حساب σ كما هو موضح سابقا38). تتوفر البيانات الاوليه لشكل 2 في ملف البيانات التكميلية “Krasovec_etal_JoVE_data. csv”. ملف البيانات التكميلية مصحوب ببرنامج نصي R لإنشاء الشكل 2. انظر أيضا الجدول التكميلي 2 للحصول علي مزيد من التفاصيل حول السلالات البكتيرية ، والجدول التكميلي 3، حيث يتم شرح الاعمده في ملف البيانات. وكانت نقاط البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام حمض ريفاميسين وحامض الناليديكسيك قد نشرت سابقا في Krašovec et al.10 ولها نفس المعرفات هنا كما هو الحال عندما نشرت لأول مره. في الشكل 2A يتم عرض معدلات الطفرة MG1655 من ثلاث علامات النمط الظاهري المختلفة ، السيكلوسبورين ، ريفاميسين ، وحمض الناليديكسيك. هنا ، تم تقييم معدلات الطفرة في ديفيس الحد الأدنى المتوسطة مع 80 ، 125 ، و 250 ملغ/لتر من الجلوكوز ، كما هو موضح في البروتوكول. في حاله واحده 1,000 ملغم/لتر من الجلوكوز وقد استخدم (الشكل 1ب). في الممارسة العملية ، يمكن استخدام اي تركيز الجلوكوز الاوليه. كما هو متوقع ، كانت معدلات الطفرة اعلي للمقاومة السيكلوسبورين ، ادني لمقاومه حمض الناليديكسيك ، وكان معدل مقاومه ريفاميسين في الوسط. وهذا وفقا لاحجام الهدف المعروفة لهذه المقاومة الثلاثة ، حيث الأكبر هو السيكلوسبورين وأصغر لحمض الناليديكسيك. وتقدم المناقشة والشكل 3 تفاصيل عن كيفيه استغلال الاحجام المستهدفة ، وكميات الثقافات الموازية ، ومستوي المغذيات في البيئة لتحسين قياس معدلات الطفرة الميكروبية مع مقايسة التذبذب. ويبين فحص التذبذب بوضوح اي سلاله هي المتحول التاسيسي والتي لها معدلات طفرة طبيعيه. سلاله Δالمغفل كان لها ما يقرب من 50x ارتفاع معدل الطفرة إلى مقاومه حمض الناليديكسيك (الشكل 2ب) كما MG1655 (الشكل 2ا). ومع ذلك ، لتحديد معدل الطفرة لنمط جيني معين في بيئات مختلفه ، يوصي بالقيام بخمس نسخ متماثلة علي الأقل لكل نمط جيني لكل بيئة باستخدام علامة واحده فقط للنمط الظاهري. وللاطلاع علي موجز تفصيلي للأساليب الاحصائيه المستخدمة سابقا لتحليل هذا النوع من التجارب ، انظر المعلومات التكميلية في Krašovec وآخرون10. الشكل 2: الرقم التمثيلي لمعدلات الطفرة المقدرة بالمقايسة المتقلبة في السكان القولونيين . (ا) معدل الطفرة الذي يحدده البروتوكول المبلغ عنه في النوع البري MG1655 (الدوائر). ويبين الشكل معدلات الطفرة في وجود ريفاميسين (الدوائر الزرقاء الخفيفة) ، وحمض الناليديكسيك (الدوائر الحمراء) ، و السيكلوسبورين (الهالات الزرقاء الداكنة) المقاومة. لحمض الناليديكسيك ، استخدمت كميات أكبر من الثقافة 10 مل (انظر ملف البيانات التكميلية). ويعاد غرس البيانات الخاصة بحمض ريفاميسين وحامض الناليديكسيك من الشكل 2الف في krašovec وآخرون10. (ب) معدل الطفرة إلى مقاومه حمض الناليديكسيك في كيو39 Δالمغفل متحولة (مثلثات حمراء). لاحظ المقياس اللوغاريتمي علي محور معدل الطفرة. أشرطه الخطا = 95% الفواصل الزمنيه للثقة محسوبة كما هو موضح في البروتوكول. ويعاد غرس البيانات من الشكل 4الف في krašovec وآخرون10. