JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Uyuşturucu Yüklü Lipozomenjekte ederek Larva Zebra balığı Makrofajlarına Yönelik İlaçların Hedeflenmesi

Published: February 18, 2020
doi:
10.3791/60198
, , , , ,
1Department of Molecular Medicine and Pathology, Faculty of Medical and Health Sciences,University of Auckland, 2School of Pharmacy, Faculty of Medical and Health Sciences,University of Auckland, 3School of Medicine, Faculty of Medical and Health Sciences,University of Auckland

Summary

Burada, makrofaj-soy hücrelerine ilaç dağıtımını hedeflemek amacıyla ilaç yüklü lipozomların ve bunların mikroenjeksiyonunun larva zebra balığına sentezini anlatıyoruz.

Abstract

Zebra balığı(Danio rerio)larvaları, konak-patojen etkileşimlerini ve doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin fonksiyonel olarak korunmuş doğuştan gelen bağışıklık sistemi nedeniyle inflamatuar hastalıklara olan katkısını araştırmak için popüler bir model haline gelmiştir. Onlar da yaygın olarak nasıl doğuştan bağışıklık hücreleri gelişimsel süreçleri rehberlik yardımcı incelemek için kullanılır. Larva zebra balıklarının optik saydamlığı ndan ve genetik yollabilirliğinden yararlanarak, bu çalışmalar genellikle bozulmamış hayvanlarda floresan olarak işaretlenmiş makrofajları ve nötrofilleri işlevsel olarak karakterize etmek için canlı görüntüleme yaklaşımlarına odaklanmıştır. Çeşitli fonksiyonel heterojenlikleri ve hastalık patogenezinde sürekli genişleyen rolleri nedeniyle makrofajlar büyük ilgi gördü. Genetik manipülasyonlara ek olarak, larva zebra balıklarında makrofaj davranışını manipüle etmek ve incelemek için kimyasal müdahaleler de rutin olarak kullanılmaktadır. Bu ilaçların teslimi genellikle doğrudan daldırma veya mikroenjeksiyon yoluyla serbest ilaç pasif hedefleme ile sınırlıdır. Bu yaklaşımlar makrofaj davranışıherhangi bir değişiklik makrofajlar kendileri üzerinde ilacın doğrudan bir etkisi sonucu olduğu varsayımına dayanır, ve başka bir hücre tipi üzerinde doğrudan bir etkisi bir downstream sonucu değil. Burada, ilaç yüklü floresan lipozomları mikroenjekte ederek özellikle larva zebra balığı makrofajlarına yönelik ilaç hedefleme protokollerimizi sıyoruz. Poloxamer 188 modifiye edilmiş uyuşturucu yüklü mavi floresan lipozomların nötrofiller tarafından değil, makrofajlar tarafından kolayca ele alındığını ortaya koyuyoruz. Ayrıca, bu şekilde teslim edilen ilaçların makrofaj aktivitesini ilacın etki mekanizmasına uygun bir şekilde etkilayabileceğine dair kanıtlar salıyoruz. Bu teknik, ilaçların makrofajlara hedef olmasını sağlamak isteyen ve ilaçların daldırma gibi geleneksel yöntemlerle teslim edilemeyecek kadar toksik olduğu araştırmacılar için değerli olacaktır.

Introduction

Mononükleer fagosit sistemi işgalci patojenlere karşı ilk savunma hattını sağlar. Bu sistem monositler, monosit türetilmiş dendritik hücreler ve makrofajlardan oluşur, bu da aktif olarak yabancı patojenleri fagositata, böylece patojen yayılımını sınırlandırır. Bu fagositik ve mikrobisidal efektör fonksiyonlarına ek olarak, dendritik hücreler ve makrofajlar da adaptif bağışıklıksisteminietkinleştirmek için sitokin üretimi ve antijen sunumu yeteneğine sahiptir1. Bu hücrelerin, makrofajlar çeşitli fonksiyonel heterojenlik ve birden fazla inflamatuar hastalıklara tutulum nedeniyle özellikle dikkat almış, otoimmünite ve bulaşıcı hastalıklarkanser2,3,4,5,6,7. Makrofajların plastisite ve işlevsel doku ortamına ihtiyaçlarına uyum yeteneği doğrudan gözlemlemek ve vivo bu hücreleri sorgulamak için deneysel yaklaşımlar gerektirir.

