Productie, kristallisatie en structuurbepaling van het IKK-bindende domein van NEMO
Summary
We beschrijven protocollen voor de structuurbepaling van het IKK-bindende domein van NEMO door Röntgen kristallografie. De methoden omvatten eiwit expressie, zuivering en karakterisering, evenals strategieën voor succesvolle kristal optimalisatie en structuurbepaling van het eiwit in zijn ongebonden vorm.
Abstract
NEMO is een steiger eiwit dat een essentiële rol speelt in het NF-κB-traject door het IKK-complex samen te stellen met de kinases IKKα en IKKβ. Na activering fosforyleert het IKK-complex de IκB-moleculen die leiden tot de nucleaire translocatie van NF-κB en de activering van doel genen. Remming van de NEMO/IKK-interactie is een aantrekkelijk therapeutisch paradigma voor de modulatie van de NF-κB-pathway activiteit, waardoor NEMO een doelwit is voorontwerp en ontdekking van remmers. Om het proces van ontdekking en optimalisatie van NEMO-remmers te faciliteren, hebben we een verbeterde constructie van het IKK-bindende domein van NEMO ontworpen dat de structuurbepaling van het eiwit in de APO-vorm mogelijk maakt en terwijl het gebonden is aan kleine moleculair gewichts remmers. Hier presenteren we de strategie die wordt gebruikt voor het ontwerp, de expressie en de structurele karakterisering van het IKK-bindende domein van NEMO. Het eiwit wordt uitgedrukt in E. coli cellen, ontbindend onder denatureringcondities en gezuiverd door middel van drie chromatografische stappen. We bespreken de protocollen voor het verkrijgen van kristallen voor de bepaling van de structuur en beschrijven gegevens acquisitie en analyse strategieën. De protocollen zullen brede toepasbaarheid vinden voor de structuurbepaling van complexen van NEMO en kleine molecuul remmers.
Introduction
Het NF-κB-traject wordt geactiveerd als reactie op een verscheidenheid aan stimuli, waaronder cytokines, microbiële producten en stress, om de expressie van doel genen te reguleren die verantwoordelijk zijn voor inflammatoire en immuunrespons, celdood of overleving en proliferatie1. Pathologieën zoals inflammatoire en auto-immuunziekten en kanker2,3,4,5 zijn gecorreleerd aan hyperactivatie van het traject, die modulatie van NF-κb-activiteit heeft gemaakt tot een primair doelwit voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën6,7.
Met name het canonieke NF-κB-traject onderscheidt zich van het niet-canonieke traject, verantwoordelijk voor lymvengenese en B-cel activatie, door de afhankelijkheid van de voormalige steiger proteïne NEMO (NF-κB Essential modulator8) voor de assemblage van het IKK-complex met de kinases IKKα en IKKβ. Het IKK-complex is verantwoordelijk voor de fosforylering van iκbα (remmer van κb) die het voor afbraak richt, waardoor de NF-κb-Dimeren worden vrijgemaakt om te translokaliseren naar de Nucleus voor gentranscriptie1 en daarom een aantrekkelijk doelwit is voor de ontwikkeling van remmers om NF-κb-activiteit te moduleren.
Ons onderzoek richt zich op de karakterisering van de eiwit-eiwit interactie tussen NEMO en IKKβ, gericht op NEMO voor de ontwikkeling van kleine moleculen remmers van IKK complexe formatie. Het minimale bindende domein van NEMO, dat nodig is om IKKβ te binden, omvat residuen 44-111 en de structuur ervan is bepaald in complex met een peptide overeenkomend met IKKβ-sequentie 701-7459. NEMO en IKKβ vormen een vierhelix bundel waarbij de NEMO dimeer de twee helices van IKKβ (701-745) in een langwerpige open groef met een uitgebreide interactie-interface herbergt. IKKβ (734-742), ook bekend als het NEMO-bindende domein (NBD), definieert de belangrijkste hotspot voor binding, waarbij de twee essentiële tryptophans (739.741) diep begraven in de NEMO Pocket. De details van de complexe structuur kunnen helpen bij het ontwerp op basis van structuur en optimalisatie van kleine molecuul remmers gericht op NEMO. Tegelijkertijd is het moeilijk dat de binding van een kleine molecule of peptide in NEMO de volledige conformationele verandering zou herscheppen (d.w.z. uitgebreide opening van de NEMO spiraalvormige Coil dimer) veroorzaakt door binding van de lange IKKβ (701-745), zoals waargenomen in het kristal, en de structuur van ongebonden NEMO of NEMO gebonden aan een kleine molecuul remmer kan een beter doelwit voor structuur gebaseerde drug design en remmer optimalisatie vertegenwoordigen.