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم. الشكل 3: مخطط انسيابي لاستكشاف أخطاء فحص التذبذب وإصلاحها. المخطط الانسيابي هو ان يتبع من الأعلى ، ومعالجه الاسئله الثلاثة في الماس الأصفر بدوره ، وتعديل البروتوكول وفقا لمحتويات المربعات الخضراء الناتجة ، وتنفيذ البروتوكول كما هو مبين في البيضاوي الحمراء. راجع الفقرات الثلاث الاولي من المناقشة للحصول علي مزيد من التفاصيل حول كيفيه استكشاف الأخطاء وإصلاحها. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم. الجدول التكميلي 1: صيغ لوسائط الاعلام المستخدمة في البروتوكول. الرجاء انقر هنا لعرض هذا الجدول (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل). الجدول 2 التكميلي: السلالات البكتيرية. الرجاء انقر هنا لعرض هذا الجدول (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل). الجدول التكميلي 3: وصف مفصل للاعمده في ملف البيانات الاوليه Krasovec_etal_JoVE_data .csv. الرجاء انقر هنا لعرض هذا الجدول (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل). ملفات البيانات التكميلية. يرجى النقر هنا لتحميل هذه الملفات.

Discussion

اي تقدير لمعدل الطفرة يحتاج إلى تعظيم الدقة التي تحققت من أجل ضمان التكرار والاستنساخ داخل وبين الدراسات³⁴. النسبة لمقايسة التذبذب ، هناك ثلاثه اعتبارات حاسمه. تم تعيين أول اثنين في البروتوكول المعطي ولكن سوف تحتاج إلى استكشاف الأخطاء وإصلاحها (انظر الشكل 3) إذا تم تكييف البروتوكول للعمل مع سلالات أو بيئات مختلفه. أولا ، اختيار العلامة الظاهرية المناسبة. بالنسبة للبكتيريا ، فمن المستحسن ان تقدير معدلات في واحده من اثنين من العلامات المكانية ، Rpob أو gyra، ومنح المقاومة للمضادات الحيوية ريفاميسين وحمض الناليديكسيك ، علي التوالي. حجم الهدف من الطفرات لمقاومه المضادات الحيوية في هذين المكانين مختلف. هناك 79 و 20 الطفرات فريدة من نوعها لمنح مقاومه ريفاميسين³⁷ وحمض الناليديكسيك⁴⁰ علي التوالي. في الممارسة العملية ، وهذا يعني انه في المتوسط ، يتم ملاحظه المسوخ المقاومة ريفاميسين أكثر تواترا. لذا ، فان السؤال الأول (Q1 في الشكل 3) الذي يحتاج إلى الاجابه هو ما إذا كانت السلالة هي المواتور ام لا. عندما يتم دراسة المتحولين التاسيسيه ، حيث العديد من المستعمرات التي لوحظ انها من المتوقع ، فمن الأفضل استخدام علامة مع أصغر حجم الهدف (علي سبيل المثال ، حمض الناليديكسيك). انظر الشكل 2ب، حيث تم تقدير معدلات الطفرة في المتحول التاسيسي e. كولاي K-12 BW25113 Δالمغفل باستخدام حمض الناليديكسيك كعلامة. عند العمل مع السلالات البكتيرية غير المتحولة التي لها نوع الطفرة البرية (اي ، العادية) ، ريفاميسين هو خيار أفضل (انظر الشكل 2ا). إذا كان لسبب ما هناك حاجه إلى المسوخ أكثر لوحظ ، علامة ذات الصلة هي مقاومه السيكلوسبورين. لهذه العلامة ، يمكن ان تظهر طفرات المقاومة في أكثر من عشره جينات⁴¹، مما يعني ان الحجم المستهدف أكبر منه بالنسبة ريفاميسين. عند دراسة الخميرة والارشييه فمن المستحسن لتقدير معدلات الطفرة في 25S ريبوسومال البروتينات و URA3 ، ومنح المقاومة ل hygromycin ب و 5-فلورو-اورتيك حمض (5-FOA) ، علي التوالي.

