Produzione, cristallizzazione e determinazione della struttura del dominio iKK-binding di NEMO
Summary
Descriviamo protocolli per la determinazione della struttura del dominio iKK-binding di NEMO dalla cristallografia a raggi X. I metodi includono l’espressione proteica, la purificazione e la caratterizzazione, nonché strategie per il successo dell’ottimizzazione dei cristalli e la determinazione della struttura della proteina nella sua forma non associata.
Abstract
NeMO è una proteina di impalcatura che svolge un ruolo essenziale nel percorso NF-B assemblando il complesso IKK con le chinasi IKK e IKK. Al momento dell’attivazione, il complesso ifosofolaIKK le molecole IB che portano alla traslocazione nucleare NF-B e all’attivazione dei geni bersaglio. L’inibizione dell’interazione NEMO/IKK è un paradigma terapeutico interessante per la modulazione dell’attività del percorso NF-B, rendendo NEMO un bersaglio per la progettazione e la scoperta degli inibitori. Per facilitare il processo di scoperta e ottimizzazione degli inibitori NEMO, abbiamo progettato un costrutto migliorato del dominio di NEMO che lega IKK di NEMO che consentirebbe la determinazione della struttura della proteina nella forma apoe e mentre è legato a piccoli inibitori del peso molecolare. Qui, presentiamo la strategia utilizzata per la progettazione, l’espressione e la caratterizzazione strutturale del dominio iKK-binding di NEMO. La proteina è espressa in cellule di E. coli, solubilificate in condizioni di detonazione e purificate attraverso tre passaggi cromatografici. Discutiamo i protocolli per ottenere cristalli per la determinazione della struttura e descriviamo le strategie di acquisizione e analisi dei dati. I protocolli troveranno ampia applicabilità alla determinazione della struttura di complessi di NEMO e piccoli inibitori di molecole.
Introduction
La via NF-B viene attivata in risposta a una varietà di stimoli, tra cui citochine, prodotti microbici e stress, per regolare l’espressione dei geni bersaglio responsabili della risposta infiammatoria e immunitaria, della morte o della sopravvivenza cellulare e della proliferazione1. Le patologie, tra cui malattie infiammatorie e autoimmuni e cancro2,3,4,5 sono state correlate all’iperattivazione del percorso, che ha reso la modulazione dell’attività nF-B un obiettivo primario per lo sviluppo di nuove terapie6,7.
La via canonica NF-B, in particolare, si distingue dalla via non canonica, responsabile dell’antanalgenesi e dell’attivazione delle cellule B, dalla dipendenza del primo dalla proteina di scaffolding NEMO (NF-Bmodulatoreessenziale 8 ) per l’assemblaggio del complesso IKK con le chinasi IKK e IKK. Il complesso di IKK è responsabile della fosforilazione dell’IB, che lo prende di mira per la degradazione, liberando i dimeri NF-B da traslocare nel nucleo per la trascrizione genica1 ed è quindi un bersaglio attraente per lo sviluppo di inibitori per modulare l’attività NF-B.
La nostra ricerca si concentra sulla caratterizzazione dell’interazione proteina-proteina tra NEMO e IK, mirando a NEMO per lo sviluppo di piccoli inibitori molecolari della formazione complessa di IKK. Il dominio di legame minimo di NEMO, necessario per legare IKK, comprende i residui 44-111, e la sua struttura è stata determinata in complesso con un peptide corrispondente alla sequenza di IKK – 701-7459. NeMO e IKK formano un fascio di quattro elica in cui il dimero NEMO ospita le due eliche di IKK (701-745) in una scanalatura aperta allungata con un’interfaccia di interazione estesa. Il dominio legante NEMO (NBD), IKKà (734-742), definisce il punto caldo più importante per l’associazione, dove i due tritofori essenziali (739,741) seppelliscono profondamente all’interno della tasca NEMO. I dettagli della struttura complessa possono aiutare nella progettazione e nell’ottimizzazione basata sulla struttura degli inibitori delle piccole molecole mirati a NEMO. Allo stesso tempo, è difficile che il legame di una piccola molecola o peptide ricrei in NEMO l’intero cambiamento conformazionale (cioè, un’ampia apertura del dimero neMO a bobina) causato dal legame del lungo IKK (701-745), come osservato nel cristallo, e la struttura di NEMO o NEMO non legato a un inibitore della piccola molecola può rappresentare un migliore obiettivo per la progettazione e l’ottimizzazione dei farmaci basati sulla struttura.