Volledige lengte Nemo en kleinere afkapping constructies die het IKK-bindende domein omvatten, hebben bewezen hardnekkige structuurbepaling in de ongebonden vorm via Röntgen kristallografie en nucleaire magnetische resonantie (NMR) methoden10, die ons ertoe aangezet om een verbeterde versie van het IKK-bindende domein van Nemo te ontwerpen. Inderdaad, NEMO (44-111) in de ongebonden vorm is slechts gedeeltelijk gevouwen en ondergaat conformationale uitwisseling en daarom zetten we ons in om zijn dimere structuur, spiraalvormige spiraal en stabiliteit te stabiliseren, terwijl de binding affiniteit voor IKKβ behouden blijft. Door het toevoegen van drie heptads van ideale dimeer spiraalvormige-Coil sequenties11 op de N-en C-Termini van het eiwit, en een reeks van vier puntmutaties, we genereerden Nemo-eeaa, een construct volledig dimeer en gevouwen in een spiraalvormige spoel, die IKK-bindende affiniteit voor de nanomolair bereik gered zoals waargenomen voor de volledige lengte Nemo12. Als bijkomend voordeel hoopten we dat de spiraalvormige spoel adapters (gebaseerd op de GCN4 sequentie) kristallisatie zouden vergemakkelijken en uiteindelijk hulp zouden kunnen verlenen bij de bepaling van de X-Ray structuur via moleculaire vervanging. Spiraalvormige spoel adapters zijn op dezelfde manier gebruikt om zowel de stabiliteit te verhogen, het gedrag van de oplossing te verbeteren en kristallisatie te vergemakkelijken voor trimere spiraalvormige spoelen en antilichaam fragmenten13,14. Nemo-eeaa wordt gemakkelijk uitgedrukt en gezuiverd uit Escherichia. coli cellen met een splijtbaar histidine tag, is oplosbaar, gevouwen in een stabiele dimeer spiraalvormige spoel en is gemakkelijk gekristalliseerd, met diffractie tot 1,9 Å. De aanwezigheid van de bestelde spiraalvormige spoel gebieden van GCN4 kan bovendien helpen bij het faseren van de gegevens van kristallen van NEMO-EEAA door moleculaire vervanging met behulp van de bekende structuur van GCN415.
Gezien de resultaten die zijn verkregen met APO-NEMO-EEAA, zijn wij van mening dat de hier beschreven protocollen ook kunnen worden toegepast op de kristallisatie van NEMO-EEAA in de aanwezigheid van kleine peptiden (zoals het NBD-peptide) of kleine molecuul remmers, met als doel de vereisten voor NEMO-remming en op structuur gebaseerde optimalisatie van initiële lood remmers te begrijpen. Gezien de plasticiteit en dynamische aard van veel spiraalvormige spoel domeinen16, het gebruik van de spiraalvormige-Coil adapters kan vinden meer algemene toepasselijkheid in medeplichtigheid van structurele bepaling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kristallisatie pogingen van Nemo in de ongebonden vorm waren mislukt, inclusief pogingen met behulp van het volledige eiwit en verschillende afkapping constructies die het IKK-bindende domein omvatten. Onze biofysische karakterisering van het IKK-bindende domein van Nemo (residuen 44-111) door Circulair dichroisme, NMR-spectroscopie en fluorescentie anisotropie gaf aan dat de constructie, zij het in staat om ikkβ te binden, bestond in een toestand van conformationele Exchange, niet geschikt voor kristallisatie<sup class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Prof. D. Madden voor veel nuttige discussies tijdens dit project. We danken Prof. D. Bolon voor de gave van het plasmide met de geoptimaliseerde GCN4 spiraalvormige spoel. We danken Dr. B. Guo voor NEMO plasmids. We danken Christina R. Arnoldy, Tamar Basiashvili en Amy E. Kennedy voor het aantonen van de procedure. We danken de kern faciliteit voor BioMT kristallografie en de afdelingen chemie en Biochemie & celbiologie bij Dartmouth voor het gebruik van de kristallografie apparatuur en het BioMT-personeel voor hun ondersteuning. Dit onderzoek gebruikte de AMX beamline van de National Synchrotron Light Source II, een Amerikaanse afdeling van energie (DOE) Office of Science User Facility voor het DOE Office of Science door Brookhaven National Laboratory onder contract nr. DE-SC0012704. We danken het personeel van NSLS II voor hun steun. Dit werk werd gefinancierd door NIH grants R03AR066130, R01GM133844, R35GM128663 en P20GM113132, en een Munck-Pfefferkorn roman en interactieve subsidie.