والاعتبار الحاسم الثاني هو حجم الثقافات الموازية. الذي حجم لاستخدام يعتمد علي العدد الفعلي من المسوخ لوحظ. يتاثر العدد المتوقع من المسوخ المرصودة بالحجم المستهدف لعلامة النمط الظاهري المختارة ، وقدره السلالة علي إصلاح وتجنب الطفرات (متوسط معدل الطفرة) ، والقدرة الاستيعابية للبيئة ، والتي تتاثر بكل من الوسائط المستخدمة وحجم الثقافة. إذا لم يكن هناك ثقافات موازيه تحتوي علي مستعمرات متحولة مقاومه لل ريفاميسين ، فينبغي استخدام السيكلوسبورين أو زيادة عدد الخلايا المطلية. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق أضافه المزيد من الجلوكوز إلى الحد الأدنى المتوسط أو عن طريق زراعه الخلايا في بيئة اغني (أو كامله). ومع ذلك ، في كثير من الحالات ، ترتبط هذه الزيادة في الكثافة السكانية بانخفاض معدل الطفرة ، مما يؤدي إلى زيادة محدوده ، ان وجدت ، في عدد مستعمرات المتحولين التي لوحظت في¹⁰. إذا كانت زيادة المواد الغذائية ليست حلا ، ثم زيادة عدد الخلايا عن طريق زيادة حجم كل ثقافة موازيه هو خيار. عندما تشمل البيئة الحد الأدنى من الأملاح مع السكر كمصدر وحيد للكربون والطاقة (اي ، الجواب علي Q2 في الشكل 3 هو “متوسط الحد الأدنى”) ، ثم يجب استخدام وحدات التخزين بين 0.5 و 1.5 mL. إذا كانت البيئة غنيه ، فان كميات الثقافات الموازية يجب ان تكون بين 0.35 − 1 مل. ويتعلق السؤال الأخير بمتوسط عدد المستعمرات المقاومة. إذا لوحظت عدد قليل جدا من المستعمرات متحولة (اي ، الاجابه علي Q3 في الشكل 3 هو 0) والبيئة ليست ليتم تعديلها ، ثم يجب زيادة حجم الثقافات الموازية أو المضادات الحيوية مع حجم الهدف أكبر (علي سبيل المثال ، السيكلوسبورين) ينبغي ان تستخدم. من ناحية أخرى ، إذا لوحظ الكثير من المستعمرات متحولة علي جميع لوحات انتقائية (أكثر من ~ 150 لكل لوحه ، انظر الشكل 3) ، ثم يجب ان ينخفض عدد الخلايا مطلي ، والتي عاده ما يعني استخدام حجم اقل أو التحول إلى مضاد حيوي مع أصغر حجم الهدف (علي سبيل المثال ، حمض الناليديكسيك).

