الإنتاج ، البلورة ، وتحديد الهيكل للمجال الملزم IKK من نيمو
Summary
ونحن نقدم وصفا للبروتوكولات الخاصة بتحديد هيكل المجال الملزم IKK من نيمو بواسطة البلورات بالاشعه السينية. وتشمل الأساليب التعبير البروتين, تنقيه وتوصيف وكذلك استراتيجيات لتحسين الكريستال الناجحة وهيكل تحديد البروتين في شكله غير منضم.
Abstract
نيمو هو بروتين السقالات الذي يلعب دورا أساسيا في المسار NF-κB عن طريق تجميع IKK-مجمع مع كيناسيس IKKα و IKKβ. عند التنشيط ، فان مجمع IKK فوسفولات الجزيئات IκB مما يؤدي إلى النقل النووي NF-κB وتفعيل الجينات المستهدفة. تثبيط التفاعل نيمو/IKK هو نموذج علاجي جذاب لتشكيل النشاط المسار NF-κB ، مما يجعل نيمو هدفا لتصميم مثبطات واكتشاف. لتسهيل عمليه الاكتشاف والاستفادة المثلي من مثبطات نيمو ، قمنا بهندسة بناء محسن للمجال الملزم IKK من نيمو الذي من شانه ان يسمح لتحديد هيكل البروتين في شكل apo وبينما يرتبط بمثبطات الوزن الجزيئي الصغيرة. هنا ، نقدم الاستراتيجية المستخدمة للتصميم والتعبير والتوصيف الهيكلي للمجال الملزم IKK من نيمو. يتم التعبير عن البروتين في الخلايا القولونية ، solubilized تحت ظروف الدفن وتنقيتها من خلال ثلاث خطوات الكروماتوغرافي. نناقش البروتوكولات الخاصة بالحصول علي بلورات لتحديد الهيكل ووصف استراتيجيات الحصول علي البيانات وتحليلها. وسوف تجد البروتوكولات تطبيق واسعه لهيكل تحديد المجمعات من نيمو ومثبطات جزيء صغير.
Introduction
يتم تنشيط مسار NF-κB استجابه لمجموعه متنوعة من المحفزات ، بما في ذلك السايتوكينات والمنتجات الميكروبية والإجهاد ، لتنظيم التعبير عن الجينات المستهدفة المسؤولة عن الاستجابة التهابيه والمناعية ، وموت الخلايا أو البقاء علي قيد الحياة والانتشار1. الامراض بما في ذلك التهابات والمناعة الذاتية والسرطان2,3,4,5 وقد ارتبطت إلى فرط تنشيط المسار, الذي جعل التحوير NF-κb النشاط هدفا رئيسيا لتطوير العلاجات الجديدة6,7.
ويتميز المسار NF-κB الكنسي علي وجه الخصوص من المسار غير المتعارف عليه ، والمسؤولة عن الغدد الليمفاوية وتنشيط ب الخلية ، من قبل الاعتماد السابق علي نيمو البروتين السقالات (NF-κB المغير الاساسيه8) لتجميع ikk-مجمع مع كيناسيس IKKα و IKKβ. مجمع IKK هو المسؤول عن فوسفولات IκBα (المثبط من κB) التي تستهدف ذلك للتدهور ، وتحرير الدمامل NF-κB لنقل إلى نواه للنسخ الجيني1 التالي هو هدف جذاب لتطوير مثبطات لتعدل NF-κb النشاط.
تركز أبحاثنا علي توصيف التفاعل بين البروتين والبروتين بين نيمو و IKKβ ، والتي تستهدف نيمو لتطوير مثبطات جزيئات صغيره من تكوين مجمع IKK. مجال ملزم الحد الأدنى من نيمو ، المطلوبة لربط IKKβ ، ويشمل بقايا 44-111 ، وتم تحديد بنيتها في مجمع مع الببتيد المقابلة ل IKKβ تسلسل 701-7459. نيمو و ikkβ تشكل حزمه أربعه الحلزون حيث يستضيف نيمو ديمر الهلاليين من ikkβ (701-745) في أخدود مفتوح ممدود مع واجهه تفاعل موسعه. IKKβ (734-742) ، والمعروف أيضا باسم المجال نيمو ملزمه (بنك دبي الرئيسي) ، ويعرف أهم بقعه ساخنه للربط ، حيث تريبتوفانس الاساسيه اثنين (739,741) دفن عميقا داخل الجيب نيمو. تفاصيل هيكل معقده يمكن ان تساعد في التصميم القائم علي هيكل والأمثل لمثبطات جزيء صغير استهداف نيمو. في الوقت نفسه ، فانه من الصعب ان ملزمه لجزيء صغير أو الببتيد من شانه ان يعيد في نيمو التغيير المطابق الكامل (اي ، فتح واسعه من نيمو ملفوف لفائف dimer) الناجمة عن ربط IKKβ طويلة (701-745) ، كما لوحظ في الكريستال ، وبنيه غير منضم نيمو أو نيمو منضما إلى مثبط جزيء صغير قد تمثل هدفا أفضل لتصميم المخدرات المستندة إلى بنيه والمثبط الأمثل.
