מדידת שיעורי המוטציה בעזרת שיטת התנודות
Summary
כאן, פרוטוקול מוצג לבצע שיטת תנודות והערכת שיעור מוטציה מיקרוביאלית באמצעות סמנים פנוטיפקס. פרוטוקול זה יאפשר לחוקרים לקבוע מוטציות בחיידקים שונים וסביבות, בקביעה כיצד גנוטיפ והקשר האקולוגי משפיעים על שיעורי מוטציה ספונטניים.
Abstract
תנודות בחני משמשות באופן נרחב להערכת שיעורי מוטציה בחיידקים הגדלים בסביבות נוזל. תרבויות רבות מחוסנת כל אחד עם כמה אלפי תאים, כל רגיש סמן סלקטיבי כי יכול להיות פנופי בדרך כלל. התרבויות המקבילות האלה גדלות במשך דורות רבים בהעדר סמן הפנוטילי. תת-ערכה של תרבויות משמשת להערכת מספר התאים הכולל בסכנת מוטציות (כלומר, גודל האוכלוסייה בסוף תקופת הצמיחה, או Nt). התרבויות הנותרות מצופים אל אגר הסלקטיביים. התפלגות המוטנטים העמידים בפני הצופים בין התרבויות המקבילות משמשת להערכת מספר האירועים הצפויים, m, באמצעות מודל מתמטי. חלוקת m על ידי Nt נותן את ההערכה של שיעור המוטציה לוקוס per. לאותה שלושה היבטים קריטיים: הטוש הנבחר מסמן, הכרך הנבחר של תרבויות מקבילות, ולהבטיח כי המשטח על אגר סלקטיבי יבש לחלוטין לפני הדגירה. המנה זולה יחסית, והיא זקוקה רק לציוד מעבדה סטנדרטי. זה גם פחות מפרך מאשר גישות חלופיות, כגון הצטברות מוטציה תא בודד assays. השיטת העבודה על אורגניזמים העוברים בדורות רבים במהירות ותלויה בהנחות על השפעות הכושר של סמנים ומוות תאים. עם זאת, כלים שפותחו לאחרונה ומחקרים תיאורטיים אומר בעיות אלה כעת ניתן לטפל באופן אנליסטי. השינוי מאפשר הערכת שיעור מוטציה של סמנים פנוטיפים שונים בתאים עם גנוסוגים שונים הגדלים בבידוד או בקהילה. על ידי ביצוע מספר בחני במקביל, בחני יכול לשמש כדי ללמוד איך הקשר הסביבתי של האורגניזם משפיע על שיעור מוטציה ספונטנית, אשר חיונית להבנת התנגדות מיקרוביאלית, קרצינובגנזה, הזדקנות, ואבולוציה.
Introduction
ב-1901 טבע הבוטניקאי ההולנדי הוגו דה פריז את המונח מוטציה1. עשרים ושש שנים מאוחר יותר, כאשר הרמן יוזף מולר גילה את הפעולה המוטוטאית של קרני הרנטגן2, מוטציות כבר נתפסו כאחד הכוחות המניע של האבולוציה. עם זאת, טבעו של מוטציות לא היה ברור. כדי לענות על השאלה הבסיסית של האם מוטציות לצוץ באופן ספונטני (כלומר, מוטציה ספונטנית) או בתגובה לבחירה (כלומר, מוטציה המושרה), היה צורך בשיטה כדי לצפות באירועי מוסיקה. שיטה כזו למדוד את המספר הצפוי של מוטציות לכל החטיבה תא או מה שהיה ידוע כבר שיעור מוטציה3,4.