Larva zebra balığı, in vivo8’dekimakrofajların işlevini ve plastisitesini incelemek için ideal bir model organizmadır. Larva zebra balığının optik saydamlığı, özellikle makrofaj işaretleme transgenik muhabir çizgileri ile birleştiğinde makrofajların davranışını doğrudan gözlemlemek için bir pencere sağlar. Larva zebra balığının canlı görüntülemepotansiyelinden ve deneysel traktörden yararlanılabilmek, insan hastalığı9,10 ,11,12,13,14,15ile doğrudan ilgisi olan makrofaj fonksiyonuna dair birçok önemli içgörüye yol açmıştır. Bu çalışmaların çoğu da zebra balığı uyuşturucu aktivitesinin yüksek koruma yararlanmış (bir bütün hayvan ilacı keşif platformu olarak kullanımını destekleyen bir özellik16,17,18), farmakolojik makrofaj fonksiyonu işlemek için kimyasal müdahaleler kullanarak. Bugüne kadar, bu farmakolojik tedaviler çoğunlukla daldırma yoluyla teslim edilmiştir, hangi ilacın suda çözünür olmasını gerektirir, ya da serbest ilaç doğrudan mikroenjeksiyon(Şekil 1A). Bu pasif teslimat stratejilerinin sınırlamaları, makrofaj fonksiyonu üzerindeki herhangi bir etkinin değerlendirilmesini engelleyebilecek hedef dışı etkileri ve genel toksisiteyi içerir. Ayrıca, makrofajlar üzerindeki ilaç etkilerini araştırırken ilaçların makrofajlar üzerinde mi yoksa daha dolaylı mekanizmalar aracılığıyla mı hareket ettiğini niçin etkilediği bilinmemektedir. Makrofaj fonksiyonunu araştırmak için benzer kimyasal müdahale çalışmaları yaparken, özellikle makrofajlara yönelik ilaçları hedeflemek için ucuz ve basit bir teslimat yöntemi geliştirme ihtiyacı olduğunu fark ettik.

Lipozomlar mikroskobik, biyouyumlu, proteinleri, nükleotitleri ve ilaç kargosulate olabilir lipid çift katmanlı veziküllervardır 19. Lipozomların unilamellar veya multilamellar lipid çift katmanlı yapısı suda çözünen ilaçların dahil edilebildiği sulu bir iç lümen oluştururken, hidrofobik ilaçlar lipid membranlarına entegre edilebilir. Buna ek olarak, lipozomların fizikokimyasal özellikleri, boyut, yük ve yüzey modifikasyonları da dahil olmak üzere belirli hücrelere kendi hedefleme terzi için manipüle edilebilir20,21. Lipozomların bu özellikleri onları ilaç teslim etmek ve mevcut tedavi rejimleri20hassasiyetini artırmak için cazip bir araç yaptık. Lipozomlar doğal olarak makrofajlar tarafından fagositozlu olduğundan (özellikle ablasyon deneyleri için makrofajlara clodronat tesliminde rutin kullanımları tarafından kullanılan bir özellik22), makrofajlara özgü ilaç dağıtımı için cazip bir seçenek olarak sunarlar (Şekil 1B).

Bu protokol, hidrofilik polimer poloxamer 188 ile kaplanmış mavi floresan lipozomlar içine ilaçların formülasyonu açıklar, bu lipozom yüzeyinde koruyucu bir tabaka oluşturur ve ilaç tutma geliştirmek için gösterilmiştir ve üstün biyouyumlulukvar 23. Poloxamer, önceki araştırmalarımızda polietilen glikol modifiye lipozomlarla karşılaştırıldığında, poloksamer modifiye lipozomların, intravenöz infüzyonu takiben tavşanlarda sıçan pençelerinin ve benzeri farmakokinetiklerin deri altı enjeksiyonu sonrasında daha iyi biyouyumluluk gösterdiğini gösterdiği gibi lipozomların yüzey kaplaması için seçilmiştir23. Protokoller ayrıca larva zebra balığına mikroenjeksiyon ve canlı görüntüleme ile makrofaj hedefleme yeteneklerini ve lipozom yıkımı ve sitoplazmik ilaç teslimatı için gerekli hücre içi kompartmanlara lokalizasyonlarını değerlendirmek için tanımlanmıştır. Bir kanıtı-of-kavram olarak daha önce akut gut iltihabı bir larva zebrabalığı modelinde aktivasyon bastırmak için makrofajlar için iki ilaç hedef için bu tekniği kullandık24. Bu ilaç dağıtım tekniği, ilgi çekici ilaçların makrofaj hedefleme sağlamak isteyen zebra balığı araştırmacıları için mevcut kimyasal “araç” genişletir.

