Dalgalanma Tsalimi ile Mikrobiyal Mutasyon Oranlarının Ölçülmesi

Bir mutasyon oranı herhangi bir tahmin içinde ve çalışmalar arasında tekrarlanabilirlik sağlamak için elde edilen hassasiyeti en üst düzeye çıkarmak gerekir³⁴. Bir dalgalanma tsay için, üç kritik hususlar vardır. İlk ikisi verilen protokolde ayarlanmıştır, ancak protokol farklı suşlarla veya ortamlarla çalışacak şekilde uyarlanmışsa sorun giderme gerekir (Bkz. Şekil 3). İlk uygun henotypic marker seçmektir. Bakteriler için, iki marker loci, rpoB veya gyrA,antibiyotikler rifampicin ve nalidixic asit direnç conferring birinde oranları tahmin etmek için tavsiye edilir, sırasıyla. Bu iki loci de antibiyotik direnci mutasyonlar için hedef boyutu farklıdır. Rifampisin³⁷ ve nalidixic asit^40’a direnç veren 79 ve 20 benzersiz mutasyon vardır. Uygulamada, bu ortalama olarak, rifampisin dirençli mutantlar daha sık gözlenen anlamına gelir. Yani, cevaplanması gereken ilk soru (Şekil 3’tekiQ1) zorlanmanın bir mutasyon olup olmadığıdır. Birçok gözlemlenen mutant koloninin beklendiği kurucu mutasyonlar incelendiğinde, daha küçük bir hedef boyutuna (örneğin, nalidixic asit) sahip bir belirteç kullanmak daha iyidir. Şekil 2B’yebakınız, kurucu mutator E. coli K-12 BW25113 ΔmutT mutasyon oranlarının işaretleyici olarak nalidixic asit kullanılarak tahmin edildiği yer. Yabani tipte (yani normal) mutasyon oranına sahip mutasyon olmayan bakteriyel suşlarla çalışırken, rifampisin daha iyi bir seçimdir (Bkz. Şekil 2A). Eğer nedense daha fazla gözlemlenen mutantlara ihtiyaç duyulsa, ilgili bir belirteç sikloserine karşı dirençtir. Bu belirteç için, direnç mutasyonları ondan fazla genortaya çıkabilir⁴¹, yani hedef boyutu bile rifampisin için daha büyüktür. Maya ve arke incelerken sırasıyla 25S ribozomal proteinler ve URA3 mutasyon oranlarının tahmin edilebilmektedir, higromisin B ve 5-floro-orotik asit (5-FOA) direnci ni ğeşler.

İkinci kritik husus ise paralel kültürlerin hacmidir. Hangi hacmin kullanılacağı gözlenen mutantların gerçek sayısına bağlıdır. Gözlenen mutantların beklenen sayısı seçilen henotibik belirteç için hedef boyutundan, suşların mutasyonları onarma ve önleme kapasitesinden (ortalama mutasyon oranı) ve hem kullanılan ortam hem de kültür hacminden etkilenen çevrenin taşıma kapasitesinden etkilenir. Eğer rifampisin dirençli mutant koloniler içermis bir paralel kültür yoksa sikloserin kullanılmalı veya kaplamalı hücre sayısı artırılmalıdır. Bu, minimal bir ortama daha fazla glikoz ekleyerek veya daha zengin (veya eksiksiz) bir ortamda büyüyen hücrelerle elde edilebilir. Ancak, birçok durumda, nüfus yoğunluğunda böyle bir artış mutasyon hızında bir azalma ile ilişkilidir, sınırlı sonuçlanan, eğer varsa, mutant kolonilerin sayısında artış^{gözlenen 10}. Besinleri artırmak bir çözüm değilse, her paralel kültürün hacmini artırarak hücre sayısını artırmak bir seçenektir. Ortam tek karbon ve enerji kaynağı olarak şekerli minimum tuzları içeriyorsa (yani Şekil 3’teki Q2’ye cevap “minimal orta”), 0,5 ile 1,5 mL arasındaki hacimler kullanılmalıdır. Ortam zenginse, paralel kültürlerin hacimleri 0,35−1 mL arasında olmalıdır. Son soru dirençli kolonilerin medyan sayısı ile ilgilidir. Çok az mutant koloni gözlenirse (yani Şekil 3’teki Q3’e cevap 0 ise) ve çevre değiştirilmemelidir, paralel kültürlerin hacmi artırılmalı veya daha büyük bir hedef boyutuolan antibiyotik (örn. sikloserin) kullanılmalıdır. Öte yandan, tüm seçici plakalarda çok sayıda mutant koloni salgılanırsa (plaka başına ~150’den fazla, şekil 3’ebakınız), kaplamalı hücre sayısı azaltılmalıdır, bu da genellikle daha düşük hacimli bir hacim kullanmak veya daha küçük bir hedef boyutuolan bir antibiyotiğe geçmek anlamına gelir (örneğin, nalidixic asit).