مره واحده يتم اختيار وحده التخزين ، فمن الأفضل ان جميع الثقافات الموازية علي 1 96 لوحه البئر العميق لها نفس الحجم. وهذا يسمح بتحديد أدق للحجم الفعلي للثقافات الموازية من وزن الصفيحة. عندما تقارن معدلات الطفرة لنمط جيني معين بين بيئات مختلفه ، فمن الأفضل مره أخرى استخدام نفس حجم الثقافات الموازية في جميع البيئات. إذا تم استخدام حمض الناليديكسيك لتقدير نوع البرية (اي ، العادي) معدلات الطفرة أو يتم استخدام بعض علامة النمط الظاهري الأخرى التي لديها أصغر حجم الهدف من حمض الناليديكسيك ، يجب زيادة حجم أكثر من ذلك. خيار واحد هو جعل الثقافات الموازية في أنابيب 50 mL مع احجام تصل إلى 15 مل. علي سبيل المثال, 10 تم اعداد الثقافات الموازية مل في أنابيب 50 mL عند تقدير معدل الطفرة e. القولونية MG1655 إلى حمض الناليديكسيك (انظر الشكل 2ا). المتوازي 10 [مل] ثقافات كان بعد ذلك مطليه علي الانتقائية [تا] أجار ويصب داخل كبيره 150 [م] لوحات [اينستد وف] معياريه 90 mm [بتري] اطباق. الجانب السلبي لاعداد الثقافات الموازية في أنابيب 50 mL هو ان الانتاجيه اقل بكثير مقارنه مع معدلات الطفرة التي تمت في 96 البئر العميق. ويتمثل أحد الحلول في تقليل عدد الثقافات الموازية. ومع ذلك ، سيؤثر ذلك علي دقه تقدير m، الذي يعتمد علي العدد المتوقع من الاحداث الانتقالية وعدد الثقافات الموازية²⁶. الحصول علي توزيع المسوخ لوحظ مع 14 − 17 الثقافات الموازية (كما حدث في الشكل 2) ، هو توازن جيد بين الانتاجيه الصلبة ومستوي الدقة المقبولة²⁶ من 20 ٪. ويماثل مستوي الدقة المتوسطة ال17.5 في المائة نسبه الدقة الوسطية بالنسبة للنطاق الربع الذي يبلغ 16.4 في المائة (5.7 في المائة-38.9 في المائة ،^العدد= 580) محسوبا من مجموعه بيانات أكبر بكثير 10. التالي ، فمن المستحسن انه عند اعداد الثقافات الموازية في 96 لوحات البئر العميقة أو أنابيب 50 mL يتم الحصول علي توزيع المسوخ لوحظ مع ما لا يقل عن 14 الثقافات الموازية. عندما يتم تقدير معدلات الطفرة في بيئات مختلفه فمن المستحسن لاختبار مستويات الدقة عن طريق القيام تجربه متعددة اللوحات ، حيث تزرع جميع الثقافات الموازية 96 علي لوحه واحده في نفس البيئة. الاضافه إلى ذلك ، عند اعداد الثقافات الموازية ، من الاهميه بمكان ان التطعيم يحتوي علي عدد قليل من الخلايا ، لأنه يقلل من فرص وجود اي خلايا مقاومه موجودة في الداخل. المسوخ المقاومة الموجودة مسبقا ليست مطلوبه في الداخل ، لأنها سوف تزيد في الأرقام وإنشاء حديقة علي لوحات انتقائية وتقدير معدل الطفرة لن يكون ممكنا. علي سبيل المثال ، في معظم السكان e. القولونية ، معدل الطفرة إلى مقاومه ريفاميسين هو في ترتيب ~ 10^-8. وهكذا ، لتجنب تلقيح الثقافة مع متحولة مقاومه موجودة مسبقا ، يجب تطعيم واحد مع اقل من 10⁸ خلايا (علي سبيل المثال ، 10³− 10⁴ خلايا). الخطوة الحاسمة النهائية هي لضمان ان يتم احتضان لوحات أجار انتقائية ، والسطح علي أجار انتقائي جاف تماما. لا يمكن استخدام spreaders إذا تم استخدام لوحات 6 جيدا والحجم الاولي للثقافة موازيه هو 1 مل ، علي سبيل المثال. يجب ترك لوحات كشف في ظروف معقمه للسماح للسطح السائل تجف. الوقت الذي يستغرقه هذا يمكن ان يكون متغيرا للغاية ، ويعتمد علي الظروف المحيطة وحاله لوحات. هذا الوقت يجب ان يكون الحد الأدنى ولكن يمكن ان تصل إلى عده ساعات.