I costrutti di troncamento a lunghezza intera NEMO e di troncamento più piccoli che comprendono il dominio di associazione IKK si sono dimostrati intrattabili per la determinazione della struttura in forma non integrata tramite la cristallografia a raggi X e i metodi di risonanza magnetica nucleare (NMR)10, il che ci ha spinto a progettare una versione migliorata del dominio di legame IKK di NEMO. Infatti, NEMO (44-111) nella forma non associata è solo parzialmente piegato e subisce uno scambio conformazionale e quindi abbiamo deciso di stabilizzare la sua struttura dimeica, piega e stabilità della bobina, pur conservando l’affinità vincolante per IKK. Aggiungendo tre eptadi di sequenze ideali dimericed coil11 al n-e C-termini della proteina, e una serie di quattro mutazioni punti, abbiamo generato NEMO-EEAA, un costrutto completamente dimerico e piegato in una bobina a bobina, che ha salvato l’affinità IKK-legante alla gamma nanomolare come osservato per la lunghezza completa NEMO12. Come ulteriore vantaggio, speravamo che gli adattatori a bobina (basati sulla sequenza GCN4) avrebbero facilitato la cristallizzazione e infine aiutato nella determinazione della struttura a raggi X attraverso la sostituzione molecolare. Adattatori a bobina sono stati utilizzati in modo simile sia per aumentare la stabilità, migliorare il comportamento della soluzione e facilitare la cristallizzazione per bobine a bobina trimeree e frammenti di anticorpi13,14. NeMO-EEAA è facilmente esprimente e purificato dalle cellule di Escherichia. coli con un’etichetta histidina sfilsiabile, è solubile, piegato in una bobina a bobina dimeric stabile ed è facilmente cristallizzato, con diffrazione a 1,9 . La presenza delle regioni ordinate a bobina di GCN4 potrebbe inoltre aiutare a far rientrare i dati provenienti dai cristalli di NEMO-EEAA mediante sostituzione molecolare utilizzando la struttura nota di GCN415.
Dati i risultati ottenuti con apo-NEMO-EEAA, crediamo che i protocolli qui descritti potrebbero essere applicati anche alla cristallizzazione del NEMO-EEAA in presenza di piccoli peptidi (come il peptide NBD) o di inibitori di piccole molecole, con l’obiettivo di comprendere i requisiti per l’inibizione NEMO e l’ottimizzazione basata sulla struttura degli inibitori iniziali del piombo ad alta affinità. Data la plasticità e la natura dinamica di molti domini a bobina16, l’uso degli adattatori a bobina-coil potrebbe trovare un’applicabilità più generale nell’aiutare la determinazione strutturale.
Protocol
Representative Results
Discussion
I tentativi di cristallizzazione di NEMO in forma non associata non hanno avuto successo, inclusi i tentativi di utilizzo della proteina a lunghezza intera e diversi costrutti di troncamento che comprendono il dominio di legame IKK. La nostra caratterizzazione biofisica del dominio iKK-binding di NEMO (residui 44-111) da dichroismo circolare, spettroscopia NMR e anisotropia fluorescenza ha indicato che il costrutto, anche se in grado di legare IKK, esisteva in uno stato di scambio conformativo, non adatto per la cristall…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il professor D. Madden, per molte discussioni utili durante questo progetto. Ringraziamo il prof. Ringraziamo il Dottor B. Guo per i plasmidi NEMO. Ringraziamo Christina R. Arnoldy, Tamar Basiashvili e Amy E. Kennedy per aver dimostrato la procedura. Ringraziamo il BioMT Crystallography Core Facility e i dipartimenti di Chimica e di Biochimica & Biologia Cellulare a Dartmouth per l’uso delle attrezzature di cristallografia e del personale BioMT per il loro supporto. Questa ricerca ha utilizzato la linea di fascio AMX del National Synchrotron Light Source II, un U.S. Department of Energy (DOE) Office of Science User Facility gestito per l’Ufficio DOE della Scienza dal Brookhaven National Laboratory sotto Contratto n. DE-SC0012704. Ringraziamo il personale di NSLS II per il loro sostegno. Questo lavoro è stato finanziato da NIH sovvenzioni R03AR066130, R01GM133844, R35GM128663 e P20GM113132, e un Munck-Pfefferkorn Novel and Interactive grant.