Protocol

1. İlaç yüklü Marina Mavi etiketli Lipozomların hazırlanması NOT: Mavi floresan boya, Marina Blue ve ilaç taşıyan lipozomlar poloxamer 188 post ekleme ile ince bir film hidrasyon yöntemi kullanılarak hazırlanır. Aksi belirtilmedikçe tüm işlemler oda sıcaklığında gerçekleştirilir. Kontrol lipozomları sadece Marina mavisi ve PBS taşır. Buradaki örnekte, lipozomların mitokondri hedefleyen antioksidan ilaç25 ile yüklenmesi, temsili sonuçlarda ku…

Representative Results

Floresan lipozomların hazırlanmasında açıklanan ince film hidrasyon yaklaşımı basit ve uygun maliyetli bir yöntemdir. Bu çalışmada kullanılan protokol ile lipozomların unilamellar23,24olması beklenmektedir. Üretilen lipozomların büyüklüğü, zeta potansiyeli, ilaç yüklemesi ve tuzak etkinliği Tablo 1’deözetlenmiştir. Lipozomların partikül boyutu (ilaç yüklemesinden önce ve sonra) benzerdir(Tablo 1). …

Discussion

Burada, larva zebra balıklarında özellikle makrofajları hedef almak için ilaç yüklü lipozomlar formüle etmek için ayrıntılı bir protokol sağladık. Bu yöntem, özellikle makrofajlara doğrudan hedeflenen ilaç teslimini sağlayarak bazı hastalık modellerinde makrofajların rolünü incelemek için kullanılabilir. Ayrıca, ilaçların genel toksisitesi daldırma gibi daha geleneksel yollar tarafından teslim edildiğinde kullanımını sınırlar zaman kullanılabilir. Burada açıklanan protokol larva z…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma, C.J.H. (Yeni Zelanda Sağlık Araştırma Konseyi ve Marsden Fonu, Yeni Zelanda Kraliyet Cemiyeti) ve Z.W.’ye (Auckland Üniversitesi’nden Fakülte Araştırma Geliştirme Fonu) verilen hibeler ile desteklenmiştir. Yazarlar zebra balığı tesisi uzman yönetimi için Alhad Mahagaonkar teşekkür, Biyomedikal Görüntüleme Araştırma Birimi, Tıp Bilimleri Fakültesi, Auckland Üniversitesi konfokal görüntüleme ve Graham Lieschke ile yardım için Tg hediye için (mpeg1:EGFP) muhabir hattı.

