Produção, cristalização e determinação da estrutura do domínio ikk-obrigatório da NEMO
Summary
Descrevemos protocolos para a determinação da estrutura do domínio ikk-obrigatório da NEMO por cristalografia de raios-X. Os métodos incluem expressão de proteína, purificação e caracterização, bem como estratégias para otimização de cristal bem-sucedida e determinação da estrutura da proteína em sua forma desvinculada.
Abstract
Nemo é uma proteína de andaimes que desempenha um papel essencial na via NF-κB através da montagem do complexo IKK com as kinases IKKα e IKKβ. Após a ativação, o complexo ikk fosforiatos as moléculas IκB levando a NF-κB translocação nuclear e ativação de genes-alvo. A inibição da interação NEMO/IKK é um paradigma terapêutico atraente para a modulação da atividade da via NF-κB, tornando a NEMO um alvo para o design e descoberta de inibidores. Para facilitar o processo de descoberta e otimização de inibidores nemo, projetamos uma construção melhorada do domínio ikk-binding da NEMO que permitiria a determinação da estrutura da proteína na forma de apo e, embora vinculado a pequenos inibidores de peso molecular. Aqui, apresentamos a estratégia utilizada para a concepção, expressão e caracterização estrutural do domínio ikk-binding da NEMO. A proteína é expressa em células De. coli, solubilizada em condições de desnajantes e purificada através de três etapas cromatográficas. Discutimos os protocolos de obtenção de cristais para determinação da estrutura e descrevemos estratégias de aquisição e análise de dados. Os protocolos encontrarão ampla aplicabilidade à determinação da estrutura de complexos de NEMO e inibidores de pequenas moléculas.
Introduction
A via NF-κB é ativada em resposta a uma variedade de estímulos, incluindo citocinas, produtos microbianos e estresse, para regular a expressão de genes-alvo responsáveis pela resposta inflamatória e imune, morte celular ou sobrevivência e proliferação1. Patologias, incluindo doenças inflamatórias e autoimunes e câncer2,3,4,5 foramcorrelacionadas à hiperativação da via, o que tornou a modulação da atividade NF-κB um alvo principal para o desenvolvimento de novas terapias6,7.
A via canônica NF-κB, em particular, distingue-se da via não canônica, responsável pela linfogenênese e ativação de células B, pela dependência do primeiro da proteína de andaimes NEMO (modulador essencial NF-κB8)para a montagem do complexo IKK com as quinases IKKα e IKKβ. O complexo do IKK é responsável pela fosforilação de IκBα (inibidor da κB) que o visa para degradação, liberando os dimers NF-κB para translocar para o núcleo para transcrição gênica1 e, portanto, é um alvo atraente para o desenvolvimento de inibidores para modular a atividade NF-κB.
Nossa pesquisa se concentra na caracterização da interação proteína-proteína entre NEMO e IKKβ, visando NEMO para o desenvolvimento de inibidores de pequenas moléculas da formação complexa do IKK. O domínio de ligação mínimo do NEMO, necessário para ligar IKKβ, abrange resíduos 44-111, e sua estrutura foi determinada em complexo com um peptídeo correspondente à seqüência IKKβ 701-7459. NEMO e IKKβ formam um pacote de quatro hélices onde o dimer NEMO acomoda os dois helices de IKKβ (701-745) em um sulco aberto alongado com uma interface de interação estendida. IKKβ (734-742), também conhecido como domínio nemo-obrigatório (NBD), define o ponto quente mais importante para a ligação, onde os dois triptofanos essenciais (739.741) enterrar profundamente dentro do bolso NEMO. Os detalhes da estrutura complexa podem auxiliar no projeto e otimização baseados na estrutura de inibidores de pequenas moléculas visando nemo. Ao mesmo tempo, é difícil que a ligação de uma pequena molécula ou peptídeo recriaria em NEMO a mudança conformal completa (ou seja, a abertura extensiva do dimer de bobina enrolada nemo) causada pela ligação do longo IKKβ (701-745), como observado no cristal, e a estrutura de NEMO ou NEMO desvinculado saqueada pode representar um alvo melhor para o projeto e inibição de drogas baseados em estrutura.
