Visualizzazione della morfologia degli astrociti utilizzando Lucifero Giallo Iontoresis
Summary
Gli astrociti sono cellule morfologicamente complesse, esemplificate dai loro molteplici processi e territori cespugliosi. Per analizzare la loro morfologia elaborata, presentiamo un protocollo affidabile per eseguire iontoforesi gialla di Lucifero intracellulare in tessuto leggermente fissato.
Abstract
Gli astrociti sono componenti essenziali dei circuiti neurali. Tile tutto il sistema nervoso centrale (CNS) e sono coinvolti in una varietà di funzioni, che includono l’autorizzazione del neurotrasmettitore, regolazione iosse, modulazione sinaptica, supporto metabolico ai neuroni, e regolazione del flusso sanguigno. Gli astrociti sono cellule complesse che hanno un soma, diversi rami principali e numerosi processi fini che contattano diversi elementi cellulari all’interno del neuropil. Per valutare la morfologia degli astrociti, è necessario disporre di un metodo affidabile e riproducibile per visualizzare la loro struttura. Riportiamo un protocollo affidabile per eseguire iontoresi intracellulare di astrociti utilizzando colorante giallo Lucifero fluorescente (LY) nel tessuto cerebrale leggermente fissato da topi adulti. Questo metodo ha diverse caratteristiche che sono utili per caratterizzare la morfologia degli astrociti. Permette la ricostruzione tridimensionale dei singoli astrociti, utile per eseguire analisi morfologiche su diversi aspetti della loro struttura. L’immunohistochimica insieme alla iontoforesi LY può anche essere utilizzata per comprendere l’interazione degli astrociti con diversi componenti del sistema nervoso e per valutare l’espressione delle proteine all’interno degli astrociti etichettati. Questo protocollo può essere implementato in una varietà di modelli murini di disturbi del SNC per esaminare rigorosamente la morfologia degli astrociti con microscopia leggera. LY iontohoresis fornisce un approccio sperimentale per valutare la struttura degli astrociti, soprattutto nel contesto di lesioni o malattie in cui queste cellule sono proposte per subire cambiamenti morfologici significativi.
Introduction
Gli astrociti sono le cellule gliali più abbondanti nel sistema nervoso centrale (SNC). Essi svolgono ruoli in omeostasi iogeno, regolazione del flusso sanguigno, formazione di sinapsi così come l’eliminazione, e l’assorbimento del neurotrasmettitore1. L’ampia gamma di funzioni astrocite si riflette nella loro complessa struttura morfologica2,3. Gli astrociti contengono diversi rami primari e secondari che si dividono in migliaia di ramifici e volantini più sottili che interagiscono direttamente con sinapsi, dendriti, assoni, vasi sanguigni e altre cellule gliali. La morfologia degli astrociti varia tra diverse regioni del cervello, che possono suggerire la loro capacità di svolgere le loro funzioni in modo differenziale nei circuiti neuronali4. Inoltre, gli astrociti sono noti per alterare la loro morfologia durante lo sviluppo, durante le condizioni fisiologiche, e in più stati di malattia3,5,6.
È necessario un metodo coerente e riproducibile per risolvere con precisione la complessità della morfologia degli astrociti. Tradizionalmente, l’immunohistochimica è stata utilizzata per visualizzare gli astrociti con l’uso di marcatori proteici specifici o arricchiti di astrociti. Tuttavia, questi metodi rivelano il modello di espressione proteica piuttosto che la struttura dell’astrocito. I marcatori comunemente usati, come la proteina acida fibrillare gliale (GFAP) e la proteina legante del calcio S100 , non esprimono nell’intero volume cellulare e quindi non risolvono la morfologia completa7. Gli approcci genetici per esprimere onnipresenti proteine fluorescenti negli astrociti (iniezioni virali o linee di segnalazione di topi transgenici) possono identificare i rami più fini e il territorio generale. Tuttavia, è difficile distinguere gli astrociti individuali e le analisi possono essere di parte dalla popolazione di astrociti presa di mira dal promotore specifico8. La microscopia elettronica della sezione seriale è stata utilizzata per rivelare un quadro dettagliato delle interazioni dei processi astrociti con le sinapsi. A causa delle migliaia di processi astrociti che contattano le sinapsi, attualmente non è possibile ricostruire un’intera cella con questa tecnica9, anche se questo dovrebbe cambiare con l’uso di approcci di apprendimento automatico per l’analisi dei dati.