איור 1: המחשה סכמטית של איך לבצע את שיטת התנודות עם זן מחיידקים בצלחת 96 היטב. (א) התחסן ותאי האקלים בצינורות 50 mL המכילים חמש סביבות שונות (‘ אדום ‘, ‘ כחול ‘, ‘ ירוק ‘, ‘ סגול ‘, ו-‘ כתום ‘ מאמר). (ב) להכין תרבויות מקבילות עם מספר קטן של תאים רגישים בצלחת 96 עמוק היטב. לשיטת ‘ האדום ‘ יש 20 תרבויות מקבילות, בעוד ‘ הכחול ‘, ‘ ירוק ‘, ‘ סגול ‘, ו’כתום ‘ מכיל 19 תרבויות מקבילות. המיקומים של התרבויות המקבילות על הצלחת הבאר העמוקה 96 הם אקראיים. אקראיות ניתן לעשות עם LayoutGenerator. R המשלים או על ידי כלי אחר. הפריסה בצד הימני העליון היא תוצאת האקראיות. (ג) מודאת 96 צלחת הבאר העמוקה ולאפשר לתאים להפריד ומוטציה ספונטנית. שש תרבויות מבארות עמוקות A1, B1, C1, E1, F1 ו-G1 מציגות כיצד מספר המוטציות משתנה: 4, 0, 2, 2, 1 ו-4 תאים אדומים לאחר חלוקת התא השלישי, בהתאמה. מספר מוטציות שונה לא רק בגלל מספר שונה של מוטציות ספונטניות (0, 1, או 2 כפי שמוצג על ידי התא האדום הראשון), אבל גם בגלל זה חשוב כאשר במהלך מחזור התרבות מוטציה התנגדות ספונטנית מתגלה (חלוקת התא 1, 2, או 3). (ד) לאחר הדגירה של 96 צלחת הבאר העמוקה מספר מוטציות נקבעת על ידי ציפוי 81 תרבויות מקבילות. בפריסה אלה הם עיגולים ללא קצוות מודגשים. התרבות המקבילה כולה מצופה על באר אחת של 6 צלחת באר המכילה אגר סלקטיבי. (ה) 15 התרבויות הנותרות מדולצות ומצופה על אגר הלא סלקטיבי כדי לקבוע את המספר הממוצע של תאים (Nt). בפריסה אלה מתויג כמו Ntwells ויש להם קצוות מודגשים. עבור כל שיטת N-t מממוצע מעל שלוש תרבויות מקבילות. בתחתית הימנית היא צלחת פטרי המכילה צלחת אגירה שאינה סלקטיבית עם 25 הפוס של תרבות מדוללת הגדלה ב-D1 היטב (חלק מתוך שיטת ‘ ירוק ‘). (ו) לאחר דגירה של 6 סלקטיבי לוחות היטב את מספר מוטציות נצפו נספרו והמספר הצפוי של אירועים מראש, m, הוערך באמצעות מערכת הסבירות מקסימלית. (ז) לדעת הן את מספר מוטציות, מ‘, ואת מספר התאים לכל שיטת, Nt, שיעור המוטציה הוערך כמו m/Nt. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
סלבדור לוריא ומקס דלבריק ב-1943 סיפקו פתרון גאוני לבעיה זו עם שיטת התנודות5 (ראה איור 1). הנתון מתחיל במספר רב של אוכלוסיות (הנקראות תרבויות מקבילות), המבוצעות עם מספר קטן של תאים מיקרוביאלית (איור 1א, ב). לאחר הצמיחה בסביבה שפיר, לא סלקטיבי (איור 1ג), תרבויות מקבילות מועברים על לוחות המכילים סמן סלקטיבי (phages, אנטיביוטיקה, וכו ‘), שם רק תאים עם מוטציה התנגדות לשרוד יכול לייצר מושבה (איור 1ד). הציפייה העיקרית היתה כי אם מוטציות התנגדות הם המושרה, מספר התאים הנושאים מוטציה צריך להיות מופץ בין אוכלוסיות שונות עם ממוצע שווה לשונות. מה שלוריא ודלבריק מצאו בעזרת שיטת התנודות היא שמספר המוטציות השתנו באופן דרסטי ושהשונות במספר המוטציות בקרב אוכלוסיות שונות הייתה גדולה במידה ניכרת מהמשמעות. לוריא ודלבריק הוכיחו שמוטציות הן ספונטניות. הם הראו כי מוטציות להגיח באופן ספונטני בכל פעם את ה-DNA משוכפל, ואת מספר המוטציות תלוי כאשר המוטציה מתרחשת במהלך הצמיחה של האוכלוסייה. ראה איור 1ג, היכן שישה אוכלוסיות, כל אחת מהן יוזמת תא בחיידקים (בכחול), ניסיון כלשהו, 1 או 2 מוטציות בודדות. אוכלוסיות A1, E1 ו-F1 חוו מוטציה אחת בודדת (התא האדום הראשון), אבל בגלל מוטציה אחת באופן ספונטני מתגלה בנקודות זמן שונות במהלך מחזור התרבות, האוכלוסיה הסתיימה עם מספר שונה מאוד של מוטציות נצפו (ארבע, שתיים, ואחד, בהתאמה). מצד שני, אוכלוסיות C1 ו-G1 הגיעו עם אותו מספר של מוטציות נצפו כמו E1 ו-A1, למרות שחוו שני אירועים מוונים ולא אחד. התנודות של המוטנטים הנצפים בקרב האוכלוסיות לא רק נתן את העובדה את השם, אלא גם הראה כי תדר מוטציה (כלומר, היחס של תאי מוטציה) הוא אינדיקציה לקוי של שיעור המוטציה.
