Messung der mikrobiellen Mutationsraten mit dem Fluktuationstest

Jede Schätzung einer Mutationsrate muss die erreichte Genauigkeit maximieren, um die Wiederholbarkeit und Reproduzierbarkeit innerhalb und zwischen den Studien zu gewährleisten³⁴. Für einen Fluktuationstest gibt es drei kritische Überlegungen. Die ersten beiden wurden im angegebenen Protokoll festgelegt, müssen jedoch behoben werden (siehe Abbildung 3), wenn das Protokoll für die Arbeit mit verschiedenen Stämmen oder Umgebungen angepasst ist. Zuerst ist es, den entsprechenden phänotypischen Marker zu wählen. Für Bakterien wird empfohlen, die Raten bei einem von zwei Marker-Loci, rpoB oder GyrAzu schätzen, was eine Resistenz gegen Antibiotika Rifampicin bzw. Nalidixsäure verleiht. Die Zielgröße für Mutationen zur Antibiotikaresistenz an diesen beiden Loci ist unterschiedlich. Es gibt 79 und 20 einzigartige Mutationen, die eine Resistenz gegen Rifampicin³⁷ bzw. Nalidixsäure⁴⁰ verleihen. In der Praxis bedeutet dies, dass im Durchschnitt Rifampicin resistente Mutanten häufiger beobachtet werden. Die erste Frage (Q1 in Abbildung 3), die beantwortet werden muss, ist also, ob es sich bei der Sorte um einen Mutator handelt. Wenn konstitutive Mutatoren untersucht werden, wo viele beobachtete mutierte Kolonien erwartet werden, ist es besser, einen Marker mit einer kleineren Zielgröße (z. B. Nalidixsäure) zu verwenden. Siehe Abbildung 2B, wo die Mutationsraten des konstitutiven Mutators E. coli K-12 BW25113-mutT unter Verwendung von Nalidixsäure als Marker geschätzt wurden. Bei der Arbeit mit Nichtmutator-Bakterienstämmen, die eine wilde (d. h. normale) Mutationsrate aufweisen, ist Rifampicin die bessere Wahl (siehe Abbildung 2A). Wenn aus irgendeinem Grund mehr beobachtete Mutanten benötigt werden, ist ein relevanter Marker die Resistenz gegen ein Cycloserin. Für diesen Marker können Resistenzmutationen in mehr als zehn Genen⁴¹auftreten, was bedeutet, dass die Zielgröße sogar größer ist als bei Rifampicin. Bei der Untersuchung von Hefe und Archaeen wird empfohlen, die Mutationsraten in 25S ribosomalen Proteinen und URA3 zu schätzen, was eine Resistenz gegen Hygromycin B bzw. 5-Fluor-Orosäure (5-FOA) aufweist.

Die zweite kritische Überlegung ist das Volumen paralleler Kulturen. Welches Volumen verwendet werden soll, hängt von der tatsächlichen Anzahl der beobachteten Mutanten ab. Die erwartete Anzahl der beobachteten Mutanten wird durch die Zielgröße des gewählten phänotypischen Markers, die Fähigkeit des Stammes, Mutationen zu reparieren und zu vermeiden (die durchschnittliche Mutationsrate), und die Tragfähigkeit der Umgebung beeinflusst, die sowohl durch die verwendeten Medien als auch durch das Kulturvolumen beeinflusst wird. Wenn keine Parallelkulturen mutierte Kolonien enthalten, die gegen Rifampicin resistent sind, sollte Cycloserin verwendet oder die Anzahl der plattierten Zellen erhöht werden. Dies kann erreicht werden, indem mehr Glukose zu einem minimalen Medium hinzugefügt wird oder durch das Wachsen von Zellen in einer reicheren (oder vollständigen) Umgebung. In vielen Fällen ist ein solcher Anstieg der Bevölkerungsdichte jedoch mit einer Verringerung der Mutationsrate verbunden, was zu einer begrenzten, wenn überhaupt, Zunahme der Zahl der beobachteten mutierten Kolonien^{um 10}führt. Wenn die Erhöhung der Nährstoffe keine Lösung ist, dann ist es eine Option, die Anzahl der Zellen durch Erhöhung des Volumens jeder Parallelkultur zu erhöhen. Wenn die Umwelt minimale