Summary

NEMOのIKK結合ドメインの生産・結晶化・構造決定

Published: December 28, 2019
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Summary

X線結晶学によるNEMOのIKK結合ドメインの構造決定のためのプロトコルについて説明する。この方法には、タンパク質発現、精製および特性評価、ならびに結晶最適化を成功させるための戦略および非結合形態のタンパク質の構造決定が含まれる。

Abstract

NEMOは、キナーゼIKKαおよびIKKβとIKK複合体を組み立てすることにより、NF-κB経路において重要な役割を果たす足場タンパク質である。活性化時に、IKK複合体は、NF-κB核転移および標的遺伝子の活性化につながるIκB分子をリン酸化する。NEMO/IKK相互作用の阻害は、NF-κB経路活性の変調のための魅力的な治療パラダイムであり、NEMOを阻害剤の設計および発見の標的としている。NEMO阻害剤の発見と最適化のプロセスを容易にするために、我々は、アポ形態および小分子量阻害剤に結合しながら、アポ形態のタンパク質の構造決定を可能にするNEMOのIKK結合ドメインの改良された構築物を設計した。ここでは、NEMOのIKK結合ドメインの設計、表現、構造特性評価に利用する戦略を紹介する。タンパク質は大腸菌細胞で発現し、変性条件下で可溶化し、3つのクロマトグラフィー工程を経て精製される。構造決定用結晶を得るためのプロトコルについて議論し、データ取得・分析戦略について説明する。プロトコルは、NEMOと低分子阻害剤の複合体の構造決定に広い適用性を見出す。

Introduction

NF-κB経路は、サイトカイン、微生物産物およびストレスを含む様々な刺激に応答して活性化され、炎症および免疫応答を担う標的遺伝子の発現を調節し、細胞死または生存および増殖1を担う。炎症性および自己免疫疾患および癌2、3、4、5含む病理は、経路の過活性化と相関しており、これはNF−κB活性の変調を新しい治療法開発のための主要な標的としている6、7である。

特に正規のNF-κB経路は、非正規経路と区別され、リンパ有機生起とB細胞活性化を担い、前者の足場タンパク質NEMO(NF-κB必須変調器8)への依存によって、キナーゼIKKαおよびIKKβを有するIKK複合体の集合体に対する。IKK複合体は、分解を標的とするIκBα(κBの阻害剤)のリン酸化を担い、遺伝子転写1の核に転移するNF-κBダイマーを解放し、したがってNF-κB活性を調節する阻害剤の開発のための魅力的な標的である。

本研究では、NeMOとIKKβの間のタンパク質間相互作用の特性評価に焦点を当て、IKK複合体形成の低分子阻害剤の開発に向けたNEMOを標的としています。NEMOの最小結合ドメインは、IKKβを結合するために必要とされ、残基44〜111を包含し、その構造は、IKKβ配列701〜7459に対応するペプチドと複合体で決定されている。NEMOとIKKβは、NEMOダイマーが拡張相互作用インタフェースを備えた細長い開いた溝にIKKβ(701-745)の2つのヘリックスを収容する4ヘリックスバンドルを形成します。IKKβ(734-742)はNEMO結合ドメイン(NBD)とも呼ばれ、2つの必須トリプトファン(739,741)がNEMOポケット内に深く埋め込まれる結合のための最も重要なホットスポットを定義します。複雑な構造の詳細は、NEMOを標的とする低分子阻害剤の構造ベースの設計と最適化に役立ちます。同時に、小分子またはペプチドの結合が、結晶中に観察されるように、長いIKKβ(701-745)の結合によって引き起こされる完全な立体構造変化(すなわち、NEMOコイルコイルダイマーの広範な開口部)をNEMOで再現することは困難であり、そして、低分子阻害剤に結合した非結合NEMOまたはNEMOの構造は、より良い標的を表し得る。