وقد ثبت الطول الكامل نيمو وأصغر بنيات اقتطاع تشمل مجال IKK-ربط المستعصية لتحديد هيكل في شكل غير منضم عن طريق الاشعه السينية البلورات والرنين المغناطيسي النووي (NMR) طرق10، مما دفعنا إلى تصميم نسخه محسنه من مجال ikk ملزم من نيمو. في الواقع, نيمو (44-111) في شكل غير منضم فقط مطوية جزئيا ويخضع للتبادل المطابق ونحن لذلك تعيين لتحقيق الاستقرار هيكلها ديميريك, ملفوف لفائف اضعاف والاستقرار, مع الحفاظ علي تقارب ملزمه ل IKKβ. من خلال إلحاق ثلاثه من الهبات من الديميريك المثالي لفائف ملفوفه11 في N-و C-تيرميني من البروتين ، وسلسله من أربعه طفرات النقطة ، ونحن ولدت نيمو-eeaa ، بناء ديميريك تماما ومطوية في لفائف ملفوف ، التي أنقذت صله ikk الربط إلى نطاق نانومولار كما لوحظ لكامل طول نيمو12. كميزه اضافيه ، كنا نامل ان محولات ملفوف لفائف (علي أساس تسلسل GCN4) من شانه ان يسهل تبلور والمساعدة في نهاية المطاف في تحديد هيكل الاشعه السينية عن طريق استبدال الجزيئية. وقد استخدمت محولات ملفوف لفائف بالمثل لزيادة الاستقرار ، وتحسين السلوك الحل وتسهيل بلوره للفائف ملفوف تريميريك وشظايا الأجسام المضادة13،14. يتم التعبير عن نيمو-EEAA بسهوله وتنقيتها من اساسيكوجيا. القولونية الخلايا مع العلامة كليفابل Histidine ، هو قابل للذوبان ، مطوية في لفائف ديميريك ملفوف مستقره وتبلور بسهوله ، مع انكسار إلى 1.9 Å. وجود المناطق ملفوف لفائف أمر من GCN4 يمكن ان تساعد بالاضافه إلى ذلك في التدريج البيانات من بلورات نيمو-EEAA من قبل الاستبدال الجزيئي باستخدام الهيكل المعروف من GCN415.
النظر إلى النتائج التي تم الحصول عليها مع apo-نيمو-EEAA ، ونحن نعتقد ان البروتوكولات الموصوفة هنا يمكن أيضا ان تطبق علي بلوره نيمو-EEAA في وجود الببتيدات الصغيرة (مثل الببتيد بنك دبي المحلي) أو مثبطات جزيء صغير ، مع الهدف من فهم متطلبات تثبيط نيمو والتحسين القائم علي الهيكل من مثبطات الرصاص النظر إلى اللدونة والطبيعة الديناميكية للعديد من المجالات ملفوف لفائف16، واستخدام محولات لفائف ملفوف يمكن العثور علي تطبيق أكثر عمومية في مساعده التصميم الهيكلي.
Protocol
Representative Results
Discussion
كانت محاولات بلوره نيمو في النموذج غير المنضم غير ناجحه ، بما في ذلك محاولات استخدام البروتين بالطول الكامل والعديد من ثوابت الاقتطاع التي تشمل مجال ربط IKK. الخصائص الفيزيائية الحيوية لدينا من مجال الربط ikk من نيمو (بقايا 44-111) بواسطة ثنائيه التعميم ، nmr الطيفية والفلورية المتباينة أشارت إل?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر البروفيسور د. مادن علي العديد من المناقشات المفيدة في هذا المشروع. نشكر البروفيسور d. bolon لهديه من البلازميد التي تحتوي علي لفائف ملفوف GCN4 الأمثل. ونشكر الدكتور ب. قوه علي نيمو البلازميدات. ونشكر كريستينا ر. ارنولدي ، وتمار باساشفيلي ، وإيمي ا. كينيدي لإظهارها هذا الاجراء. ونشكر المرفق الأساسي لعلم البلورات البيولوجية وأقسام الكيمياء والكيمياء الحيوية & بيولوجيا الخلية في دارتموث لاستخدام معدات علم البلورات والافراد البيولوجيين لدعمهم. استخدم هذا البحث AMX beamline من المصدر الوطني للضوء Synchrotron الثاني ، وهو مكتب وزاره الطاقة الامريكيه لمرفق المستخدم العلوم تعمل لمكتب وزاره العلوم من قبل مختبر بروكهافن الوطني ببموجب العقد رقم DE-SC0012704. نشكر الموظفين في NSLS II علي دعمهم. تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة المنح R03AR066130 ، R01GM133844 ، R35GM128663 و P20GM113132 ، ورواية Munck-بفيفيركورن والمنحة التفاعلية.