Nemo de comprimento total e construções de truncação menores que abrangem o domínio ikk-binding provaram intratável para a determinação da estrutura na forma desvinculada através de cristalografia de raios-X e ressonância magnética nuclear (RMN) métodos10, o que nos levou a projetar uma versão melhorada do domínio ikk-binding de NEMO. De fato, nemo (44-111) na forma desvinculada é apenas parcialmente dobrado e sofre troca conformaçãol e, portanto, definido para estabilizar a sua estrutura dimérica, bobina enrolada e estabilidade, preservando a afinidade vinculativa para IKKβ. Ao anexar três heptads de sequências de bobina enroladas dimeric e11 ideais no N-and C-termini da proteína, e uma série de mutações de quatro pontos, geramos NEMO-EEAA, uma construção totalmente fraca e dobrada em uma bobina enrolada, que resgatou aafinidade de ligação iKK à faixa de namolanor, como observado para nemo12de comprimento completo . Como vantagem adicional, esperávamos que os adaptadores de bobina enroladas (com base na sequência GCN4) facilitassem a cristalização e, eventualmente, ajudassem na determinação da estrutura de raios-X através da substituição molecular. Adaptadores de bobina enrolada têm sido utilizados da mesma forma para aumentar a estabilidade, melhorar o comportamento da solução e facilitar a cristalização de bobinas enroladas e fragmentos de anticorpos13,14. Nemo-EEAA é facilmente expresso e purificado a partir de células Escherichia. coli com uma tag Histidine cleavable, é solúvel, dobrado em uma bobina enrolada dimérica e estável e é facilmente cristalizada, com difração de 1,9 Å. A presença das regiões ordenadas de bobina enrolada de GCN4 poderia, adicionalmente, ajudar na eliminação dos dados dos cristais da NEMO-EEAA por substituição molecular usando a estrutura conhecida do GCN415.
Dado os resultados obtidos com apo-NEMO-EEAA, acreditamos que os protocolos aqui descritos também podem ser aplicados à cristalização da NEMO-EEAA na presença de pequenos peptídeos (como o peptídeo NBD) ou inibidores de pequenas moléculas, com o objetivo de compreender os requisitos para a inibição nemo e otimização baseada em estrutura de inibidores de chumbo iniciais para alta afinidade. Dada a plasticidade e a natureza dinâmica de muitos domínios de bobina enrolada16,o uso dos adaptadores de bobina enrolada poderia encontrar aplicabilidade mais geral para ajudar a determinação estrutural.
Protocol
Representative Results
Discussion
As tentativas de cristalização do NEMO na forma desvinculada não tiveram sucesso, incluindo tentativas de utilização da proteína de corpo inteiro e várias construções de truncation que abrangem o domínio de ligação ao IKK. Nossa caracterização biofísica do domínio ikk-obrigatório de NEMO (resíduos 44-111) por dicroismo circular, espectroscopia NMR e anisotropia de fluorescência indicou que a construção, embora capaz de ligar IKKβ, existia em um estado de troca conformaçãoal, não é adequado para …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Prof. D. Madden por muitas discussões úteis ao longo deste projeto. Agradecemos ao Prof. D. Bolon pelo dom do plasmídeo contendo a bobina enrolada GCN4 otimizada. Agradecemos ao Dr. B. Guo por plasmids NEMO. Agradecemos christina R. Arnoldy, Tamar Basiashvili e Amy E. Kennedy para demonstrar o procedimento. Agradecemos ao BioMT Crystallography Core Facility e aos departamentos de Química e Biologia Celular em Dartmouth pelo uso do equipamento de cristalografia e do pessoal da BioMT por seu apoio. Esta pesquisa usou a linha de luz AMX do National Synchrotron Light Source II, um Departamento de Energia dos EUA (DOE) Office of Science User Facility operado para o Escritório de Ciência do DOE pelo Laboratório Nacional de Brookhaven o Contrato Nº. DE-SC0012704. Agradecemos ao pessoal da NSLS II pelo seu apoio. Este trabalho foi financiado pelo NIH concede R03AR066130, R01GM133844, R35GM128663 e P20GM113132, e uma subvenção Munck-Pfefferkorn Novel and Interactive.
