Lucifer Sarı İontoforez kullanarak Astrosit Morfolojisini Görselleştirme
Summary
Astrositler morfolojik olarak karmaşık hücrelerdir, çoklu süreçleri ve gür bölgeleri ile örneklenirler. Ayrıntılı morfolojilerini analiz etmek için, hafifçe sabit dokuda hücre içi Lucifer sarı iontoforezi gerçekleştirmek için güvenilir bir protokol salıyoruz.
Abstract
Astrositler nöral devrelerin temel bileşenleridir. Onlar tüm merkezi sinir sistemi döşeme (CNS) ve nörotransmitter temizliği, iyon regülasyonu, sinaptik modülasyon, nöronlar için metabolik destek ve kan akımı düzenleme dahil fonksiyonları, çeşitli katılır. Astrositler bir soma olan karmaşık hücrelerdir, birkaç ana dalları, ve nöropil içinde çeşitli hücresel elementlertemas çok sayıda ince süreçler. Astrositlerin morfolojisini değerlendirmek için yapılarını görselleştirmek için güvenilir ve tekrarlanabilir bir yönteme sahip olmak gerekir. Erişkin farelerden hafifçe sabitlenmiş beyin dokusunda floresan Lucifer sarısı (LY) boya kullanarak astrositlerin hücre içi iyontoforezini gerçekleştirmek için güvenilir bir protokol sıyoruz. Bu yöntem, astrosit morfolojisi karakterize etmek için yararlı olan çeşitli özelliklere sahiptir. Bu, yapılarının farklı yönleri üzerinde morfolojik analizler yapmak için yararlı olan bireysel astrositlerin üç boyutlu yeniden yapılandırılmasına olanak sağlar. Ly iyontoforezi ile birlikte immünohistokimya, astrositlerin sinir sisteminin farklı bileşenleriyle etkileşimini anlamak ve etiketli astrositler içindeki proteinlerin ekspresyonunu değerlendirmek için de kullanılabilir. Bu protokol, ışık mikroskobu ile astrosit morfolojisini titizlikle incelemek için CNS bozukluklarının çeşitli fare modellerinde uygulanabilir. LY iontoforezi, astrosit yapısını değerlendirmek için deneysel bir yaklaşım sağlar, özellikle bu hücrelerin önemli morfolojik değişikliklere uğraması önerildiği yaralanma veya hastalık bağlamında.
Introduction
Astrositler merkezi sinir sistemindeki en bol glial hücrelerdir (CNS). Onlar iyon homeostazı rol oynamak, kan akımı düzenleme, sinaps oluşumu yanı sıra eleme, ve nörotransmitter alımı1. Astrosit fonksiyonlarıgeniş bir yelpazede karmaşık morfolojik yapısı2yansıtılır ,3. Astrositler, sinapslar, dendritler, akslar, kan damarları ve diğer glial hücrelerle doğrudan etkileşime giren binlerce ince dal ve broşüre ayrılan birkaç birincil ve ikincil dal içerir. Astrosit morfolojisi farklı beyin bölgeleri arasında değişir, hangi nöronal devrelerde farklı işlevlerini gerçekleştirmek için yeteneklerini ipucu olabilir4. Ayrıca, astrositler gelişim sırasında morfolojisini değiştirmek için bilinen, fizyolojik koşullar sırasında, ve birden fazla hastalık devletlerde 3,5,6.
Astrosit morfolojisinin karmaşıklığını doğru bir şekilde çözmek için tutarlı, tekrarlanabilir bir yöntem gereklidir. Geleneksel olarak, immünohistokimya astrosit spesifik veya astrosit zenginleştirilmiş protein belirteçleri kullanımı ile astrosit görselleştirmek için kullanılmıştır. Ancak bu yöntemler astrositin yapısından çok protein ekspresyonunun paternini ortaya koymaktadır. Glial fibrillary asidik protein (GFAP) ve S100 kalsiyum bağlayıcı protein β (S100β) gibi yaygın olarak kullanılan belirteçler tüm hücre hacminde ifade etmez ve böylece tam morfolojiyi çözemez7. Floresan proteinleri astrositlerde (viral enjeksiyonlar veya transgenik fare muhabiri çizgileri) her yerde ifade etmek için genetik yaklaşımlar ince dalları ve genel bölgeyi belirleyebilir. Ancak, bireysel astrositleri ayırt etmek zordur ve analizler özel organizatör8tarafından hedeflenen astrosit popülasyonu tarafından önyargılı olabilir. Seri kesit elektron mikroskobu sinapslar ile astrosit süreçlerin etkileşimleri ayrıntılı bir resim ortaya çıkarmak için kullanılmıştır. Sinapslarla temas eden binlerce astrosit süreci nedeniyle, şu anda bu teknik9ile tüm hücreyi yeniden yapılandırmak mümkün değildir , ancak bu veri analizi için makine öğrenme yaklaşımlarının kullanımı ile değişmesi beklenmektedir.