Materials
| 20% w/v γ-PGA (Na+ form, LM) | Molecular Dimensions | MD2-100-150 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| 3.5 kDa MWCO Dialysis Membrane | Spectra/Por | 132724 | For dialysis removal of imidazole |
| Amicon Stirred Cell | Millipose Sigma | UFSC 05001 | For protein concentration |
| Ammonium Chloride | Millipore Sigma | G8270 | For minimal media labeling |
| Benzonase Nuclease | Millipore Sigma | 9025-65-4 | For digestion of nucleic acid |
| BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Competent Cells | Agilent Technologies | Model: 230245 | TEV expression |
| CryoPro | Hampton Research | HR2-073 | Cryo-protectants kit |
| D-Glucose (Dextrose) | Millipore Sigma | A9434 | For minimal media labeling |
| Difco Terrific Broth | ThermoFisher | DF043817 | For culture growth |
| Dithiothreitol > 99% | Goldbio | DTT25 | For reduction of disulfides |
| E. coli: Rosetta 2 (DE3) | Novagen | 71400-3 | Expression of unlabeled NEMO-EEAA |
| FORMULATOR | Formulatrix | Liquid handler/ screen builder | |
| HCl – 1.0 M Solution | Hampton Research | HR2-581 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| HiLoad 16/600 Superdex 75 pg | GE Healthcare | 28989333 | For size exclusion purification |
| HisTrap HP 5 mL column | GE Healthcare | 17524802 | For purification of His-tagged NEMO-EEAA |
| HT 96 MIDAS | Molecular Dimensions | MD1-59 | For sparse matrix screening of NEMO-EEAA |
| HT 96 Morpheous | Molecular Dimensions | MD1-46 | For sparse matrix screening of NEMO-EEAA |
| Imidazole | ThermoFisher | 288-32-4 | For elution from His-trap column |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactoside | Goldbio | I2481C5 | For induction of cultures |
| MRC2 crystallization plate | Hampton Research | HR3-083 | Crystallization plate |
| NT8 – Drop Setter | Formulatrix | Crystallization | |
| pET-16b | Millipore Sigma | 69662 | For cloning of NEMO-EEAA |
| pET-45b | Millipore Sigma | 71327 | For cloning of NEMO-EEAA |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | ThermoFisher | 36978 | For inhibition of proteases |
| Polycarbonate Bottle for use in Ultracentrifuge Rotor Type 45 Ti | Beckmann Coulter | 339160 | Ultracentrifuge bottle |
| Polyethylene Glycol 20,000 | Hampton Research | HR2-609 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| pRK793 (TEV) | Addgene | Plasmid 8827 | For TEV production |
| QuikChange XL II | Agilent Technologies | 200522 | Site directed mutagenesis |
| Required Cap Assembly: | Beckmann Coulter | 355623 | Ultracenttrifuge bottle cap |
| ROCK IMAGER | Formulatrix | Crystallization Imager | |
| Seed Bead Kit | Hampton Research | HR2-320 | Seed generation |
| Sodium Chloride ≥ 99% | Millipore Sigma | S9888 | For buffering of purification solutions |
| TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphine Hydrochloride) | Goldbio | TCEP1 | Reducing agent |
| The Berkeley Screen | Rigaku | MD15-Berekely | For sparse matrix screening of NEMO-EEAA |
| The PGA Screen | Molecular Dimensions | MD1-50 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| Tris – 1.0 M Solution | Hampton Research | HR2-589 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| Ultrapure Tris Buffer (powder format) | Thermofisher | 15504020 | For buffering of purification solutions |
| Urea | ThermoFisher | 29700 | For denaturation of NEMO-EEAA |
References
- Gilmore, T. D. Introduction to NF-kappaB: players, pathways, perspectives. Oncogene. 25 (51), 6680-6684 (2006).