ولمقايسة التذبذب قيود متاصله. انه مقايسة علامات النمط الظاهري للتحول فقط في مجموعه فرعيه صغيره من الجينوم. التالي يتطلب الفحص اعدادا كبيره من السكان الذين يمرون بعدد كاف من الأجيال لمراقبه طفرات كافيه لتقدير المعدل علي الإطلاق. وهذا يعني ان اختبارات التذبذب يمكن استخدامها فقط علي الكائنات الحية القادرة علي الذهاب من خلال عدد كبير من الأجيال بسرعة ، مثل البكتيريا ، الخميرة بيكر⁴²، أو خلايا الثدييات الثقافة السائلة³⁰. أيضا ، الطفرات هي الاحداث النادرة التي تحدث في الظروف البيوكيميائية محدده من خليه معينه. وحقيقة ان اختبارات التذبذب تبدو عبر اعداد كبيره من الخلايا مع مرور الوقت تعني ان هذه الظروف يمكن ان تختلف اختلافا كبيرا. باستخدام هذا الفحص ، فانه من الصعب بالتالي لدراسة تطور معدلات الطفرة لسكان معينه من مرحله التاخر إلى المرحلة الاسيه المبكرة والمتاخره وأخيرا إلى مرحله ثابته. وأي تفرقه في معدلات الطفرة بين الخلايا الواحدة داخل السكان مخفيه تماما عن المقايسة المتقلبة. يمكن دراسة ديناميات الطفرة خليه واحده مع تتبع جزيء واحد من الحمض النووي إصلاح البروتين MutS⁴³ أو عن طريق عد بؤر البروتينات mutl المتراكمة⁴⁴. كما ان التطورات الاخيره في التسلسل العالي الانتاجيه مكنت من تقدير معدلات الطفرة مباشره من النسل الام-الذري⁹^،⁴⁵ والجيل المتعدد الأجيال⁴⁶. وقد بدات هذه التطورات المنهجية في السماح بالعد المباشر للتحولات التي تحدث داخل جيل واحد. ومع ذلك ، فان هذا النهج المباشر يحتاج إلى تقنيات باهظه التكلفة وحديثه مثل المجهر الفلوري ، ميكروفلويديكس ، أو تسلسل الجينوم الكامل. ومن ناحية أخرى ، فان المقايسة المتقلبة غير مكلفه نسبيا ولا يلزم سوي معدات مختبريه قياسيه. سيؤدي القيام بمزيد من اختبارات التذبذب أيضا إلى تيسير توليد فرضيات جديده يمكن اختبارها باستخدام نهج أحاديه الخلية أكثر مباشره.

هناك اهتمام طويل الأمد في دراسة الطفرات ، التالي فان التذبذب المقايسة من المرجح ان تظل وسيله تستخدم علي نطاق واسع. وقد كان عدد الاستشهادات من الورقة المنوية من قبل لوريا وديبروك⁵ في السنوات الأربع الماضية (2015-2018) من بين الخمسة الأوائل لاستشهادات هذه الورقة. ومع ذلك ، نظرا لكميه كبيره من الاعمال اليدوية الدقيقة اللازمة لتنفيذ بشكل صحيح لفحص التذبذب ، فان معظم الدراسات فقط اجراء حفنه من المقايسات التذبذب. غير ان هذا لا يكفي للكشف عن التبعيات البيئية لمعدل الطفرة. ومن خلال تبسيط اختبارات التذبذب باستخدام لوحات متعددة الآبار ، كما هو موضح في هذه الورقة ، فان الانتاجيه القصوى الحالية الممكنة هي 11 صفيحه عميقة (55 التذبذبات) بالتوازي ، كما هو موصوف هنا. تشغيل مجموعتين من المقايسات تذبذب متداخلة بيوم واحد في موازاة ذلك ، يسمح تنفيذ ما يصل إلى 110 المقايسات في الأسبوع. تغيير خطوه أخرى في الانتاجيه قد يكون ممكنا حتى الآن عن طريق أتمته خطوات مختلفه من المقايسات تذبذب من البروتوكول اليدوي البحت المعطية. النسبة لدراسة التبعيات البيئية لمعدل الطفرة ، يجب ان تؤخذ الكثافة السكانية في الاعتبار. النتائج السابقة¹⁰ تظهر انه عندما يتم احتساب العوامل المعروفة التي تؤثر علي معدل الطفرة ، فان التحكم في الكثافة السكانية يمكن ان يقلل من التباين في تقديرات معدل الطفرة بأكثر من 90%. للتحكم في الكثافة ، نوصي بان يتم تحديد N_t (المستخدمة لتقدير معدل الطفرة) بشكل مستقل عن الطريقة المستخدمة لتحديد الكثافة السكانية. في البكتيريا ، يمكن تحديد N_t من قبل CFU والكثافة ، علي سبيل المثال ، مع فحص التلالؤ القائم علي ATP¹⁰.