IKK結合ドメインを包含する全長NEMOおよび小型切り捨てコンストラクトは、X線結晶学および核磁気共鳴(NMR)法10を介した非結合形態の構造決定に対して難解であることが証明されており、NEMOのIKK結合ドメインの改良版を設計するよう促した。実際、非結合形態のNEMO(44-111)は部分的に折り畳まれ、立体構造交換を受けるので、IKKβの結合親和性を保ちながら、その二量体構造、コイルコイルの折り畳み、安定性を安定させる設定を行っています。タンパク質のN-およびC末端に理想的な二量体コイルコイルシーケンス11の3つのヘプタドを加え、一連の4点突然変異を加えることで、完全に二量体化された構造であるNEMO-EEAAを生成し、コイル状のコイルに折り畳まれ、全長NEMO12で観察されたナノモル範囲に対するIKK結合親和性を検出した。さらなる利点として、コイルコイルアダプタ(GCN4シーケンスに基づく)が結晶化を促進し、最終的には分子置換によるX線構造決定に役立つことを期待しました。コイルコイルアダプタは、安定性を高め、溶液挙動を改善し、三量体コイルおよび抗体断片13、14に対する結晶化を促進するために同様に利用されている。NEMO-EEAAは、クリーバ可能なヒスチジンタグを有する大腸菌細胞から容易に発現および精製され、可溶性であり、安定した二量体コイルコイルに折り畳まれ、1.9Åへの回折で容易に結晶化される。GCN4の順序付けられたコイルコイル領域の存在は、GCN415の既知の構造を用いた分子置換によるNEMO-EEAAの結晶からのデータのフェージングをさらに助けることができる。

アポ-NEMO-EEAAで得られた結果を考えると、ここで説明するプロトコルは、NEMO阻害の要件を理解し、初期リード阻害剤の構造ベースの最適化を高い親和性に理解することを目的として、小型ペプチド(NBDペプチドなど)または低分子阻害剤の存在下でNEMO-EEAAの結晶化にも適用できると考えています。多くのコイルコイルドメイン16の可塑性および動的性質を考えると、コイルコイルアダプタの使用は、構造決定を支援する上でより一般的な適用性を見つけることができる。

Protocol

1. 結晶学のためのコンストラクトの設計 N末端ヘキサヒスチジンタグおよびプロテアーゼ切断部位を含むT7プロモーターを用いて大腸菌中で発現するためのベクターにおいて、前の出版物12のようにNEMO-EEAAの配列をクローン化する。注:このプロトコルでは、N末端ヘキサヒスチジンタグとタバコエッチングウイルス(TEV)切断部位10を含むよう?…

Representative Results

NEMOのIKK結合ドメインのクローニング、発現および精製。この研究では、回折品質の結晶を製造したNEMO-EEAA(図1A)の最終配列を得るために、N-およびC末端におけるコイルコイルアダプタの添加、変異C76A、C95Sおよび変異E56A、E57Aを含むすべての中間構造の発現および特性評価に関与した。図1Bは、<strong class="xfig…

Discussion

非結合形態でのNEMOの結晶化の試みは、IKK結合ドメインを包含する全長タンパク質およびいくつかの切り捨て構築物を使用する試みを含め、失敗した。循環二色性によるNEMOのIKK結合ドメイン(残基44-111)の生物物理学的特徴は、NMR分光法および蛍光異方性が、IKKβと結合できるが、結晶化9、10に適さない立体構造の状態で存在することを示した。当社?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

D.マッデン教授は、このプロジェクトを通して多くの有益な議論をしてくれたことに感謝します。最適化されたGCN4コイルコイルを含むプラスミドの贈り物に対してD.ボロン教授に感謝します。私たちは、NEMOプラスミドのためにB.グオ博士に感謝します。クリスティーナ・R・アーノルディ、タマル・バシアシヴィリ、エイミー・E・ケネディのデモンストレーションに感謝します。我々は、BioMT結晶学コア施設とダートマスの化学・生化学・細胞生物学部門に感謝し、結晶学機器とBioMT担当者の支援に感謝します。本研究では、米国エネルギー省(DOE)科学省のユーザー施設である全米シンクロトロン光源IIのAMXビームラインを、契約番号に基づきブルックヘブン国立研究所がDOE科学局に勤務する。DE-SC0012704.NSLS IIのスタッフの皆様のご支援に感謝申し上げます。この作品は、NIH助成金R03AR066130、R01GM133844、R35GM128663およびP20GM113132、およびムンク・プフェファーコーン小説とインタラクティブ補助金によって資金提供されました。