המטרה הכוללת של שיטת התנודות היא לאמוד את קצב המוטציה הספונטני של גנוטיפ מסוים של חיידקים או אורגניזם יחיד-תא הצומח בסביבה נוזלית מסויימת. שיטת התנודות נשארת הכלי המתאים ביותר לחקר התלות הסביבתית של שיעורי מוטציה מיקרוביאלית ומאפשרת הערכה מהירה וזולה של שיעור מוטציה. גישות חלופיות שערוך שיעור מוטציה, כגון העומק המקסימלי רצף6, האוכלוסייה רצף7, ניסויים הצטברות מוטציה8, או השוואת רצפי הגנום של צאצאים לאלה של ההורים9 הם הרבה יותר מפרך, ולכן מתאים בצורה גרועה כדי לגלות יחסי תלות סביבתיים. עם זאת, היבטים דינאמיים של הדור והתיקון של מוטציה אינם נגישים במידה רבה לשיטת תנודות או לכל אחת מהשיטות של הטענה שיעור מוטציה הרשום לעיל. כדי ללמוד כיצד השינויים משתנים בזמן, במרחב, או בין תאים בודדים בתוך אוכלוסיה, הגישות תא יחיד11,12 הם הכרחיים, אשר, בנוסף להיותו מפרך יותר מאשר תנודות, דורשים מיומנויות מיוחדות וציוד.
בפועל, שיטת תנודות היא ספירת תאים הצובר סמן פנוטימית בשל מוטציה המתרחשת בסביבה חסרת בחירה עבור סמן זה. המטא-ניתוח של מאות בחני שפורסמו אומר10 מראה כי לפחות 39 שונים סמנים פנוויטיic שימשו מאז הקמתה של הטיפול ב 1943. את שיטת התנודות ניתן להשתמש כדי להשוות את הממוצעים ואת התלות הסביבתית של שיעורי מוטציה בקרב מעבדה, קליני, לא מופטור, ו זנים מושעברו גדל בסביבות מתירני. המנה מאפשרת שערוך שיעור מוטציה בתאים עם רקעים גנטיים שונים גדל בסביבות מינימליות או עשיר. הטיפול מתאים לא רק לאוכלוסיות הגדלות כתרבות חד-תרבותית, אך ניתן להשתמש בהן גם ללימוד השפעות האינטראקציות של תאי התא על שערי מוטציה11. כאשר המתח של עניין הוא מתורבת עם זן שני, וסמן נייטרלי משמש כדי להבדיל את הזנים, שיעורי מוטציה יכול להיות מיועד שני זנים באותה צינורית באותו זמן.
תנודות מספר גילו כי שיעור המוטציה הספונטנית תלוי הן גנוטיפ של התא וסביבתו12 והיא תכונה שעצמה מתפתחת13. בכל פעם שקצב המוטציה של גנוטיפ מסוים אחד משתנה עם הסביבה, הוא מתואר כפלסטיות בקצב מוטציה11. שיעורי מוטציה פלסטיים התייחסו ביסודיות ביותר עבור מוטזיס מתח המושרה (SIM)14. בנוסף, באמצעות תנודות שאומר, זה כבר הוכח לאחרונה כי הצפיפות שבה אוכלוסייה של תאים גדל (בדרך כלל תרבות אצווה על קיבולת הנשיאה) קשורה היטב עם שיעורי מוטציה על פני חיידקים ו-eukaryotes. שיעור מוטציה לכל הגנום לדור פוחתת באוכלוסיות צפופות על ידי עד 23 קיפול10,11. הפלסטיות הקשורה בצפיפות שיעור המוטציה (לח) יכול להיות תלוי במערכת חישת-מניין15 ולפעול באופן עצמאי של ה-SIM16.
כאן, פרוטוקול מפורט מוצג עבור שיטת התנודות המשמשות לחקר es, מאמץ קולי להתאמץ K-12 צובר עמידות גריסופלובין אנטיביוטי בסביבת מדיה מינימלית גלוקוז. עם זאת, פרוטוקול זה צריך להיות מוצג כתבנית בסיסית שיכול להיות מנוצל כדי ללמוד מגוון רחב של חיידקים על ידי שינוי מצבי התרבות וסמנים פנוטימית של מוטציה. הפרוטוקול התפתח מן הקמתה5,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29 באמצעות השימוש שלה על מגוון רחב של חיידקים תאים סרטניים אפילו30 ו שונתה כדי להגדיל התפוקה, שהייתה חיונית לבדיקה תקינה של יחסי תלות סביבתיים של שיעורי מוטציה מחיידקים10,11,16. הפרוטוקול המתואר כאן אינו מכסה את כל הנושאים מתודולוגיים ואנליטיים של שיטת תנודות כי כבר דנו היטב בספרות, במיוחד השפעות כושר של מוטציות עמידות31, השהיית השהייה32, תא מוות33, ואת ההתאמה של אלגוריתמים שונים זמינים כדי להעריך שיעורי מוטציה26,34. זה יכול להיות חשוב, למשל, כאשר התלות הסביבתית של אפקטי הכושר יכול להצמיח וריאציה שגויה בהערכת שיעור מוטציה35. עם זאת, אנו מודעים לכך שהכלים האנליטיים שבהם אנו משתמשים כאן יכולים להתמודד עם הווריאציה של כושר המוטציות ומוות התאים. כפי שנדונה בהערות ובדיון, מומלץ גם שסמנים מרובים שאינם צפויים להיות בעלי אותם אפקטי כושר תלויי-סביבה. פרוטוקול זה יאפשר לאנשים לקבוע באופן שגרתי יחסי תלות סביבתיים של שיעורי מוטציה במגוון של זנים וסביבות של חיידקים. מוטציות assaying בסביבות שונות עדיין לא נבדקו ביסודיות וברגע צפיפות האוכלוסייה נחשב, תנודות שאומר יכול לתת אומדן מדויק יותר של שיעור מוטציה10. פרוטוקול זה יאפשר תנודות יותר שאומר להתבצע, כפי שנדרש להבנת המנגנון התחתון שיעורי מוטציה, אשר בתורו חיוני להבנת האבולוציה, קרצינופוגנזה, הזדקנות, והתנגדות מיקרוביאלית.
