Visualizando morfologia Astrocitante usando Lúcifer iontoforese amarela
Summary
Os astrócitos são células morfologicamente complexas, exemplificadas por seus múltiplos processos e territórios Bushy. Para analisar sua morfologia elaborada, apresentamos um protocolo confiável para a realização de iontoforese intracelular de Lúcifer amarelo em tecido levemente fixo.
Abstract
Os astrócitos são componentes essenciais dos circuitos neurais. Eles telha todo o sistema nervoso central (CNS) e estão envolvidos em uma variedade de funções, que incluem o afastamento do neurotransmissor, regulação de íons, modulação sináptica, suporte metabólico para neurônios, e regulação do fluxo sanguíneo. Os astrócitos são células complexas que têm um soma, vários ramos principais, e inúmeros processos finos que contatam diversos elementos celulares dentro do neuropil. A fim de avaliar a morfologia dos astrócitos, é necessário ter um método confiável e reprodutível para visualizar sua estrutura. Nós relatamos um protocolo de confiança para executar o iontoforese intracelular dos astrócitos usando a tintura fluorescente do amarelo de Lúcifer (ly) no tecido levemente fixo do cérebro dos ratos adultos. Este método tem diversas características que são úteis caracterizar a morfologia do astrocyte. Permite a reconstrução tridimensional de astrócitos individuais, o que é útil para realizar análises morfológicas em diferentes aspectos de sua estrutura. Immunohistochemistry junto com o iontoforese de ly pode igualmente ser utilizado para compreender a interação dos astrócitos com componentes diferentes do sistema nervoso e para avaliar a expressão das proteínas dentro dos astrócitos etiquetados. Este protocolo pode ser executado em uma variedade de modelos do rato de desordens do CNS para examinar rigorosa a morfologia do astrocyte com microscopia de luz. A iontoforese de LY fornece uma aproximação experimental para avaliar a estrutura do astrocyte, especial no contexto da lesão ou da doença onde estas pilhas são propor para submeter-se a mudanças morfológicas significativas.
Introduction
Os astrócitos são as células gliais mais abundantes no sistema nervoso central (SNC). Jogam papéis na homeostase do íon, na regulação do fluxo sanguíneo, na formação do sinapse assim como na eliminação, e na captação1do neurotransmissor. A vasta gama de funções do astrocyte é refletida em sua estrutura morfológica complexa2,3. Os astrócitos contêm vários ramos primários e secundários que se dividem em milhares de branchlets e folhetos mais finos que interagem diretamente com sinapses, dendritos, axônios, vasos sanguíneos e outras células gliais. A morfologia do astrocyte varia em diferentes regiões cerebrais, o que pode sugerir sua capacidade de desempenhar suas funções diferencialmente em circuitos neuronais4. Além disso, os astrócitos são conhecidos por alterarem sua morfologia durante o desenvolvimento, durante as condições fisiológicas, e em múltiplos estados de doença3,5,6.
Um método consistente, reprodutível é necessário para resolver com precisão a complexidade da morfologia do astrocyte. Tradicionalmente, a imunohistoquímica tem sido usada para visualizar os astrócitos com o uso de marcadores de proteínas enriquecidos astrocícitos ou astrocícitos. No entanto, esses métodos revelam o padrão de expressão protéica em vez da estrutura do astrocícito. Os marcadores comumente usados, como a proteína ácida fibrilhante glial (GFAP) e a proteína de ligação de cálcio S100 β (S100β), não expressam em todo o volume celular e, portanto, não resolvem a morfologia completa7. Abordagens genéticas para expressar proteínas fluorescentes onipresente em astrócitos (injeções virais ou linhas de repórter transgênica do mouse) podem identificar os ramos mais finos e o território geral. No entanto, é difícil diferenciar os astrócitos individuais, e as análises podem ser tendenciosas pela população de astrocícitos direcionada pelo promotor específico8. A microscopia de elétron da seção de série foi usada para revelar um retrato detalhado das interações de processos do astrocyte com sinapses. Devido aos milhares de processos de astrocyte em contato com sinapses, atualmente não é possível reconstruir uma célula inteira com essa técnica9, embora isso seja esperado para mudar com o uso de abordagens de aprendizado de máquina para análise de dados.