الانتاجيه العالية والكثافة المسيطرة كلاهما ضروري عند دراسة كيفيه تاثير السياق البيئي للكائن الحي علي معدل الطفرة العفوية. معرفه وجود اللدونة معدل الطفرة أمر مهم ، ولكن فهم أسبابه وأثاره هي التحديات الرئيسية التي تحتاج إلى الوفاء بها إذا كان اللدونة معدل الطفرة لادراجها في سياق بيولوجي أوسع. ان المقايسة المتقلبة هي أداه عظيمه يمكن استخدامها لاختبار العديد من الفرضيات ، لان النتائج يتم الحصول عليها بسرعة ، والمقايسات غير مكلفه بالنسبة للأساليب الأخرى. وقد وضعت المرحلة ، علي سبيل المثال ، لدراسة التبعيات البيئية لمعدل الطفرة في المجتمعات البكتيرية والمناطق الاحيائيه المجهرية. ويمكن ان يؤدي تكييف مقايسة التذبذبات إلى اختبار الفرضيات التي تؤثر علي معدلات طفرة بعضها البعض عن طريق جزيئات صغيره. يمكن القيام بآلاف من اختبارات التذبذب مع cocultures تحديد ما إذا كانت السلالات تختلف في قدرتها علي تعديل معدلات الطفرة بعضها البعض وفي قابليتها لتعديل معدل الطفرة من قبل الآخرين. وربما يعزي التباين بين السلالات في القابلية للتلاعب بمعدل الطفرة إلى اختلاف جيني محدد. وقد يحول ذلك وجات نظرنا حول كيفيه عمل التطور في المجتمعات المعقدة ، وليس اقلها في أمثله ذات اهميه واسعه مثل كيفيه ظهور مقاومه مضادات الميكروبات.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

[رك] كان ساندت ب [ب]/M020975/1 وجامعه من مانشستر مدرسه العلوم البيولوجية. وأيد الموارد البشرية بواسطة BB/J014478/1. تم دعم GG من قبل BBSRC شراكه التدريب الدكتوراه BB/M011208/1. [درغ] كان ساندت ب [UKRI] مكافاه رقم [مستر/R024936/1].

Materials

1.5 ml Microcentrifuge tubes	Starlab International GmbH	S1615-5550
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	Sigma-Aldrich	T8877-10g
6-well plates	Greiner Bio-One	REF 657102
90mm Petri Dishes Triple Vented	ThermoFisher Scientific	REF 120189
96 deep-well plate (Masterblock 2 ml)	Greiner Bio-One	REF 780270
Ammonium sulfate	Fisher Chemical	A/6440/53
Bacto Agar	Becton, Dickinson and Company	REF 214010
Bacto yeast extract	Becton, Dickinson and Company	REF 212750
Cycloserine	Sigma-Aldrich	1158005-250MG	Only for assaying an alternative phenotypic marker
D-Glucose anhydrous	Fisher Chemical	G/0500/61
50 ml Centrifuge Tube	Corning	REF 430828
L-(+)-Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256-500g
Magnesium sulfate heptahydrate	Fisher Chemical	M/1050/53
Nalidixic acid	Sigma-Aldrich	N8878-5G	Only for assaying an alternative phenotypic marker
Potassium phosphate dibasic trihydrate	Sigma-Aldrich	P5504-500g
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662-500g
Rifampicin	EMD Millipore Corp, USA	557303-1GM
Sodium chloride	Fisher Chemical	S/3160/60
Spectophotometer	Jenway	6320D
Thiamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	T4625-25g
Trisodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	S1804-500g
Tryptone	Fisher Chemical	1278-7099

References

de Vries, H. Die mutationstheorie. Versuche und beobachtungen über die entstehung von arten im pflanzenreich. 1, (1901).