Materials

1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) Avanti Polar Lipids, Inc. 850355P
1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE) Avanti Polar Lipids, Inc. 850367P
1.0 µm Whatman Nuclepore Track-Etched polycarbonate membranes GE Healthcare Life Sciences 110610
25 mL round-bottom flask Sigma-Aldrich Z278262
35 mm culture dish Thermo Scientific 150460
Acetonitrile Sigma-Aldrich 34998
Agilent 1260 Infinity Diode Array Detector Agilent Technologies G4212B
Agilent 1260 Infinity Quaternary Pump Agilent Technologies G1311B
Agilent 1290 Infinity Series Thermostat Agilent Technologies G1330B
Avanti mini-extruder Avanti Polar Lipids Inc. Avanti Polar Lipids Inc.
borosilicate microinjection needles Warner Instruments 203-776-0664
CaCl2 Sigma-Aldrich C4901-100G
cholesterol Sigma-Aldrich C8667
Dumont No.5 fine tip forceps Fine Science Tools 11251-10
Eppendorf Microloader pipette tip Eppendorf 5242956003
Eppendorf SmartBlock 1.5 mL, thermoblock for 24 reaction vessels Eppendorf 4053-6038
eyelash manipulator Ted Pella Inc. 113
hemocytometer Hawksley BS.748
HEPES BDH Chemicals 441474J
HPLC system Agilent Technologies 1260 series HPLC system
KCl Sigma-Aldrich P9541-1KG
low melting point agarose Invitrogen 16520-100
LysoTracker Deep Red Invitrogen L12492 1 mM stock solution in DMSO, keep at -20 °C and protect from light.
LysoTracker Deep Red Thermo Scientific L12492
magnetic stand Narishige GJ-1
Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE) Invitrogen M12652 Keep at -20 °C and protect from light.
Methanol Sigma-Aldrich 34860
methyl cellulose Sigma-Aldrich M0387-500G
methylene blue Alfa Aesar 42771
MgSO4 Sigma-Aldrich 230391-500G
micromanipulator Narishige M-152
mineral oil Sigma-Aldrich M-3516
Mitochondria-targeting antioxidant MitoTEMPO Sigma-Aldrich SML0737
MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator Thermo Scientific M36008
MitoTEMPO Sigma-Aldrich SML0737 Keep at -20 °C and protect from light.
N-Phenylthiourea (PTU) Sigma-Aldrich P7629-10G Take care when handling, toxic.
NaCl BDH Chemicals 27810.295
PBS (pH 7.4) Gibco 10010-023
Petri dish (100 mm x 20 mm) Corning Inc. 430167
Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4.6 mm column Phenomenex 00G-4439-E0
pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate Thermo Scientific P35361
pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate Invitrogen P35361 Keep at -20 °C and protect from light. Make 1 mg/mL stock solution by dissolving 2 mg lyophilized product in 2 mL of PBS supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4.
plastic transfer pipette Medi'Ray RL200C
poloxamer 188 BASF Corporation
pressure injector Applied Scientific Instruments MPPI-2
rotary evaporator Büchi, Flawil, Switzerland Büchi R-215 Rotavapor
Scanning confocal microscope Olympus Olympus FV1000 FluoView
Sorvall WX+ Ultracentrifuge Thermo Scientific 75000090
stereomicroscope Leica MZ12
Tricaine Sigma-Aldrich A5040-25G Make 4 mg/mL stock solution (in deionzed H2O) and keep at -20 °C.
triton-X100 Sigma-Aldrich X100-100ML
Ultrasonic bath Thermo Scientific FB-11205
Volocity Image Analysis Software PerkinElmer version 6.3
water bath
Zetasizer Nano Malvern Instruments Ltd Zetasizer Nano ZS ZEN 3600
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).
  2. Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
  3. Krenkel, O., Tacke, F. Liver macrophages in tissue homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 17 (5), 306-321 (2017).
  4. Alderton, G. K. Tumour immunology: turning macrophages on, off and on again. Nature Reviews Immunology. 14 (3), 136-137 (2014).
  5. Moore, K. J., Sheedy, F. J., Fisher, E. A. Macrophages in atherosclerosis: a dynamic balance. Nature Reviews Immunology. 13 (10), 709-721 (2013).
  6. Lawrence, T., Natoli, G. Transcriptional regulation of macrophage polarization: enabling diversity with identity. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 750-761 (2011).
  7. Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P. Macrophage-mediated inflammation in metabolic disease. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 738-749 (2011).
  8. Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity. Disease models and mechanisms. 5 (1), 38-47 (2012).
  9. Hall, C. J., et al. Immunoresponsive gene 1 augments bactericidal activity of macrophage-lineage cells by regulating beta-oxidation-dependent mitochondrial ROS production. Cell Metabolism. 18 (2), 265-278 (2013).
  10. Hall, C. J., et al. Blocking fatty acid-fueled mROS production within macrophages alleviates acute gouty inflammation. Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 1752-1771 (2018).
  11. Cambier, C. J., et al. Mycobacteria manipulate macrophage recruitment through coordinated use of membrane lipids. Nature. 505 (7482), 218-222 (2014).
  12. Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  13. Madigan, C. A., et al. A Macrophage Response to Mycobacterium leprae Phenolic Glycolipid Initiates Nerve Damage in Leprosy. Cell. 170 (5), 973-985 (2017).