Hacim seçildikten sonra, bir 96 derin kuyu plakası üzerindeki tüm paralel kültürlerin aynı ses ekibe sahip olması en iyisidir. Bu plaka ağırlığı paralel kültürlerin gerçek hacmidaha kesin belirlenmesini sağlar. Belirli bir genotipin mutasyon oranları farklı ortamlar arasında karşılaştırıldığında, yine tüm ortamlarda paralel kültürlerin aynı hacmi kullanmak en iyisidir. Nalidixic asit yabani tip tahmin için kullanılırsa (yani, normal) mutasyon oranları veya nalidixic asit daha küçük bir hedef boyutu nalidixic asit daha küçük bir hedef boyutu nalidsik iktisat için başka bir fenotipik marker kullanılır, hacim daha da artırılmalıdır. Bir seçenek, 15 mL’ye kadar hacimli 50 mL tüplerde paralel kültürler yapmaktır. Örneğin, E. coli K-12 MG1655 mutasyon oranına nalidixic aside tahmin edildiğinde 50 mL tüplerde 10 mL paralel kültür hazırlanmıştır (Bkz. Şekil 2A). Paralel 10 mL kültürler daha sonra seçici TA agar üzerine kaplandı ve standart 90 mm Petri kapları yerine büyük 150 mm plakalara döküldü. 50 mL tüplerde paralel kültürlerin hazırlanmasının dezavantajı, 96 derin kuyu plakasındaki mutasyon oranlarına kıyasla, elde edilen iniş oranının çok daha düşük olmasıdır. Bir çözüm paralel kültürlerin sayısını azaltmaktır. Ancak, bu mutasyonolayların beklenen sayısı ve paralel kültürlerin sayısı na bağlı olarak mtahmini için kesinlik^{etkileyecektir 26}. 14−17 paralel kültüre sahip gözlemlenen mutantların dağılımının elde edilmesi (Şekil 2’deolduğu gibi), katı bir iş ve kabul edilebilir bir hassasiyet seviyesi olan^{%26 ile %20} arasında iyi bir dengedir. %17,5’lik ortanca hassasiyet düzeyi, çok daha büyük bir veri kümesi^10’danhesaplanan %16,4 (%5,7−%−38,9%, n = 580) ara sıra aralığıyla ortanca hassasiyete benzer. Bu nedenle 96 derin kuyu plakası veya 50 mL tüpte paralel kültürler hazırlanırken gözlemlenen mutantların dağılımının en az 14 paralel kültürle elde edilmesi tavsiye edilir. Farklı ortamlarda mutasyon oranları tahmin edildiğinde, bir plaka üzerindeki 96 paralel kültürün aynı ortamda yetiştiği çok plakalı bir deney yaparak hassas seviyelerin test edilebilmektedir. Buna ek olarak, paralel kültürler hazırlarken, inocula’nın düşük sayıda hücre içermesi önemlidir, çünkü inokülde herhangi bir dirençli hücrenin bulunma olasılığını azaltır. Önceden var olan dirençli mutantlar inokülde istenmezler, çünkü sayıca artacak ve seçici plakalar üzerinde bir çim oluşturacak ve mutasyon oranının tahmini mümkün olmayacaktır. Örneğin, mutasyon olmayan E. coli popülasyonlarının çoğunda