Materials
| 20% w/v γ-PGA (Na+ form, LM) | Molecular Dimensions | MD2-100-150 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| 3.5 kDa MWCO Dialysis Membrane | Spectra/Por | 132724 | For dialysis removal of imidazole |
| Amicon Stirred Cell | Millipose Sigma | UFSC 05001 | For protein concentration |
| Ammonium Chloride | Millipore Sigma | G8270 | For minimal media labeling |
| Benzonase Nuclease | Millipore Sigma | 9025-65-4 | For digestion of nucleic acid |
| BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Competent Cells | Agilent Technologies | Model: 230245 | TEV expression |
| CryoPro | Hampton Research | HR2-073 | Cryo-protectants kit |
| D-Glucose (Dextrose) | Millipore Sigma | A9434 | For minimal media labeling |
| Difco Terrific Broth | ThermoFisher | DF043817 | For culture growth |
| Dithiothreitol > 99% | Goldbio | DTT25 | For reduction of disulfides |
| E. coli: Rosetta 2 (DE3) | Novagen | 71400-3 | Expression of unlabeled NEMO-EEAA |
| FORMULATOR | Formulatrix | Liquid handler/ screen builder | |
| HCl – 1.0 M Solution | Hampton Research | HR2-581 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| HiLoad 16/600 Superdex 75 pg | GE Healthcare | 28989333 | For size exclusion purification |
| HisTrap HP 5 mL column | GE Healthcare | 17524802 | For purification of His-tagged NEMO-EEAA |
| HT 96 MIDAS | Molecular Dimensions | MD1-59 | For sparse matrix screening of NEMO-EEAA |
| HT 96 Morpheous | Molecular Dimensions | MD1-46 | For sparse matrix screening of NEMO-EEAA |
| Imidazole | ThermoFisher | 288-32-4 | For elution from His-trap column |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactoside | Goldbio | I2481C5 | For induction of cultures |
| MRC2 crystallization plate | Hampton Research | HR3-083 | Crystallization plate |
| NT8 – Drop Setter | Formulatrix | Crystallization | |
| pET-16b | Millipore Sigma | 69662 | For cloning of NEMO-EEAA |
| pET-45b | Millipore Sigma | 71327 | For cloning of NEMO-EEAA |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | ThermoFisher | 36978 | For inhibition of proteases |
| Polycarbonate Bottle for use in Ultracentrifuge Rotor Type 45 Ti | Beckmann Coulter | 339160 | Ultracentrifuge bottle |
| Polyethylene Glycol 20,000 | Hampton Research | HR2-609 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| pRK793 (TEV) | Addgene | Plasmid 8827 | For TEV production |
| QuikChange XL II | Agilent Technologies | 200522 | Site directed mutagenesis |
| Required Cap Assembly: | Beckmann Coulter | 355623 | Ultracenttrifuge bottle cap |
| ROCK IMAGER | Formulatrix | Crystallization Imager | |
| Seed Bead Kit | Hampton Research | HR2-320 | Seed generation |
| Sodium Chloride ≥ 99% | Millipore Sigma | S9888 | For buffering of purification solutions |
| TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphine Hydrochloride) | Goldbio | TCEP1 | Reducing agent |
| The Berkeley Screen | Rigaku | MD15-Berekely | For sparse matrix screening of NEMO-EEAA |
| The PGA Screen | Molecular Dimensions | MD1-50 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| Tris – 1.0 M Solution | Hampton Research | HR2-589 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| Ultrapure Tris Buffer (powder format) | Thermofisher | 15504020 | For buffering of purification solutions |
| Urea | ThermoFisher | 29700 | For denaturation of NEMO-EEAA |
References
- Gilmore, T. D. Introduction to NF-kappaB: players, pathways, perspectives. Oncogene. 25 (51), 6680-6684 (2006).
- Bassères, D. S., Baldwin, A. S. Nuclear factor-kappaB and inhibitor of kappaB kinase pathways in oncogenic initiation and progression. Oncogene. 25 (51), 6817-6830 (2006).