Protocol
Representative Results
Discussion
כל אומדן של שיעור מוטציה צריך למקסם את הדיוק שהושג כדי להבטיח את החזרה ואת היכולת להיות בתוך ובין מחקרים34. לצורך שיטת תנודות, קיימים שלושה שיקולים קריטיים. השניים הראשונים נקבעו בפרוטוקול שניתן, אך יזדקקו לפתרון בעיות (ראה איור 3) אם הפרוטוקול מותאם לעבודה עם זנים או סביבות שונות. הראשון הוא לבחור. את הטוש המתאים עבור חיידקים, מומלץ להעריך את התעריפים באחד משני מרקר הבית, Rpob או gyra, הענקת עמידות גריסופלובין אנטיביוטיקה וחומצה nalidixic, בהתאמה. גודל היעד עבור מוטציות עמידות לאנטיביוטיקה על שני הבית הזה הוא שונה. יש 79 ו 20 מוטציות ייחודיות הענקת עמידות גריסופלובין37 ו nalidixic חומצה40 בהתאמה. בפועל, משמעות הדבר היא כי בממוצע, גריסופלובין עמידים מוטציות הם נצפו לעתים קרובות יותר. כך, השאלה הראשונה (Q1 באיור 3) שצריך לענות היא אם המתח הוא מוטור. כאשר מוזטים קונסטיטוטיביות נלמדים, היכן צפויים מושבות מוטאנטים רבים, עדיף להשתמש בסמן עם גודל יעד קטן יותר (לדוגמה, nalidixic חומצה). ראה איור 2B, כאשר שיעורי מוטציה של החיידק של המוטציה K-12 BW25113 Δמט הוערך באמצעות nalidixic חומצה כסמן. כאשר עובדים עם זנים חיידקיים שאינם מופשטור שיש להם סוג פראי (כלומר, רגיל) שיעור מוטציה, גריסופלובין היא בחירה טובה יותר (ראה איור 2א). . סימן רלוונטי הוא התנגדות לציקלוסרין עבור סמן זה, מוטציות התנגדות יכול לצוץ יותר מעשרה גנים41, כלומר גודל היעד הוא אפילו גדול יותר עבור גריסופלובין. כאשר לומדים שמרים וארכאונים מומלץ להעריך שיעורי מוטציה ב-25 הריבוזומיום חלבונים ו URA3, הענקת עמידות hygromycin B ו-5-fluoro-orotic חומצה (5-אני), בהתאמה.
השיקול הקריטי השני הוא נפח התרבויות המקבילות. איזה נפח להשתמש תלוי במספר בפועל של מוטציות נצפה. המספר הצפוי של מוטציות נצפו מושפע מגודל היעד של סמן פנוטיפקס נבחר, את היכולת של המתח לתקן ולהימנע מוטציות (שיעור המוטציה הממוצע), ואת קיבולת הנשיאה של הסביבה, אשר מושפע הן על ידי התקשורת המשמשים ואת נפח התרבות. אם אין תרבויות מקבילות המכילות מושבות מוטציות עמידות לגריסופלובין, יש להשתמש בציקלוסרין או להגדיל את מספר התאים המוצופים. ניתן להשיג זאת על-ידי הוספת גלוקוז רב יותר למדיום מינימלי או על-ידי הגדלת תאים בסביבה עשירה יותר (או מלאה). עם זאת, במקרים רבים, כזה גידול בצפיפות האוכלוסייה קשורה לירידה בשיעור מוטציה, וכתוצאה מכך מוגבל, אם בכלל, להגדיל את מספר מושבות מוטנטים שנצפו10. אם הגדלת החומרים המזינים אינה פתרון, ולאחר מכן הגדלת מספר התאים על-ידי הגדלת עוצמת הקול של כל תרבות מקבילה היא אפשרות. כאשר הסביבה כוללת מלחים מינימליים עם סוכר כמקור היחיד של פחמן ואנרגיה (כלומר, התשובה ל-Q2 באיור 3 היא “בינונית מינימלית”), אז יש להשתמש באמצעי האחסון בין 0.5 ל-1.5 mL. אם הסביבה עשירה, אז כמויות של תרבויות מקבילות צריכות להיות בין 0.35-1 mL. השאלה האחרונה נוגעת במספר החציוני של מושבות עמידות. אם מעט מדי מושבות מוטאנטים נצפו (כלומר, התשובה לרבעון שלישי באיור 3 היא 0) ואין לשנות את הסביבה, אזי יש להגדיל את נפח התרבויות המקבילות או את האנטיביוטיקה בעלת גודל יעד גדול יותר (לדוגמה, ציקלוסרין) לשימוש. מצד שני, אם הרבה מושבות מוטציה נצפו על כל הלוחות סלקטיבי (יותר מ ~ 150 לצלחת, ראה איור 3), ואז את מספר התאים מצופה צריך להיות ירידה, אשר בדרך כלל אומר באמצעות נפח נמוך או מעבר לאנטיביוטיקה עם גודל היעד קטן יותר (למשל, nalidixic חומצה).