Bu raporda, fare astrositlerini Lucifer sarısı (LY) boya ile hücre içi iyontoforez kullanarak, CA1 stratum radiatum’u örnek olarak kullanarak karakterize eden bir prosedüre odaklanıyoruz. Yöntem Eric Bushong ve Mark Ellisman10,11tarafından öncü geçmiş çalışmaları dayanmaktadır. Hafifçe sabitlenmiş beyin dilimlerinden gelen astrositler kendine özgü soma şekilleri ile tanımlanır ve LY ile doldurulur. Hücreler daha sonra konfokal mikroskopi ile görüntülenir. LY iyontoforezinin tek tek astrositleri yeniden yapılandırmak ve süreçlerinin ve bölgelerinin ayrıntılı morfolojik analizlerini yapmak için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz. Ayrıca, bu yöntem astrositler ve nöronlar, diğer glial hücreler ve beyin vaskülatür arasındaki mekansal ilişkileri ve etkileşimleri belirlemek için immünohistokimya ile birlikte uygulanabilir. LY iyontoforezinin farklı beyin bölgelerinde morfolojiyi ve sağlıklı veya hastalık lı hastalık lı fare modellerini analiz etmek için çok uygun bir araç olduğunu düşünüyoruz7,12,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda özetlenen yöntem, hafifçe sabitlenmiş beyin dilimlerinde LY boyasının hücre içi iontoforezini kullanarak astrosit morfolojisini görselleştirmenin bir yolunu açıklamaktadır. Bu protokolde vurgulanan ve başarılı LY iyontoforezine ve hücrelerin morfolojik rekonstrüksiyonuna katkıda bulunan birçok kritik faktör bulunmaktadır. Bir faktör kalitesi ve büyük ölçüde farenin yaşı ve perfüzyon sonucu tarafından belirlenir görüntülerin çoğaltılabilirlik vardır. Bu çalışmada 6−8 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar rehberlik yanı sıra metin üzerinde yorum için Bayan Soto, Dr Yu ve Dr Octeau teşekkür ederiz. Bu çalışma NS060677 tarafından desteklenir.
Materials
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher | SF 100-20 | An identical alternative can be used |
| Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane | Pall | 4692 | An identical alternative can be used |
| Ag/AgCl ground pellet | WPI | EP2 | A similar alternative can be used |
| Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L) | Thermo Scientific | A-11040 | A similar alternative can be used |
| Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Scientific | A27040 | A similar alternative can be used |
| Anti Aquaporin-4 antibody | Novus Biologicals | NBP1-87679 | A similar alternative can be used |
| Anti GFAP antibody | Abcam | ab4674 | A similar alternative can be used |
| Borosilicate glass pipettes with filament | World precision instruments | 1B150F-4 | |
| C57BL/6NTac mice | Taconic Stock | B6 | A similar alternative can be used |
| Calcium Chloride | Sigma | 21108 | An identical alternative can be used |
| Confocal laser-scanning microscope | Olympus | FV1000MPE | A similar alternative can be used |
| D-glucose | Sigma | G7528 | An identical alternative can be used |
| Disodium Phosphate | Sigma | 255793 | An identical alternative can be used |
| Electrode puller- Model P-97 | Sutter | P-97 | A similar alternative can be used |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | An identical alternative can be used |
| Heparin sodium injection (1,000 USP per mL) | Sagent Pharmaceuticals | 400-10 | An identical alternative can be used |
| Imaris software (Version 7.6.5) | Bitplane Inc. | A similar alternative can be used | |
| Isofluorane | Henry Schein Animal Health | 29404 | An identical alternative can be used |
| Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%) | Clipper | 1050035 | An identical alternative can be used |
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma | L0259 | |
| Lucifer Yellow CH dipotassium salt | Sigma | L0144 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | An identical alternative can be used |
| Microscope Cover Glass | Thermo Scientific | 24X60-1 | An identical alternative can be used |
| Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | An identical alternative can be used |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | An identical alternative can be used |
| Objective lens (40x) | Olympus | LUMPLFLN 40XW | A similar alternative can be used |
| Objective lens (60x) | Olympus | PlanAPO 60X | A similar alternative can be used |
| PBS tablets, 100 mL | VWR | VWRVE404 | An identical alternative can be used |
| Pipette micromanipulator- Model ROE-200 | Sutter | MP-285 / ROE-200 / MPC-200 | A similar alternative can be used |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911 | An identical alternative can be used |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | An identical alternative can be used |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | An identical alternative can be used |
| Stimulator- Model Omnical 2010 | World precision instruments | Omnical 2010 | A similar alternative can be used |
| Triton X 100 | Sigma | T8787 | An identical alternative can be used |
| Vibratome- Model #3000 | Pelco | 100-S | A similar alternative can be used |
References
- Khakh, B. S., Sofroniew, M. V. Diversity of astrocyte functions and phenotypes in neural circuits. Nature Neuroscience. 18 (7), 942-952 (2015).