Muller, H. J. Artificial transmutation of the gene. Science. 66 (1699), (1927).
Muller, H. J. The measurement of gene mutation rate in Drosophila, its high variability, and its dependence upon temperature. Genetics. 13 (4), 279-357 (1928).
Sturtevant, A. H. Essays on evolution. I. On the effects of selection on mutation rate. The Quarterly Review of Biology. 12 (4), 464-467 (1937).
Luria, S. E., Delbrück, M. Mutations of bacteria from virus sensitivity to virus resistance. Genetics. 28 (6), 491-511 (1943).
Jee, J., et al. Rates and mechanisms of bacterial mutagenesis from maximum-depth sequencing. Nature. 534 (7609), 693-696 (2016).
Fusco, D., Gralka, M., Kayser, J., Anderson, A., Hallatschek, O. Excess of mutational jackpot events in expanding populations revealed by spatial Luria-Delbrück experiments. Nature Communications. 7, (2016).
Halligan, D. L., Keightley, P. D. Spontaneous mutation accumulation studies in evolutionary genetics. Annual Review of Ecology Evolution and Systematics. 40 (1), 151-172 (2009).
Jónsson, H., et al. Parental influence on human germline de novo mutations in 1,548 trios from Iceland. Nature. 549, (2017).
Krašovec, R., et al. Spontaneous mutation rate is a plastic trait associated with population density across domains of life. PLoS Biology. 15 (8), (2017).
Krašovec, R., et al. Mutation rate plasticity in rifampicin resistance depends on Escherichia coli cell-cell interactions. Nature Communications. 5, 3742 (2014).
Massey, R. C., Buckling, A. Environmental regulation of mutation rates at specific sites. Trends in Microbiology. 10 (12), 580-584 (2002).
Lynch, M., et al. Genetic drift, selection and the evolution of the mutation rate. Nature Review Genetics. 17 (11), 704-714 (2016).
Foster, P. L. Stress-induced mutagenesis in bacteria. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 42 (5), 373-397 (2007).
Krašovec, R., et al. Where antibiotic resistance mutations meet quorum-sensing. Microbial Cell. 1 (7), 250-252 (2014).
Krašovec, R., et al. Opposing effects of final population density and stress on Escherichia coli mutation rate. The ISME Journal-Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 12, 2981-2987 (2018).
Lea, D., Coulson, C. The distribution of the numbers of mutants in bacterial populations. Journal of Genetics. 49 (3), 264-285 (1949).
Armitage, P. The statistical theory of bacterial populations subject to mutation. Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological. 14 (1), 1-40 (1952).
Koch, A. L. Mutation and growth rates from Luria-Delbrück fluctuation tests). Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 95 (2-3), 129-143 (1982).
Cairns, J., Overbaugh, J., Miller, S. The origin of mutants. Nature. 335 (6186), 142-145 (1988).
Stewart, F. M., Gordon, D. M., Levin, B. R. Fluctuation analysis: the probability distribution of the number of mutants under different conditions. Genetics. 124 (1), 175-185 (1990).
Drake, J. W. A constant rate of spontaneous mutation in DNA-based microbes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (16), 7160-7164 (1991).