In questo rapporto, ci concentriamo su una procedura per caratterizzare gli astrociti del topo utilizzando la iontoresi intracellulare con colorante giallo Lucifero (LY), usando il radiato strato CA1 come esempio. Il metodo si basa sul lavoro passato pionieristico di Eric Bushong e Mark Ellisman10,11. Gli astrociti da fette di cervello leggermente fissate sono identificati dalla loro caratteristica forma di soma e riempiti con LY. Le cellule vengono poi immagini con microscopia confocale. Dimostriamo come la iontoresi LY possa essere usata per ricostruire singoli astrociti ed eseguire analisi morfologiche dettagliate dei loro processi e territori. Inoltre, questo metodo può essere applicato in combinazione con l’immunostochimica per identificare le relazioni spaziali e le interazioni tra astrociti e neuroni, altre cellule gliali e vascolatura cerebrale. Consideriamo LY iontoresis uno strumento molto adatto per analizzare la morfologia in diverse regioni del cervello e modelli murini di condizioni sane o malattie7,12,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo descritto in questo documento descrive un modo per visualizzare la morfologia degli astrociti utilizzando l’iontoresi intracellulare di LY dye in fette cerebrali leggermente fissate. Ci sono diversi fattori critici evidenziati in questo protocollo che contribuiscono al successo della iontoforesi LY e alla ricostruzione morfologica delle cellule. Un fattore è la qualità e la riproducibilità delle immagini, che è determinata in gran parte dall’età del topo e dal risultato della perfusione. In questo studio, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano la signora Soto, il dottor Yu e il dottor Octeau per la guida e i commenti sul testo. Questo lavoro è supportato da NS060677.
Materials
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher | SF 100-20 | An identical alternative can be used |
| Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane | Pall | 4692 | An identical alternative can be used |
| Ag/AgCl ground pellet | WPI | EP2 | A similar alternative can be used |
| Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L) | Thermo Scientific | A-11040 | A similar alternative can be used |
| Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Scientific | A27040 | A similar alternative can be used |
| Anti Aquaporin-4 antibody | Novus Biologicals | NBP1-87679 | A similar alternative can be used |
| Anti GFAP antibody | Abcam | ab4674 | A similar alternative can be used |
| Borosilicate glass pipettes with filament | World precision instruments | 1B150F-4 | |
| C57BL/6NTac mice | Taconic Stock | B6 | A similar alternative can be used |
| Calcium Chloride | Sigma | 21108 | An identical alternative can be used |
| Confocal laser-scanning microscope | Olympus | FV1000MPE | A similar alternative can be used |
| D-glucose | Sigma | G7528 | An identical alternative can be used |
| Disodium Phosphate | Sigma | 255793 | An identical alternative can be used |
| Electrode puller- Model P-97 | Sutter | P-97 | A similar alternative can be used |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | An identical alternative can be used |
| Heparin sodium injection (1,000 USP per mL) | Sagent Pharmaceuticals | 400-10 | An identical alternative can be used |
| Imaris software (Version 7.6.5) | Bitplane Inc. | A similar alternative can be used | |
| Isofluorane | Henry Schein Animal Health | 29404 | An identical alternative can be used |
| Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%) | Clipper | 1050035 | An identical alternative can be used |
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma | L0259 | |
| Lucifer Yellow CH dipotassium salt | Sigma | L0144 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | An identical alternative can be used |
| Microscope Cover Glass | Thermo Scientific | 24X60-1 | An identical alternative can be used |
| Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | An identical alternative can be used |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | An identical alternative can be used |
| Objective lens (40x) | Olympus | LUMPLFLN 40XW | A similar alternative can be used |
| Objective lens (60x) | Olympus | PlanAPO 60X | A similar alternative can be used |
| PBS tablets, 100 mL | VWR | VWRVE404 | An identical alternative can be used |
| Pipette micromanipulator- Model ROE-200 | Sutter | MP-285 / ROE-200 / MPC-200 | A similar alternative can be used |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911 | An identical alternative can be used |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | An identical alternative can be used |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | An identical alternative can be used |
| Stimulator- Model Omnical 2010 | World precision instruments | Omnical 2010 | A similar alternative can be used |
| Triton X 100 | Sigma | T8787 | An identical alternative can be used |
| Vibratome- Model #3000 | Pelco | 100-S | A similar alternative can be used |
References
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