Salze mit Zucker als einzige reine Kohlenstoff- und Energiequelle enthält (d. h. die Antwort auf Q2 in Abbildung 3 ist “minimal mittel”), dann sollten Volumina zwischen 0,5 und 1,5 ml verwendet werden. Wenn die Umgebung reich ist, sollten die Volumes paralleler Kulturen zwischen 0,35 und 1 ml liegen. Die letzte Frage betrifft die durchschnittliche Anzahl resistenter Kolonien. Wenn zu wenige mutierte Kolonien beobachtet werden (d. h. die Antwort auf Q3 in Abbildung 3 ist 0) und die Umgebung nicht verändert werden soll, dann sollte das Volumen der Parallelkulturen erhöht oder das Antibiotikum mit einer größeren Zielgröße (z. B. Cycloserin) verwendet werden. Auf der anderen Seite, wenn viele mutierte Kolonien auf allen selektiven Platten beobachtet werden (mehr als 150 usd pro Platte, siehe Abbildung 3), dann sollte die Anzahl der plattierten Zellen verringert werden, was in der Regel bedeutet, ein geringeres Volumen zu verwenden oder zu einem Antibiotikum mit einer kleineren Zielgröße (z. B. Nalidixinsäure) zu wechseln.

Sobald das Volumen gewählt ist, ist es am besten, dass alle Parallelkulturen auf einer 96 tiefen Brunnenplatte das gleiche Volumen haben. Dies ermöglicht eine genauere Bestimmung des tatsächlichen Volumens der Parallelkulturen aus dem Gewicht der Platte. Wenn Mutationsraten eines bestimmten Genotyps zwischen verschiedenen Umgebungen verglichen werden, ist es wiederum am besten, das gleiche Volumen paralleler Kulturen in allen Umgebungen zu verwenden. Wenn Nalidixsäure zur Schätzung von Wildtyp-Mutationsraten (d. h. normal) verwendet wird oder ein anderer phänotypischer Marker verwendet wird, der eine noch kleinere Zielgröße als Nalidixsäure hat, muss das Volumen noch erhöht werden. Eine Möglichkeit besteht darin, Parallelkulturen in 50 ml-Rohren mit einem Volumen von bis zu 15 ml herzustellen. So wurden beispielsweise 10 ml Parallelkulturen in 50 ml-Röhrchen bei der Schätzung der Mutationsrate E. coli K-12 MG1655 zu Nalidixsäure hergestellt (siehe Abbildung 2A). Die parallelen 10 ml-Kulturen wurden dann auf den selektiven TA-Agar plattiert und in große 150-mm-Platten statt in standard90 mm Petrischalen gegossen. Der Nachteil der Vorbereitung von Parallelkulturen in 50 ml-Röhren ist, dass der Durchsatz im Vergleich zu den Assaying-Mutationsraten in einer 96-Tiefenbrunnenplatte deutlich geringer ist. Eine Lösung besteht darin, die Anzahl der Parallelkulturen zu verringern. Dies wirkt sich jedoch auf die Genauigkeit für die Schätzung von maus, die von der erwarteten Anzahl von Mutationsereignissen und der Anzahl der Parallelkulturen^{abhängt 26}. Die Erlangung einer Verteilung der beobachteten Mutanten mit 14-17 Parallelkulturen (wie in Abbildung 2) ist ein gutes Gleichgewicht zwischen einem festen Durchsatz und einer akzeptablen^{Genauigkeitsstufe 26} von 20 %. Ein mittlerer Genauigkeitsgrad von 17,5 % ähnelt der Mediangenauigkeit mit einem Interquartilbereich von 16,4 % (5,7 % bis 38,9 %, n = 580), der aus einem viel größeren Datensatz¹⁰berechnet wird. Daher wird empfohlen, bei der Herstellung von Parallelkulturen in 96 Tiefenbrunnenplatten oder 50 ml-Rohren die Verteilung der beobachteten Mutanten mit mindestens 14 Parallelkulturen zu erhalten. Wenn Mutationsraten in verschiedenen Umgebungen geschätzt werden, wird empfohlen, Präzisionsstufen durch ein Multiplattenexperiment zu testen, bei dem alle 96 Parallelkulturen auf einer Platte in derselben Umgebung angebaut werden. Darüber hinaus ist es bei der Herstellung von