לאחר בחירת אמצעי האחסון, מומלץ כי כל התרבויות המקבילות על 1 96 לוחית הבאר העמוקה יש אותו נפח. זה מאפשר נחישות מדויקת יותר של נפח בפועל של תרבויות מקבילות ממשקלו של הצלחת. כאשר שיעורי מוטציה של גנוטיפ מסוים מושווים בין סביבות שונות, מוטב שוב להשתמש באותו כמות של תרבויות מקבילות בכל הסביבות. אם nalidixic חומצה משמש להערכת סוג פראי (כלומר, נורמלי) שיעורי מוטציה או כמה מסמן פנוטיפ אחרים משמש כי יש גודל היעד אפילו קטן יותר מאשר חומצה nalidixic, הנפח חייב להיות מוגבר אפילו יותר. אפשרות אחת היא ליצור תרבויות מקבילות בצינורות 50 mL עם כרכים של עד 15 מ”ל. למשל, 10 מ”ל תרבויות מקבילות הוכנו בצינורות 50 mL בעת הערכת E. coli K-12 MG1655 שיעור מוטציה nalidixic חומצה (ראה איור 2א). במקביל 10 התרבויות mL היו מצופים אז על TA בררני אגר ו נשפך לתוך לוחות 150 mm גדול במקום רגיל 90 מ”מ מנות פטרי. החיסרון של הכנת תרבויות מקבילות בצינורות 50 mL היא כי התפוקה היא נמוכה במידה ניכרת לעומת assaying ומר שיעורי מוטציה בצלחת 96 היטב. פתרון אחד הוא להקטין את מספר התרבויות המקבילות. עם זאת, הדבר ישפיע על הדיוק להערכת m, שתלויה במספר האירועים הצפוי ובמספר התרבויות המקבילות26. השגת התפלגות של מוטציות מובחנות עם 14-17 שבתרבויות מקבילות (כפי שנעשה באיור 2), היא איזון טוב בין תפוקה מוצקה לרמת דיוק מקובלת26 של 20%. רמת דיוק חציון של 17.5% דומה לדיוק החציון עם טווח בין-רבעוני של 16.4% (5.7%-38.9%, n = 580) מחושב מתוך ערכת נתונים גדולה הרבה יותר10. לפיכך, מומלץ כי בעת הכנת תרבויות מקבילות 96 לוחות היטב עמוק או 50 mL צינורות התפלגות של מוטציות נצפתה מושגת עם לפחות 14 תרבויות מקבילות. כאשר שיעורי מוטציה מוערכים בסביבות שונות מומלץ לבדוק רמות דיוק על ידי עשיית ניסוי רב לוחית, שבו כל 96 התרבויות המקבילות על צלחת אחת גדלים בסביבה זהה. בנוסף, כאשר הכנת תרבויות מקבילות, זה קריטי כי מחסור מכיל מספר נמוך של תאים, כי זה מפחית את הסיכויים של כל התאים העמידים להיות נוכח האינויות. מוטציות עמידים מראש אינם מבוקשים האינותכן, כי הם יגדלו במספרים וליצור מדשאה על צלחות סלקטיבית והערכה של שיעור המוטציה לא יהיה אפשרי. למשל, ברוב האוכלוסיות הלא מוששות, שיעור המוטציה להתנגדות גריסופלובין הוא בסדר של ~ 10-8. לכן, כדי להימנע מלדבר על התרבות עם מוטציה עמיד מועד, יש לחסן עם פחות מ 108 תאים (למשל, 103על 104 תאים). הצעד הקריטי הסופי הוא להבטיח כי לפני לוחות סלקטיבית אגר מודבטים, את פני השטח על אגר סלקטיבי יבש לחלוטין. אין אפשרות להשתמש בסוגי מבודדים אם משתמשים ב-6-הצלחות והנפח ההתחלתי של תרבות מקבילית הוא 1 mL, לדוגמה. יש להשאיר את הלוחות בתנאים סטריליים כדי לאפשר למשטח הנוזלים להתייבש. הזמן זה לוקח יכול להיות מאוד משתנה, תלוי בתנאי הסביבה ואת מצבם של צלחות. הפעם צריך להיות ממוזער אבל יכול להיות עד כמה שעות.