Materials
| 20% w/v γ-PGA (Na+ form, LM) | Molecular Dimensions | MD2-100-150 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| 3.5 kDa MWCO Dialysis Membrane | Spectra/Por | 132724 | For dialysis removal of imidazole |
| Amicon Stirred Cell | Millipose Sigma | UFSC 05001 | For protein concentration |
| Ammonium Chloride | Millipore Sigma | G8270 | For minimal media labeling |
| Benzonase Nuclease | Millipore Sigma | 9025-65-4 | For digestion of nucleic acid |
| BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Competent Cells | Agilent Technologies | Model: 230245 | TEV expression |
| CryoPro | Hampton Research | HR2-073 | Cryo-protectants kit |
| D-Glucose (Dextrose) | Millipore Sigma | A9434 | For minimal media labeling |
| Difco Terrific Broth | ThermoFisher | DF043817 | For culture growth |
| Dithiothreitol > 99% | Goldbio | DTT25 | For reduction of disulfides |
| E. coli: Rosetta 2 (DE3) | Novagen | 71400-3 | Expression of unlabeled NEMO-EEAA |
| FORMULATOR | Formulatrix | Liquid handler/ screen builder | |
| HCl – 1.0 M Solution | Hampton Research | HR2-581 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| HiLoad 16/600 Superdex 75 pg | GE Healthcare | 28989333 | For size exclusion purification |
| HisTrap HP 5 mL column | GE Healthcare | 17524802 | For purification of His-tagged NEMO-EEAA |
| HT 96 MIDAS | Molecular Dimensions | MD1-59 | For sparse matrix screening of NEMO-EEAA |
| HT 96 Morpheous | Molecular Dimensions | MD1-46 | For sparse matrix screening of NEMO-EEAA |
| Imidazole | ThermoFisher | 288-32-4 | For elution from His-trap column |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactoside | Goldbio | I2481C5 | For induction of cultures |
| MRC2 crystallization plate | Hampton Research | HR3-083 | Crystallization plate |
| NT8 – Drop Setter | Formulatrix | Crystallization | |
| pET-16b | Millipore Sigma | 69662 | For cloning of NEMO-EEAA |
| pET-45b | Millipore Sigma | 71327 | For cloning of NEMO-EEAA |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | ThermoFisher | 36978 | For inhibition of proteases |
| Polycarbonate Bottle for use in Ultracentrifuge Rotor Type 45 Ti | Beckmann Coulter | 339160 | Ultracentrifuge bottle |
| Polyethylene Glycol 20,000 | Hampton Research | HR2-609 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| pRK793 (TEV) | Addgene | Plasmid 8827 | For TEV production |
| QuikChange XL II | Agilent Technologies | 200522 | Site directed mutagenesis |
| Required Cap Assembly: | Beckmann Coulter | 355623 | Ultracenttrifuge bottle cap |
| ROCK IMAGER | Formulatrix | Crystallization Imager | |
| Seed Bead Kit | Hampton Research | HR2-320 | Seed generation |
| Sodium Chloride ≥ 99% | Millipore Sigma | S9888 | For buffering of purification solutions |
| TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphine Hydrochloride) | Goldbio | TCEP1 | Reducing agent |
| The Berkeley Screen | Rigaku | MD15-Berekely | For sparse matrix screening of NEMO-EEAA |
| The PGA Screen | Molecular Dimensions | MD1-50 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| Tris – 1.0 M Solution | Hampton Research | HR2-589 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| Ultrapure Tris Buffer (powder format) | Thermofisher | 15504020 | For buffering of purification solutions |
| Urea | ThermoFisher | 29700 | For denaturation of NEMO-EEAA |
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