rifampisin direncine mutasyon oranı ~10^-8sıradadır. Bu nedenle, önceden var olan dirençli bir mutant ile kültür aşılama önlemek için, bir az 10^{8 hücreleri} (örneğin, 10³−10⁴ hücreleri) ile aşılamak gerekir. Son kritik adım seçici agar plakaları inkübe önce, seçici agar yüzeyi tamamen kuru olduğundan emin olmaktır. Örneğin, 6 kuyulu plakalar kullanılıyorsa ve paralel bir kültürün ilk hacmi 1 mL ise yayıcılar kullanılamaz. Yüzeylerin sıvısının kuruması için plakalar steril koşullarda açık bırakılmalıdır. Bu süre son derece değişken olabilir, ortam koşullarına ve plakaların durumuna bağlı olarak. Bu süre en aza indirilmelidir, ancak birkaç saate kadar olabilir.

Dalgalanma tsay doğal kısıtlamalar vardır. Sadece genomun küçük bir alt kümesinde mutasyonun henotypik belirteçlerini tahlil ediyor. Bu nedenle, bir oranı tahmin etmek için yeterli sayıda mutasyonu gözlemlemek için yeterli sayıda nesilden geçen büyük popülasyonlar gerektirir. Bu dalgalanma tahlilleri sadece hızlı bir şekilde nesiller çok sayıda geçme yeteneğine sahip organizmalar üzerinde kullanılabilir anlamına gelir, bakteri gibi, fırıncı maya⁴², veya sıvı-kültür memeli hücreleri³⁰. Ayrıca, mutasyonlar belirli bir hücrenin spesifik biyokimyasal durumlarda meydana gelen nadir olaylardır. Dalgalanma tahlillerinin zaman içinde büyük hücre popülasyonlarına bakması, bu koşulların önemli ölçüde farklılık sağlayabileceği anlamına gelir. Bu titreyi kullanarak, belirli bir popülasyonun mutasyon oranlarının gecikme evresinden erken ve geç üstel evreye ve son olarak da sabit bir evreye doğru ilerlemesini incelemek zordur. Popülasyondaki tek hücreler arasındaki mutasyon oranlarının herhangi bir farklılaşması dalgalanma tsayından tamamen gizlidir. Tek hücreli mutasyon dinamiği DNA onarım proteini MutS⁴³ tek molekül izleme veya birikmiş MutL proteinleri⁴⁴sayarlayarak incelenebilir. Yüksek iş itimat sıralamasındaki son gelişmeler, ana-yavru^üçlüs9,45 ve çok nesilli soy ağacı^46’danmutasyon oranlarını doğrudan tahmin etmeyi de mümkün kılmıştır. Bu tür metodolojik gelişmeler, tek bir nesil içinde meydana gelen mutasyonların doğrudan sayma izin vermeye başlıyor. Ancak, bu doğrudan yaklaşım floresan mikroskobu, mikroakışkanlar veya tüm genom dizilemesi gibi pahalı ve son teknolojiye ihtiyaç duyar. Öte yandan, dalgalanma test nispeten ucuz ve sadece standart laboratuvar ekipmanları gereklidir. Daha fazla dalgalanma tahlilleri yapmak da daha doğrudan tek hücreli yaklaşımlar ile test edilebilir yeni hipotezler nesil kolaylaştıracaktır.