Neste relato, focamos em um procedimento para caracterizar astrócitos de camundongo usando iontoforese intracelular com corante amarelo de Lúcifer (LY), usando o radiatum de estrato CA1 como exemplo. O método é baseado no trabalho pioneiro passado por Eric Bushong e Mark Ellisman10,11. Os astrocytes de fatias levemente fixas do cérebro são identificados por sua forma distintiva do soma e enchido com o LY. As células são então imaged com microscopia confocal. Nós demonstramos como a iontoforese de ly pode ser usada para reconstruir astrócitos individuais e para executar análises morfológicas detalhadas de seus processos e território. Também, este método pode ser aplicado conjuntamente com immunohistochemistry para identificar relações espaciais e interações entre astrócitos e neurônios, outras pilhas glial, e vasculature do cérebro. Consideramos que a iontoforese é uma ferramenta muito adequada para analisar a morfologia em diferentes regiões cerebrais e modelos de camundongo de condições saudáveis ou de doença7,12,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método esboçado neste papel descreve uma maneira de visualizar a morfologia do astrocyte usando o iontoforese intracelular do corante de ly em fatias levemente fixas do cérebro. Existem vários fatores críticos destacados neste protocolo que contribuem para a bem sucedida iontoforese e reconstrução morfológica das células. Um fator é a qualidade e reprodutibilidade das imagens, que é determinada em grande parte pela idade do rato e o resultado da perfusão. Neste estudo, foram utilizados camundongos C57/BL6N …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem a Sra. Soto, o Dr. Yu, e o Dr. Octeau por orientação, bem como comentários sobre o texto. Este trabalho é apoiado por NS060677.
Materials
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher | SF 100-20 | An identical alternative can be used |
| Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane | Pall | 4692 | An identical alternative can be used |
| Ag/AgCl ground pellet | WPI | EP2 | A similar alternative can be used |
| Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L) | Thermo Scientific | A-11040 | A similar alternative can be used |
| Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Scientific | A27040 | A similar alternative can be used |
| Anti Aquaporin-4 antibody | Novus Biologicals | NBP1-87679 | A similar alternative can be used |
| Anti GFAP antibody | Abcam | ab4674 | A similar alternative can be used |
| Borosilicate glass pipettes with filament | World precision instruments | 1B150F-4 | |
| C57BL/6NTac mice | Taconic Stock | B6 | A similar alternative can be used |
| Calcium Chloride | Sigma | 21108 | An identical alternative can be used |
| Confocal laser-scanning microscope | Olympus | FV1000MPE | A similar alternative can be used |
| D-glucose | Sigma | G7528 | An identical alternative can be used |
| Disodium Phosphate | Sigma | 255793 | An identical alternative can be used |
| Electrode puller- Model P-97 | Sutter | P-97 | A similar alternative can be used |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | An identical alternative can be used |
| Heparin sodium injection (1,000 USP per mL) | Sagent Pharmaceuticals | 400-10 | An identical alternative can be used |
| Imaris software (Version 7.6.5) | Bitplane Inc. | A similar alternative can be used | |
| Isofluorane | Henry Schein Animal Health | 29404 | An identical alternative can be used |
| Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%) | Clipper | 1050035 | An identical alternative can be used |
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma | L0259 | |
| Lucifer Yellow CH dipotassium salt | Sigma | L0144 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | An identical alternative can be used |
| Microscope Cover Glass | Thermo Scientific | 24X60-1 | An identical alternative can be used |
| Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | An identical alternative can be used |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | An identical alternative can be used |
| Objective lens (40x) | Olympus | LUMPLFLN 40XW | A similar alternative can be used |
| Objective lens (60x) | Olympus | PlanAPO 60X | A similar alternative can be used |
| PBS tablets, 100 mL | VWR | VWRVE404 | An identical alternative can be used |
| Pipette micromanipulator- Model ROE-200 | Sutter | MP-285 / ROE-200 / MPC-200 | A similar alternative can be used |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911 | An identical alternative can be used |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | An identical alternative can be used |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | An identical alternative can be used |
| Stimulator- Model Omnical 2010 | World precision instruments | Omnical 2010 | A similar alternative can be used |
| Triton X 100 | Sigma | T8787 | An identical alternative can be used |
| Vibratome- Model #3000 | Pelco | 100-S | A similar alternative can be used |
References
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