Parallelkulturen entscheidend, dass Inocula eine geringe Anzahl von Zellen enthält, da es die Wahrscheinlichkeit verringert, dass resistente Zellen im Inokulum vorhanden sind. Bereits vorhandene resistente Mutanten sind im Inokulum nicht erwünscht, da sie an Zahl zunehmen und einen Rasen auf selektiven Platten erzeugen und eine Schätzung der Mutationsrate nicht möglich sein wird. In den meisten E. coli-Populationen ohne Mutator beträgt die Mutationsrate bis zur Rifampicin-Resistenz beispielsweise in der Größenordnung von 10^-8. Um die Kultur nicht mit einem bereits vorhandenen resistenten Mutanten zu impfen, muss man also mit weniger als 10⁸ Zellen (z.B. 10³x 10⁴ Zellen) impfen. Der letzte kritische Schritt besteht darin, sicherzustellen, dass vor der Inkubation selektiver Agarplatten die Oberfläche auf dem selektiven Agar vollständig trocken ist. Streuer können nicht verwendet werden, wenn beispielsweise 6-Well-Platten verwendet werden und das Anfangsvolumen einer Parallelkultur 1 ml beträgt. Die Platten müssen unter sterilen Bedingungen freigelegt werden, damit die Oberflächenflüssigkeit austrocknen kann. Die Zeit, die dies in Anspruch nimmt, kann sehr variabel sein, abhängig von den Umgebungsbedingungen und dem Zustand der Platten. Diese Zeit sollte minimiert werden, kann aber bis zu mehreren Stunden betragen.

Der Fluktuationstest hat inhärente Einschränkungen. Es untersucht phänotypische Mutationsmarker nur in einer kleinen Teilmenge des Genoms. Der Assay erfordert also große Populationen, die eine ausreichende Anzahl von Generationen durchlaufen, um genügend Mutationen zu beobachten, um eine Rate überhaupt abzuschätzen. Dies bedeutet, dass Fluktuationstests nur auf Organismen angewendet werden können, die in der Lage sind, schnell eine große Anzahl von Generationen zu durchlaufen, wie Bakterien, Bäckerhefe⁴²oder flüssige Säugetierzellen³⁰. Auch Mutationen sind seltene Ereignisse, die in den spezifischen biochemischen Umständen einer bestimmten Zelle auftreten. Die Tatsache, dass Fluktuationstests im Laufe der Zeit über große Populationen von Zellen hinweg aussehen, bedeutet, dass sich diese Umstände erheblich unterscheiden können. Anhand dieses Assays ist es daher schwierig, das Fortschreiten der Mutationsraten einer bestimmten Population von der Verzögerungsphase zur frühen und späten exponentiellen Phase und schließlich zu einer stationären Phase zu untersuchen. Jede Differenzierung der Mutationsraten zwischen einzelnen Zellen innerhalb der Population ist vollständig vor dem Fluktuationstest verborgen. Die Dynamik der Einzelzellmutation kann mit einer Einzelmolekül-Tracking des DNA-Reparaturproteins MutS⁴³ oder durch Zählen von Brennpunkten von akkumulierten MutL-Proteinen⁴⁴untersucht werden. Jüngste Fortschritte bei der Hochdurchsatzsequenzierung haben es auch ermöglicht, die Mutationsraten von Eltern-Nachkommen-Trios^9,45 und Mehrgenerationen-Stammbaum⁴⁶direkt abzuschätzen. Solche methodischen Fortschritte beginnen, die direkte Zählung von Mutationen zu ermöglichen, die innerhalb einer einzigen Generation auftreten. Dieser direkte Ansatz erfordert jedoch teure und hochmoderne Technologien wie Fluoreszenzmikroskopie, Mikrofluidik oder Vollgenomsequenzierung. Auf der anderen Seite ist der Fluktuationstest relativ kostengünstig und es wird nur Standard-Laborausrüstung benötigt. Mehr Fluktuationstests werden auch die Generierung neuartiger Hypothesen erleichtern, die mit direkteren einzelzelligen Ansätzen getestet werden können.