Ma, W. T., Sandri, G. V., Sarkar, S. Analysis of the Luria-Delbrück distribution using discrete convolution powers. Journal of Applied Probability. 29 (2), 255-267 (1992).
Shapiro, J. A. Adaptive mutation – Who’s really in the garden. Science. 268 (5209), 373-374 (1995).
Matic, I., et al. Highly variable mutation rates in commensal and pathogenic Escherichia coli. Science. 277 (5333), 1833-1834 (1997).
Rosche, W. A., Foster, P. L. Determining mutation rates in bacterial populations. Methods. 20 (1), 4-17 (2000).
Rosenberg, S. M. Evolving responsively: Adaptive mutation. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 504-515 (2001).
Lynch, M. Evolution of the mutation rate. Trends in Genetics. 26 (8), 345-352 (2010).
Zheng, Q. A new practical guide to the Luria-Delbrück protocol. Mutation Research. 781, 7-13 (2015).
Boesen, J. J. B., Niericker, M. J., Dieteren, N., Simons, J. How variable is a spontaneous mutation-rate in cultured-mammalian-cells. Mutation Research. 307 (1), 121-129 (1994).
Melnyk, A. H., Wong, A., Kassen, R. The fitness costs of antibiotic resistance mutations. Evolutionary Applications. 8 (3), 273-283 (2015).
Sun, L., et al. Effective polyploidy causes phenotypic delay and influences bacterial evolvability. PLoS Biology. 16 (2), (2018).
Frenoy, A., Bonhoeffer, S. Death and population dynamics affect mutation rate estimates and evolvability under stress in bacteria. PLoS Biology. 16 (5), (2018).
Foster, P. L. Methods for determining spontaneous mutation rates. Methods in Enzymology. , 195-213 (2006).
Wrande, M., Roth, J. R., Hughes, D. Accumulation of mutants in "aging" bacterial colonies is due to growth under selection, not stress-induced mutagenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (33), 11863-11868 (2008).
Adrien, M., Rémy, D., Stéphane, D., Bernard, Y. flan: An R package for inference on mutation models. The R Journal. 9. 334, (2017).
Garibyan, L., et al. Use of the rpoB gene to determine the specificity of base substitution mutations on the Escherichia coli chromosome. DNA Repair. 2 (5), 593-608 (2003).
Stewart, F. M. Fluctuation tests: how reliable are the estimates of mutation rates?. Genetics. 137 (4), 1139-1146 (1994).
Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Molecular Systems Biology. 2 (1), (2006).
Yamagishi, J. -. I., Yoshida, H., Yamayoshi, M., Nakamura, S. Nalidixic acid-resistant mutations of the gyrB gene of Escherichia coli. Molecular and General Genetics MGG. 204 (3), 367-373 (1986).
Chen, J., et al. Identification of novel mutations associated with cycloserine resistance in Mycobacterium tuberculosis. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 72 (12), 3272-3276 (2017).
Lang, G. I., Murray, A. W. Estimating the per-base-pair mutation rate in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 178 (1), 67-82 (2008).
Uphoff, S., et al. Stochastic activation of a DNA damage response causes cell-to-cell mutation rate variation. Science. 351 (6277), 1094-1097 (2016).
Robert, L., et al. Mutation dynamics and fitness effects followed in single cells. Science. 359 (6381), 1283-1286 (2018).
Kong, A., et al. Rate of de novo mutations and the importance of father/’s age to disease risk. Nature. 488 (7412), 471-475 (2012).
Narasimhan, V. M., et al. Estimating the human mutation rate from autozygous segments reveals population differences in human mutational processes. Nature Communications. 8 (1), 303 (2017).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Krašovec, R., Richards, H., Gomez, G., Gifford, D. R., Mazoyer, A., Knight, C. G. Measuring Microbial Mutation Rates with the Fluctuation Assay. J. Vis. Exp. (153), e60406, doi:10.3791/60406 (2019).

Automatically Generated