- Ben Haim, L., Rowitch, D. H. Functional diversity of astrocytes in neural circuit regulation. Nature Reviews Neuroscience. 18 (1), 31-41 (2017).
- Schiweck, J., Eickholt, B. J., Murk, K. Important Shapeshifter: Mechanisms Allowing Astrocytes to Respond to the Changing Nervous System During Development, Injury and Disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 261 (2018).
- Chai, H., et al. Neural Circuit-Specialized Astrocytes: Transcriptomic, Proteomic, Morphological, and Functional Evidence. Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).
- Sun, D., Jakobs, T. C. Structural remodeling of astrocytes in the injured CNS. Neuroscientist. 18 (6), 567-588 (2012).
- Naskar, S., Chattarji, S. Stress Elicits Contrasting Effects on the Structure and Number of Astrocytes in the Amygdala versus Hippocampus. eNeuro. 6 (1), (2019).
- Sun, D., Lye-Barthel, M., Masland, R. H., Jakobs, T. C. The morphology and spatial arrangement of astrocytes in the optic nerve head of the mouse. Journal of Comparative Neurology. 516 (1), 1-19 (2009).
- Grosche, A., et al. Versatile and simple approach to determine astrocyte territories in mouse neocortex and hippocampus. PLoS ONE. 8 (7), 69143 (2013).
- Kaynig, V., et al. Large-scale automatic reconstruction of neuronal processes from electron microscopy images. Medical Image Analysis. 22 (1), 77-88 (2015).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
- Wilhelmsson, U., et al. Redefining the concept of reactive astrocytes as cells that remain within their unique domains upon reaction to injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17513-17518 (2006).
- Williams, M. E., et al. Cadherin-9 regulates synapse-specific differentiation in the developing hippocampus. Neuron. 71 (4), 640-655 (2011).
- Ogata, K., Kosaka, T. Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus. Neuroscience. 113 (1), 221-233 (2002).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Hubbard, J. A., Hsu, M. S., Seldin, M. M., Binder, D. K. Expression of the Astrocyte Water Channel Aquaporin-4 in the Mouse Brain. ASN Neuro. 7 (5), (2015).
- Benediktsson, A. M., et al. Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures. Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 41-53 (2005).
- Fouquet, C., et al. Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media. PLoS ONE. 10 (3), 0121096 (2015).
- Luna, G., et al. Astrocyte structural reactivity and plasticity in models of retinal detachment. Experimental Eye Research. 150, 4-21 (2016).
- Octeau, J. C., et al. An Optical Neuron-Astrocyte Proximity Assay at Synaptic Distance Scales. Neuron. 98 (1), 49-66 (2018).
- Sosunov, A. A., et al. Phenotypic heterogeneity and plasticity of isocortical and hippocampal astrocytes in the human brain. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2285-2298 (2014).
- Park, Y. M., et al. Astrocyte Specificity and Coverage of hGFAP-CreERT2 [Tg(GFAP-Cre/ERT2)13Kdmc] Mouse Line in Various Brain Regions. Experimental Neurobiology. 27 (6), 508-525 (2018).
- Koeppen, J., et al. Functional Consequences of Synapse Remodeling Following Astrocyte-Specific Regulation of Ephrin-B1 in the Adult Hippocampus. Journal of Neuroscience. 38 (25), 5710-5726 (2018).
- Jefferis, G. S., Livet, J. Sparse and combinatorial neuron labelling. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 101-110 (2012).
- Lanjakornsiripan, D., et al. Layer-specific morphological and molecular differences in neocortical astrocytes and their dependence on neuronal layers. Nature Communications. 9 (1), 1623 (2018).