שיטת התנודות כוללת אילוצים שטבועים. מוטציה רק בקבוצת משנה קטנה של הגנום. הבקשה מחייבת אוכלוסיות גדולות שעוברות מספר מספיק של דורות כדי להתבונן מספיק במוטציות כדי להעריך שיעור בכלל. משמעות הדבר היא כי תנודות ניתן להשתמש רק על אורגניזמים כי הם מסוגלים לעבור מספר רב של דורות במהירות, כמו חיידקים, שמרים של בייקר42, או בתאי מיונקים בעלי תרבות נוזלית30. כמו כן, מוטציות הן אירועים נדירים המתרחשים בנסיבות מסוימות ביוכימיים של תא מסוים. העובדה כי תנודות אומר להסתכל על אוכלוסיות גדולות של תאים לאורך זמן פירושו כי הנסיבות האלה יכולים להיות שונים באופן משמעותי. בעזרת השיטה הזו, קשה ללמוד את ההתקדמות של שיעורי מוטציה של אוכלוסייה מסוימת משלב ההשהיה ועד לשלב האקספוננציאלי המוקדם והמאוחר ולבסוף לשלב נייח. כל הבחנה של שיעורי מוטציה בין תאים בודדים בתוך האוכלוסייה מוסתרים לחלוטין מתוך שיטת התנודות. מוטציה בודדת תא דינמיקה ניתן ללמוד עם מעקב יחיד מולקולה של DNA תיקון חלבון muts43 או על ידי ספירת וקדי של חלבונים שהצטברו muts44. ההתקדמות האחרונה ברצף התפוקה הגבוהה הפכה גם את האפשרות להעריך ישירות שיעורי מוטציה מתוך שלישיות הורים-צאצאים9,45 ו-מרובה מהדור שלמ46. פיתוחים מתודולוגיים כאלה מתחילים להתיר ספירה ישירה של מוטציות המתרחשות בתוך דור אחד. עם זאת, גישה ישירה זו זקוקה לטכנולוגיות יקרות וחדשניות כמו מיקרוסקופ פלואורסצנטית, microfluidics או רצף שלמות של הגנום. מצד שני, שיטת התנודות זולה יחסית, ויש צורך בציוד מעבדה סטנדרטי בלבד. לעשות תנודות יותר מספר יהיה גם להקל על הדור של השערות הרומן כי ניתן לבדוק עם ישיר יותר הגישות תא יחיד.
יש עניין ממושך בחקר מוטציות, ולכן שיטת התנודות עשויה להישאר בשימוש נרחב. מספר הציטוטים של הנייר הזרע על ידי לוריא ודלבריק5 ב -4 השנים האחרונות (2015-2018) כולם היו בין חמשת הראשונים לציטוטים של נייר זה. עם זאת, בשל כמות גדולה של עבודה ידנית מדויקת לצורך ביצוע שיטת תנודות, רוב המחקרים רק מנהלים קומץ תנודות. זה, עם זאת, אינו מספיק כדי לחשוף את יחסי הסביבה של שיעור המוטציה. על-ידי ייעול תנודות באמצעות לוחות multiwell יטב, כפי שהוסבר בנייר זה, התפוקה המקסימלית הנוכחית אפשרית היא 11 צלחות הבאר העמוק (55 תנודות מספר) במקביל, כפי שמתואר כאן. הפעלת שני סטים של תנודות מספר התנדנד על ידי יום במקביל, מאפשר ביצוע של עד 110 בחני בשבוע. שינוי צעד נוסף בתפוקה יכול להיות עדיין אפשרי על-ידי אוטומציה של צעדים שונים של התנודות שאומרות מהפרוטוקול הידני הנתון. כמו כן, עבור לימוד יחסי הסביבה של שיעור המוטציה, צפיפות האוכלוסייה צריכה להילקח בחשבון. התוצאות הקודמות10 מראים כי כאשר הגורמים המוכרים המשפיעים על שיעור מוטציה מתומחרים, שליטה על צפיפות האוכלוסייה יכול להפחית את הווריאציה בהערכת קצב מוטציה על ידי יותר מ 90%. כדי לשלוט בדחיסות, אנו ממליצים ש-Nt (המשמש להערכת שיעור מוטציה) ייקבע באופן עצמאי מהשיטה המשמשת לקביעת צפיפות האוכלוסיה. בחיידקים, Nt יכול להיקבע על ידי cfu וצפיפות, למשל, עם מסמך מבוסס ATP10.