- Hayden, M. S., West, A. P., Ghosh, S. NF-kappaB and the immune response. Oncogene. 25 (51), 6758-6780 (2006).
- Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional regulation and its misregulation in disease. Cell. 152 (6), 1237-1251 (2013).
- Courtois, G., Gilmore, T. D. Mutations in the NF-kappaB signaling pathway: implications for human disease. Oncogene. 25 (51), 6831-6843 (2006).
- Zhao, J., et al. Development of novel NEMO-binding domain mimetics for inhibiting IKK/NF-κB activation. PLoS biology. 16 (6), 2004663 (2018).
- Zhang, Q., Lenardo, M. J., Baltimore, D. 30 Years of NF-κB: a blossoming of relevance to human pathobiology. Cell. 168 (1-2), 37-57 (2017).
- Jin, D. Y., Jeang, K. T. Isolation of full-length cDNA and chromosomal localization of human NF-kappaB modulator NEMO to Xq28. Journal of Biomedical Science. 6 (2), 115-120 (1999).
- Rushe, M., et al. Structure of a NEMO/IKK-associating domain reveals architecture of the interaction site. Structure. 16 (5), 798-808 (2008).
- Guo, B., Audu, C. O., Cochran, J. C., Mierke, D. F., Pellegrini, M. Protein engineering of the N-terminus of NEMO: structure stabilization and rescue of IKKβ binding. Biochemistry. 53 (43), 6776-6785 (2014).
- Havranek, J. J., Harbury, P. B. Automated design of specificity in molecular recognition. Nature Structural Biology. 10 (1), 45-52 (2003).
- Barczewski, A. H., Ragusa, M. J., Mierke, D. F., Pellegrini, M. The IKK-binding domain of NEMO is an irregular coiled coil with a dynamic binding interface. Scientific Reports. 9 (1), 2950 (2019).
- Arimori, T., et al. Fv-clasp: an artificially designed small antibody fragment with improved production compatibility, stability, and crystallizability. Structure. 25 (10), 1611-1622 (2017).
- Hernandez Alvarez, B., Hartmann, M. D., Albrecht, R., Lupas, A. N., Zeth, K., Linke, D. A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors. Protein Engineering, Design and Selection. 21 (1), 11-18 (2008).
- Oshaben, K. M., Salari, R., McCaslin, D. R., Chong, L. T., Horne, W. S. The native GCN4 leucine-zipper domain does not uniquely specify a dimeric oligomerization state. Biochemistry. 51 (47), 9581-9591 (2012).
- Truebestein, L., Leonard, T. A. Coiled-coils: The long and short of it. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 38 (9), 903-916 (2016).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Engineering. 14 (12), 993-1000 (2001).
- Miladi, B., et al. A new tagged-TEV protease: construction, optimisation of production, purification and test activity. Protein Expression and Purification. 75 (1), 75-82 (2011).
- Miller, M. S., et al. Getting the Most Out of Your Crystals: Data Collection at the New High-Flux, Microfocus MX Beamlines at NSLS-II. Molecules. 24 (3), (2019).
- McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40, 658-674 (2007).
- Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).
- Terwilliger, T. C., et al. Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 64, 61-69 (2008).
- Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 60, 2126-2132 (2004).
- Terwilliger, T. C., et al. phenix.mr_rosetta: molecular replacement and model rebuilding with Phenix and Rosetta. Journal of Structural and Functional Genomics. 13 (2), 81-90 (2012).
- Strong, M., Sawaya, M. R., Wang, S., Phillips, M., Cascio, D., Eisenberg, D. Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (21), 8060-8065 (2006).
- Tickle, I. J., et al. . STARANISO. , (2018).
- French, S., Wilson, K. On the treatment of negative intensity observations. Acta Crystallographica Section A: Crystal Physics, Diffraction, Theoretical and General Crystallography. 34 (4), 517-525 (1978).
- Goldschmidt, L., Cooper, D. R., Derewenda, Z. S., Eisenberg, D. Toward rational protein crystallization: A Web server for the design of crystallizable protein variants. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 16 (8), 1569-1576 (2007).
- Zhou, L., et al. Disulfide-mediated stabilization of the IκB kinase binding domain of NF-κB essential modulator (NEMO). Biochemistry. 53 (50), 7929-7944 (2014).
- D’Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: what have we learned. Acta Crystallographica. Section F, Structural Biology Communications. 70, 1117-1126 (2014).