Materials
| 20% w/v γ-PGA (Na+ form, LM) | Molecular Dimensions | MD2-100-150 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| 3.5 kDa MWCO Dialysis Membrane | Spectra/Por | 132724 | For dialysis removal of imidazole |
| Amicon Stirred Cell | Millipose Sigma | UFSC 05001 | For protein concentration |
| Ammonium Chloride | Millipore Sigma | G8270 | For minimal media labeling |
| Benzonase Nuclease | Millipore Sigma | 9025-65-4 | For digestion of nucleic acid |
| BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Competent Cells | Agilent Technologies | Model: 230245 | TEV expression |
| CryoPro | Hampton Research | HR2-073 | Cryo-protectants kit |
| D-Glucose (Dextrose) | Millipore Sigma | A9434 | For minimal media labeling |
| Difco Terrific Broth | ThermoFisher | DF043817 | For culture growth |
| Dithiothreitol > 99% | Goldbio | DTT25 | For reduction of disulfides |
| E. coli: Rosetta 2 (DE3) | Novagen | 71400-3 | Expression of unlabeled NEMO-EEAA |
| FORMULATOR | Formulatrix | Liquid handler/ screen builder | |
| HCl – 1.0 M Solution | Hampton Research | HR2-581 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| HiLoad 16/600 Superdex 75 pg | GE Healthcare | 28989333 | For size exclusion purification |
| HisTrap HP 5 mL column | GE Healthcare | 17524802 | For purification of His-tagged NEMO-EEAA |
| HT 96 MIDAS | Molecular Dimensions | MD1-59 | For sparse matrix screening of NEMO-EEAA |
| HT 96 Morpheous | Molecular Dimensions | MD1-46 | For sparse matrix screening of NEMO-EEAA |
| Imidazole | ThermoFisher | 288-32-4 | For elution from His-trap column |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactoside | Goldbio | I2481C5 | For induction of cultures |
| MRC2 crystallization plate | Hampton Research | HR3-083 | Crystallization plate |
| NT8 – Drop Setter | Formulatrix | Crystallization | |
| pET-16b | Millipore Sigma | 69662 | For cloning of NEMO-EEAA |
| pET-45b | Millipore Sigma | 71327 | For cloning of NEMO-EEAA |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | ThermoFisher | 36978 | For inhibition of proteases |
| Polycarbonate Bottle for use in Ultracentrifuge Rotor Type 45 Ti | Beckmann Coulter | 339160 | Ultracentrifuge bottle |
| Polyethylene Glycol 20,000 | Hampton Research | HR2-609 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| pRK793 (TEV) | Addgene | Plasmid 8827 | For TEV production |
| QuikChange XL II | Agilent Technologies | 200522 | Site directed mutagenesis |
| Required Cap Assembly: | Beckmann Coulter | 355623 | Ultracenttrifuge bottle cap |
| ROCK IMAGER | Formulatrix | Crystallization Imager | |
| Seed Bead Kit | Hampton Research | HR2-320 | Seed generation |
| Sodium Chloride ≥ 99% | Millipore Sigma | S9888 | For buffering of purification solutions |
| TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphine Hydrochloride) | Goldbio | TCEP1 | Reducing agent |
| The Berkeley Screen | Rigaku | MD15-Berekely | For sparse matrix screening of NEMO-EEAA |
| The PGA Screen | Molecular Dimensions | MD1-50 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| Tris – 1.0 M Solution | Hampton Research | HR2-589 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| Ultrapure Tris Buffer (powder format) | Thermofisher | 15504020 | For buffering of purification solutions |
| Urea | ThermoFisher | 29700 | For denaturation of NEMO-EEAA |
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