תפוקה גבוהה וצפיפות השליטה הן חיוניות כאשר לומדים כיצד הקשר האקולוגי של האורגניזם משפיע על קצב מוטציה ספונטני. לדעת את קיומו של הפלסטיות שיעור מוטציה חשוב, אבל הבנת הסיבות וההשפעות שלה הם אתגרים מרכזיים כי צריך לפגוש אם הפלסטיות שיעור המוטציה היא להיות משולב לתוך הקשר ביולוגי רחב יותר. שיטת התנודות היא כלי מצוין שניתן להשתמש בו כדי לבחון השערות רבות, משום שהתוצאות מתקבלות במהירות, והמחיר זול יחסית לשיטות אחרות. הבמה מוגדר, למשל, כדי ללמוד יחסי הסביבה של שיעור המוטציה בקהילות חיידקיים ו microbiomes. התאמת שיטת התנודות כדי cocultures יכול לבדוק את ההשערה כי זנים להשפיע על שיעורי המוטציה של השני באמצעות מולקולות קטנות. עושה אלפי תנודות שאומר עם התרבויות יכול לקבוע אם זנים משתנים הן ביכולתם לשנות את שיעורי המוטציה של השני ברגישות שלהם יש שיעור המוטציה שלהם שונה על ידי אחרים. אולי וריאציה בין זנים ברגישות לטיפול בקצב מוטציה הוא ייחס וריאציה גנטית ספציפית. זה עשוי להפוך את הדעות שלנו על איך האבולוציה עובד בקהילות מורכבות, לא פחות בדוגמאות של חשיבות רחבה כגון כיצד התנגדות מיקרוביאלית עולה.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הוא נתמך על ידי BB/M020975/1 ו אוניברסיטת מנצ בבית הספר למדעים ביולוגיים. משאבי אנוש נתמכים על ידי BB/J014478/1. ג ‘ ו היה נתמך על ידי הכשרה לדוקטורט BBSRC BB/M011208/1. DRG נתמך על ידי מספר הפרס של UKRI MR/R024936/1.
Materials
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Starlab International GmbH | S1615-5550 | |
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | Sigma-Aldrich | T8877-10g | |
| 6-well plates | Greiner Bio-One | REF 657102 | |
| 90mm Petri Dishes Triple Vented | ThermoFisher Scientific | REF 120189 | |
| 96 deep-well plate (Masterblock 2 ml) | Greiner Bio-One | REF 780270 | |
| Ammonium sulfate | Fisher Chemical | A/6440/53 | |
| Bacto Agar | Becton, Dickinson and Company | REF 214010 | |
| Bacto yeast extract | Becton, Dickinson and Company | REF 212750 | |
| Cycloserine | Sigma-Aldrich | 1158005-250MG | Only for assaying an alternative phenotypic marker |
| D-Glucose anhydrous | Fisher Chemical | G/0500/61 | |
| 50 ml Centrifuge Tube | Corning | REF 430828 | |
| L-(+)-Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256-500g | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Chemical | M/1050/53 | |
| Nalidixic acid | Sigma-Aldrich | N8878-5G | Only for assaying an alternative phenotypic marker |
| Potassium phosphate dibasic trihydrate | Sigma-Aldrich | P5504-500g | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662-500g | |
| Rifampicin | EMD Millipore Corp, USA | 557303-1GM | |
| Sodium chloride | Fisher Chemical | S/3160/60 | |
| Spectophotometer | Jenway | 6320D | |
| Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T4625-25g | |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | S1804-500g | |
| Tryptone | Fisher Chemical | 1278-7099 |
References
- de Vries, H. Die mutationstheorie. Versuche und beobachtungen über die entstehung von arten im pflanzenreich. 1, (1901).
- Muller, H. J. Artificial transmutation of the gene. Science. 66 (1699), (1927).
- Muller, H. J. The measurement of gene mutation rate in Drosophila, its high variability, and its dependence upon temperature. Genetics. 13 (4), 279-357 (1928).
- Sturtevant, A. H. Essays on evolution. I. On the effects of selection on mutation rate. The Quarterly Review of Biology. 12 (4), 464-467 (1937).
- Luria, S. E., Delbrück, M. Mutations of bacteria from virus sensitivity to virus resistance. Genetics. 28 (6), 491-511 (1943).
- Jee, J., et al. Rates and mechanisms of bacterial mutagenesis from maximum-depth sequencing. Nature. 534 (7609), 693-696 (2016).
- Fusco, D., Gralka, M., Kayser, J., Anderson, A., Hallatschek, O. Excess of mutational jackpot events in expanding populations revealed by spatial Luria-Delbrück experiments. Nature Communications. 7, (2016).
- Halligan, D. L., Keightley, P. D. Spontaneous mutation accumulation studies in evolutionary genetics. Annual Review of Ecology Evolution and Systematics. 40 (1), 151-172 (2009).
- Jónsson, H., et al. Parental influence on human germline de novo mutations in 1,548 trios from Iceland. Nature. 549, (2017).
- Krašovec, R., et al. Spontaneous mutation rate is a plastic trait associated with population density across domains of life. PLoS Biology. 15 (8), (2017).
- Krašovec, R., et al. Mutation rate plasticity in rifampicin resistance depends on Escherichia coli cell-cell interactions. Nature Communications. 5, 3742 (2014).
- Massey, R. C., Buckling, A. Environmental regulation of mutation rates at specific sites. Trends in Microbiology. 10 (12), 580-584 (2002).
- Lynch, M., et al. Genetic drift, selection and the evolution of the mutation rate. Nature Review Genetics. 17 (11), 704-714 (2016).