- Bassères, D. S., Baldwin, A. S. Nuclear factor-kappaB and inhibitor of kappaB kinase pathways in oncogenic initiation and progression. Oncogene. 25 (51), 6817-6830 (2006).
- Hayden, M. S., West, A. P., Ghosh, S. NF-kappaB and the immune response. Oncogene. 25 (51), 6758-6780 (2006).
- Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional regulation and its misregulation in disease. Cell. 152 (6), 1237-1251 (2013).
- Courtois, G., Gilmore, T. D. Mutations in the NF-kappaB signaling pathway: implications for human disease. Oncogene. 25 (51), 6831-6843 (2006).
- Zhao, J., et al. Development of novel NEMO-binding domain mimetics for inhibiting IKK/NF-κB activation. PLoS biology. 16 (6), 2004663 (2018).
- Zhang, Q., Lenardo, M. J., Baltimore, D. 30 Years of NF-κB: a blossoming of relevance to human pathobiology. Cell. 168 (1-2), 37-57 (2017).
- Jin, D. Y., Jeang, K. T. Isolation of full-length cDNA and chromosomal localization of human NF-kappaB modulator NEMO to Xq28. Journal of Biomedical Science. 6 (2), 115-120 (1999).
- Rushe, M., et al. Structure of a NEMO/IKK-associating domain reveals architecture of the interaction site. Structure. 16 (5), 798-808 (2008).
- Guo, B., Audu, C. O., Cochran, J. C., Mierke, D. F., Pellegrini, M. Protein engineering of the N-terminus of NEMO: structure stabilization and rescue of IKKβ binding. Biochemistry. 53 (43), 6776-6785 (2014).
- Havranek, J. J., Harbury, P. B. Automated design of specificity in molecular recognition. Nature Structural Biology. 10 (1), 45-52 (2003).
- Barczewski, A. H., Ragusa, M. J., Mierke, D. F., Pellegrini, M. The IKK-binding domain of NEMO is an irregular coiled coil with a dynamic binding interface. Scientific Reports. 9 (1), 2950 (2019).
- Arimori, T., et al. Fv-clasp: an artificially designed small antibody fragment with improved production compatibility, stability, and crystallizability. Structure. 25 (10), 1611-1622 (2017).
- Hernandez Alvarez, B., Hartmann, M. D., Albrecht, R., Lupas, A. N., Zeth, K., Linke, D. A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors. Protein Engineering, Design and Selection. 21 (1), 11-18 (2008).
- Oshaben, K. M., Salari, R., McCaslin, D. R., Chong, L. T., Horne, W. S. The native GCN4 leucine-zipper domain does not uniquely specify a dimeric oligomerization state. Biochemistry. 51 (47), 9581-9591 (2012).
- Truebestein, L., Leonard, T. A. Coiled-coils: The long and short of it. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 38 (9), 903-916 (2016).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Engineering. 14 (12), 993-1000 (2001).
- Miladi, B., et al. A new tagged-TEV protease: construction, optimisation of production, purification and test activity. Protein Expression and Purification. 75 (1), 75-82 (2011).
- Miller, M. S., et al. Getting the Most Out of Your Crystals: Data Collection at the New High-Flux, Microfocus MX Beamlines at NSLS-II. Molecules. 24 (3), (2019).
- McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40, 658-674 (2007).
- Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).
- Terwilliger, T. C., et al. Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 64, 61-69 (2008).
- Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 60, 2126-2132 (2004).
- Terwilliger, T. C., et al. phenix.mr_rosetta: molecular replacement and model rebuilding with Phenix and Rosetta. Journal of Structural and Functional Genomics. 13 (2), 81-90 (2012).
- Strong, M., Sawaya, M. R., Wang, S., Phillips, M., Cascio, D., Eisenberg, D. Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (21), 8060-8065 (2006).
- Tickle, I. J., et al. . STARANISO. , (2018).
- French, S., Wilson, K. On the treatment of negative intensity observations. Acta Crystallographica Section A: Crystal Physics, Diffraction, Theoretical and General Crystallography. 34 (4), 517-525 (1978).
- Goldschmidt, L., Cooper, D. R., Derewenda, Z. S., Eisenberg, D. Toward rational protein crystallization: A Web server for the design of crystallizable protein variants. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 16 (8), 1569-1576 (2007).
- Zhou, L., et al. Disulfide-mediated stabilization of the IκB kinase binding domain of NF-κB essential modulator (NEMO). Biochemistry. 53 (50), 7929-7944 (2014).
- D’Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: what have we learned. Acta Crystallographica. Section F, Structural Biology Communications. 70, 1117-1126 (2014).