Materials

20% w/v γ-PGA (Na+ form, LM) Molecular Dimensions MD2-100-150 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
3.5 kDa MWCO Dialysis Membrane Spectra/Por 132724 For dialysis removal of imidazole
Amicon Stirred Cell Millipose Sigma UFSC 05001 For protein concentration
Ammonium Chloride Millipore Sigma G8270 For minimal media labeling
Benzonase Nuclease Millipore Sigma 9025-65-4 For digestion of nucleic acid
BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Competent Cells Agilent Technologies Model: 230245 TEV expression
CryoPro Hampton Research HR2-073 Cryo-protectants kit
D-Glucose (Dextrose) Millipore Sigma A9434 For minimal media labeling
Difco Terrific Broth ThermoFisher DF043817 For culture growth
Dithiothreitol > 99% Goldbio DTT25 For reduction of disulfides
E. coli: Rosetta 2 (DE3) Novagen 71400-3 Expression of unlabeled NEMO-EEAA
FORMULATOR Formulatrix Liquid handler/ screen builder
HCl – 1.0 M Solution Hampton Research HR2-581 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
HiLoad 16/600 Superdex 75 pg GE Healthcare 28989333 For size exclusion purification
HisTrap HP 5 mL column GE Healthcare 17524802 For purification of His-tagged NEMO-EEAA
HT 96 MIDAS Molecular Dimensions MD1-59 For sparse matrix screening of NEMO-EEAA
HT 96 Morpheous Molecular Dimensions MD1-46 For sparse matrix screening of NEMO-EEAA
Imidazole ThermoFisher 288-32-4 For elution from His-trap column
Isopropyl-beta-D-thiogalactoside Goldbio I2481C5 For induction of cultures
MRC2 crystallization plate Hampton Research HR3-083 Crystallization plate
NT8 – Drop Setter Formulatrix Crystallization
pET-16b Millipore Sigma 69662 For cloning of NEMO-EEAA
pET-45b Millipore Sigma 71327 For cloning of NEMO-EEAA
Phenylmethylsulfonyl fluoride ThermoFisher 36978 For inhibition of proteases
Polycarbonate Bottle for use in Ultracentrifuge Rotor Type 45 Ti Beckmann Coulter 339160 Ultracentrifuge bottle
Polyethylene Glycol 20,000 Hampton Research HR2-609 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
pRK793 (TEV) Addgene Plasmid 8827 For TEV production
QuikChange XL II Agilent Technologies 200522 Site directed mutagenesis
Required Cap Assembly: Beckmann Coulter 355623 Ultracenttrifuge bottle cap
ROCK IMAGER Formulatrix Crystallization Imager
Seed Bead Kit Hampton Research HR2-320 Seed generation
Sodium Chloride ≥ 99% Millipore Sigma S9888 For buffering of purification solutions
TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphine Hydrochloride) Goldbio TCEP1 Reducing agent
The Berkeley Screen Rigaku MD15-Berekely For sparse matrix screening of NEMO-EEAA
The PGA Screen Molecular Dimensions MD1-50 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
Tris – 1.0 M Solution Hampton Research HR2-589 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
Ultrapure Tris Buffer (powder format) Thermofisher 15504020 For buffering of purification solutions
Urea ThermoFisher 29700 For denaturation of NEMO-EEAA

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Barczewski, A. H., Ragusa, M. J., Mierke, D. F., Pellegrini, M. Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO. J. Vis. Exp. (154), e60339, doi:10.3791/60339 (2019).

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