- Foster, P. L. Stress-induced mutagenesis in bacteria. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 42 (5), 373-397 (2007).
- Krašovec, R., et al. Where antibiotic resistance mutations meet quorum-sensing. Microbial Cell. 1 (7), 250-252 (2014).
- Krašovec, R., et al. Opposing effects of final population density and stress on Escherichia coli mutation rate. The ISME Journal-Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 12, 2981-2987 (2018).
- Lea, D., Coulson, C. The distribution of the numbers of mutants in bacterial populations. Journal of Genetics. 49 (3), 264-285 (1949).
- Armitage, P. The statistical theory of bacterial populations subject to mutation. Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological. 14 (1), 1-40 (1952).
- Koch, A. L. Mutation and growth rates from Luria-Delbrück fluctuation tests). Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 95 (2-3), 129-143 (1982).
- Cairns, J., Overbaugh, J., Miller, S. The origin of mutants. Nature. 335 (6186), 142-145 (1988).
- Stewart, F. M., Gordon, D. M., Levin, B. R. Fluctuation analysis: the probability distribution of the number of mutants under different conditions. Genetics. 124 (1), 175-185 (1990).
- Drake, J. W. A constant rate of spontaneous mutation in DNA-based microbes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (16), 7160-7164 (1991).
- Ma, W. T., Sandri, G. V., Sarkar, S. Analysis of the Luria-Delbrück distribution using discrete convolution powers. Journal of Applied Probability. 29 (2), 255-267 (1992).
- Shapiro, J. A. Adaptive mutation – Who’s really in the garden. Science. 268 (5209), 373-374 (1995).
- Matic, I., et al. Highly variable mutation rates in commensal and pathogenic Escherichia coli. Science. 277 (5333), 1833-1834 (1997).
- Rosche, W. A., Foster, P. L. Determining mutation rates in bacterial populations. Methods. 20 (1), 4-17 (2000).
- Rosenberg, S. M. Evolving responsively: Adaptive mutation. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 504-515 (2001).
- Lynch, M. Evolution of the mutation rate. Trends in Genetics. 26 (8), 345-352 (2010).
- Zheng, Q. A new practical guide to the Luria-Delbrück protocol. Mutation Research. 781, 7-13 (2015).
- Boesen, J. J. B., Niericker, M. J., Dieteren, N., Simons, J. How variable is a spontaneous mutation-rate in cultured-mammalian-cells. Mutation Research. 307 (1), 121-129 (1994).
- Melnyk, A. H., Wong, A., Kassen, R. The fitness costs of antibiotic resistance mutations. Evolutionary Applications. 8 (3), 273-283 (2015).
- Sun, L., et al. Effective polyploidy causes phenotypic delay and influences bacterial evolvability. PLoS Biology. 16 (2), (2018).
- Frenoy, A., Bonhoeffer, S. Death and population dynamics affect mutation rate estimates and evolvability under stress in bacteria. PLoS Biology. 16 (5), (2018).
- Foster, P. L. Methods for determining spontaneous mutation rates. Methods in Enzymology. , 195-213 (2006).
- Wrande, M., Roth, J. R., Hughes, D. Accumulation of mutants in "aging" bacterial colonies is due to growth under selection, not stress-induced mutagenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (33), 11863-11868 (2008).
- Adrien, M., Rémy, D., Stéphane, D., Bernard, Y. flan: An R package for inference on mutation models. The R Journal. 9. 334, (2017).
- Garibyan, L., et al. Use of the rpoB gene to determine the specificity of base substitution mutations on the Escherichia coli chromosome. DNA Repair. 2 (5), 593-608 (2003).
- Stewart, F. M. Fluctuation tests: how reliable are the estimates of mutation rates?. Genetics. 137 (4), 1139-1146 (1994).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Molecular Systems Biology. 2 (1), (2006).
- Yamagishi, J. -. I., Yoshida, H., Yamayoshi, M., Nakamura, S. Nalidixic acid-resistant mutations of the gyrB gene of Escherichia coli. Molecular and General Genetics MGG. 204 (3), 367-373 (1986).
- Chen, J., et al. Identification of novel mutations associated with cycloserine resistance in Mycobacterium tuberculosis. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 72 (12), 3272-3276 (2017).
- Lang, G. I., Murray, A. W. Estimating the per-base-pair mutation rate in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 178 (1), 67-82 (2008).
- Uphoff, S., et al. Stochastic activation of a DNA damage response causes cell-to-cell mutation rate variation. Science. 351 (6277), 1094-1097 (2016).
- Robert, L., et al. Mutation dynamics and fitness effects followed in single cells. Science. 359 (6381), 1283-1286 (2018).
- Kong, A., et al. Rate of de novo mutations and the importance of father/’s age to disease risk. Nature. 488 (7412), 471-475 (2012).
- Narasimhan, V. M., et al. Estimating the human mutation rate from autozygous segments reveals population differences in human mutational processes. Nature Communications. 8 (1), 303 (2017).