Mutasyonların incelenmesinde uzun zamandır devam eden bir ilgi vardır, bu nedenle dalgalanma tözbüyük olasılıkla yaygın olarak kullanılan bir yöntem olmaya devam edecektir. Luria ve Delbrück^5’in son 4 yılda (2015-2018) yayınladığı belgenin atıf sayısı, bu makalenin atıfları için ilk beş arasında yer almaktadır. Ancak, doğru bir dalgalanma tahlil yürütmek için gerekli hassas manuel çalışma büyük miktarda nedeniyle, çoğu çalışma sadece dalgalanma tahlilleri bir avuç yürütmek. Ancak bu, mutasyon oranının çevresel bağımlılıklarını ortaya çıkarmak için yeterli değildir. Bu yazıda açıklandığı gibi, çok kuyu lu plakalar kullanılarak yapılan dalgalanma tahlillerini düzene sokarak, mevcut maksimum verim, burada açıklandığı gibi paralel olarak 11 derin kuyu plakasi (55 dalgalanma tahlilleri) dir. Bir gün paralel olarak iki dizi dalgalanma tahlilleri çalıştırmak, haftada 110 tahlil yapılmasına olanak sağlar. Verilen tamamen manuel protokolden dalgalanma tahlillerinin çeşitli adımlarını otomatikleştirerek, iş elde etme de başka bir adım değişikliği mümkün olabilir. Ayrıca, mutasyon oranının çevresel bağımlılıklarının incelenmesi için nüfus yoğunluğunun da dikkate alınması gerekmektedir. Önceki sonuçlar¹⁰ mutasyon oranını etkileyen bilinen faktörler hesaba katıldığında, popülasyon yoğunluğunun kontrol edilmesinin mutasyon oranı tahminlerindeki değişimi %90’dan fazla azaltabileceğini göstermektedir. Yoğunluğu kontrol etmek için, n_t ‘nin (mutasyon oranını tahmin etmek için kullanılır) popülasyon yoğunluğunu belirlemek için kullanılan yöntemden bağımsız olarak belirlenmesini öneririz. Bakterilerde, N_t CFU ve yoğunluk tarafından belirlenebilir, örneğin, bir ATP tabanlı parlaklık tsay¹⁰.

Bir organizmanın ekolojik bağlamının spontan mutasyon oranını nasıl etkilediğini incelerken yüksek iş ve kontrol yoğunluğu da önemlidir. Mutasyon oranı plastisite varlığını bilmek önemlidir, ancak mutasyon oranı plastisite daha geniş bir biyolojik bağlamda dahil edilecekise, bunun nedenleri ve etkileri anlamak karşılanması gereken önemli sorunlardır. Dalgalanma tahlil sonuçları hızla elde edilir, çünkü birçok hipotezleri test etmek için kullanılabilecek büyük bir araçtır, ve tahliller diğer yöntemlere göre ucuzdur. Örneğin, bakteri toplulukları ve mikrobiyomlarda mutasyon oranının çevresel bağımlılıklarını incelemek için aşama belirlenmiştir. Dalgalanma testini kokültürlere uyarlamak, suşların küçük moleküller aracılığıyla birbirlerinin mutasyon oranlarını etkilediği hipotezini test edebilir. Kokültürlerle birlikte binlerce dalgalanma tahlilleri yapmak, suşların hem birbirlerinin mutasyon oranlarını değiştirme yeteneklerinde hem de mutasyon oranlarının başkaları tarafından değiştirilmeye yatkınlıklarında farklılık gösterip değiştirmediğini belirleyebilir. Mutasyon oranı manipülasyonuna yatkınlıkta suşlar arasındaki varyasyon belirli genetik varyasyona atfedilebilir. Bu, evrimin karmaşık topluluklarda nasıl işlediğine ilişkin görüşlerimizi değiştirebilir, en azından antimikrobiyal direncin nasıl ortaya çıktığı gibi geniş öneme sahip örneklerde.