Es besteht ein langjähriges Interesse an der Untersuchung von Mutationen, so dass der Fluktuationstest wahrscheinlich eine weit verbreitete Methode bleiben wird. Die Anzahl der Zitate des wegweisenden Papiers von Luria und Delbrück⁵ in den letzten 4 Jahren (2015-2018) gehört enallt alle unter den Top 5 für Zitate dieser Zeitung. Aufgrund einer großen Menge an präziser manueller Arbeit, die für die ordnungsgemäße Durchführung eines Fluktuationstests erforderlich ist, führen die meisten Studien jedoch nur eine Handvoll Fluktuationstests durch. Dies reicht jedoch nicht aus, um die Umweltabhängigkeiten der Mutationsrate aufzudecken. Durch die Rationalisierung von Fluktuationstests mit Multiwell-Platten, wie in diesem Papier erläutert, ist der aktuelle maximale Durchsatz möglich 11 tiefe Brunnenplatten (55 Fluktuationstests) parallel, wie hier beschrieben. Das Parallele ausführen zwei Sätze von Fluktuationstests, die um einen Tag gestaffelt sind, ermöglicht die Durchführung von bis zu 110 Assays pro Woche. Eine weitere Schrittänderung des Durchsatzes kann noch möglich sein, indem verschiedene Schritte der Fluktuationstests aus dem rein manuellen Protokoll automatisiert werden. Auch bei der Untersuchung von Umweltabhängigkeiten der Mutationsrate muss die Bevölkerungsdichte berücksichtigt werden. Frühere Ergebnisse¹⁰ zeigen, dass die Kontrolle der Bevölkerungsdichte die Variation der Mutationsratenschätzungen um mehr als 90 % reduzieren kann, wenn bekannte Faktoren, die die Mutationsrate beeinflussen, berücksichtigt werden. Um die Dichte zu kontrollieren, empfehlen wir, N_t (zur Schätzung der Mutationsrate) unabhängig von der Methode zur Bestimmung der Bevölkerungsdichte zu bestimmen. Bei Bakterien kann N_t durch KBE und Dichte bestimmt werden, z.B. mit einem ATP-basierten Lumineszenz-Assay¹⁰.

Hoher Durchsatz und die Kontrolle der Dichte sind beides wichtig, wenn untersucht wird, wie sich der ökologische Kontext eines Organismus auf die spontane Mutationsrate auswirkt. Das Wissen um die Existenz der Plastizität der Mutationsrate ist wichtig, aber das Verständnis ihrer Ursachen und Wirkungen sind zentrale Herausforderungen, die bewältigt werden müssen, wenn die Plastizität der Mutationsrate in einen breiteren biologischen Kontext integriert werden soll. Der Fluktuationstest ist ein großartiges Werkzeug, das verwendet werden kann, um viele Hypothesen zu testen, da die Ergebnisse schnell erzielt werden und Assays im Vergleich zu anderen Methoden kostengünstig sind. Die Bühne ist beispielsweise für die Untersuchung von Umweltabhängigkeiten der Mutationsrate in Bakteriengemeinschaften und Mikrobiomen festgelegt. Die Anpassung des Fluktuationstests an Kokulturen kann die Hypothese testen, dass Stämme die Mutationsraten des jeweils anderen über kleine Moleküle beeinflussen. Tausende von Fluktuationstests mit Kokulturen können bestimmen, ob Stämme sowohl in ihrer Fähigkeit, die Mutationsraten des anderen zu modifizieren, als auch in ihrer Anfälligkeit für eine Änderung ihrer Mutationsrate durch andere variieren. Vielleicht ist die Variation zwischen stämmen in der Anfälligkeit für Mutationsratenmanipulation auf spezifische genetische Variationen zurückzuführen. Dies könnte unsere Ansichten darüber verändern, wie Evolution in komplexen Gemeinschaften funktioniert, nicht zuletzt in Beispielen von großer Bedeutung, wie z. B. wie antimikrobielle Resistenzen entstehen.