  14. Tobin, D. M., et al. The lta4h locus modulates susceptibility to mycobacterial infection in zebrafish and humans. Cell. 140 (5), 717-730 (2010).
  15. Volkman, H. E., et al. Tuberculous granuloma induction via interaction of a bacterial secreted protein with host epithelium. Science. 327 (5964), 466-469 (2010).
  16. Bowman, T. V., Zon, L. I. Swimming into the future of drug discovery: in vivo chemical screens in zebrafish. ACS Chemical Biology. 5 (2), 159-161 (2010).
  17. Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. Chemical genetic screening in the zebrafish embryo. Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).
  18. Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
  19. Malam, Y., Loizidou, M., Seifalian, A. M. Liposomes and nanoparticles: nanosized vehicles for drug delivery in cancer. Trends in Pharmacological Sciences. 30 (11), 592-599 (2009).
  20. Torchilin, V. P. Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (2), 145-160 (2005).
  21. Immordino, M. L., Dosio, F., Cattel, L. Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential. International Journal of Nanomedicine. 1 (3), 297-315 (2006).
  22. Astin, J. W., et al. Innate immune cells and bacterial infection in zebrafish. Methods in Cell Biology. 138, 31-60 (2017).
  23. Zhang, W., et al. Post-insertion of poloxamer 188 strengthened liposomal membrane and reduced drug irritancy and in vivo precipitation, superior to PEGylation. Journal of Controlled Release. 203, 161-169 (2015).
  24. Wu, Z., et al. Liposome-Mediated Drug Delivery in Larval Zebrafish to Manipulate Macrophage Function. Zebrafish. 16 (2), 171-181 (2019).
  25. Cader, M. Z., et al. C13orf31 (FAMIN) is a central regulator of immunometabolic function. Nature Immunology. 17 (9), 1046-1056 (2016).
  26. Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. Influence of particle size on drug delivery to rat alveolar macrophages following pulmonary administration of ciprofloxacin incorporated into liposomes. Journal of Drug Targeting. 14 (8), 557-566 (2006).
  27. Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. Uptake characteristics of liposomes by rat alveolar macrophages: influence of particle size and surface mannose modification. Journal of Pharmact and Pharmacology. 59 (1), 75-80 (2007).
  28. Chono, S., Tauchi, Y., Morimoto, K. Influence of particle size on the distributions of liposomes to atherosclerotic lesions in mice. Drug Development and Industrial Pharmacy. 32 (1), 125-135 (2006).
  29. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).
  30. Hall, C., Flores, M. V., Crosier, K., Crosier, P. Live cell imaging of zebrafish leukocytes. Methods in Molecular Biology. 546, 255-271 (2009).
  31. Kapellos, T. S., et al. A novel real time imaging platform to quantify macrophage phagocytosis. Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).
  32. Shen, K., Sidik, H., Talbot, W. S. The Rag-Ragulator Complex Regulates Lysosome Function and Phagocytic Flux in Microglia. Cell Reports. 14 (3), 547-559 (2016).
  33. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), 49-56 (2011).
  34. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
  35. Ahsan, F., Rivas, I. P., Khan, M. A., Torres Suarez, A. I. Targeting to macrophages: role of physicochemical properties of particulate carriers–liposomes and microspheres–on the phagocytosis by macrophages. Journal of Controlled Release. 79 (1-3), 29-40 (2002).
  36. Martin, W. J., Walton, M., Harper, J. Resident macrophages initiating and driving inflammation in a monosodium urate monohydrate crystal-induced murine peritoneal model of acute gout. Arthritis and Rheumatology. 60 (1), 281-289 (2009).
  37. Faires, J. S., McCarty, D. J. Acute arthritis in man and dog after intrasynovial injection of sodium urate crystals. Lancet. 280, 682-685 (1962).
  38. Martin, W. J., Harper, J. L. Innate inflammation and resolution in acute gout. Immunology and Cell Biology. 88 (1), 15-19 (2010).
  39. Fenaroli, F., et al. Nanoparticles as drug delivery system against tuberculosis in zebrafish embryos: direct visualization and treatment. ACS Nano. 8 (7), 7014-7026 (2014).
  40. Robertson, J. D., Ward, J. R., Avila-Olias, M., Battaglia, G., Renshaw, S. A. Targeting Neutrophilic Inflammation Using Polymersome-Mediated Cellular Delivery. Journal of Immunology. 198 (9), 3596-3604 (2017).
  41. Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio). International Journal of Developmental Biology. 48 (2-3), 217-231 (2004).
  42. Kelly, C., Jefferies, C., Cryan, S. A. Targeted liposomal drug delivery to monocytes and macrophages. Journal of Drug Delivery. 2011, 727241 (2011).
  43. Fidler, I. J., et al. Design of liposomes to improve delivery of macrophage-augmenting agents to alveolar macrophages. Cancer Research. 40 (12), 4460-4466 (1980).
  44. Ng, A. N., et al. Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis. Developmenal Biology. 286 (1), 114-135 (2005).

Tags

LiposomesMacrophagesZebrafishDrug DeliveryMitochondrial Reactive Oxygen SpeciesPoloxamer 188ExtrusionUltracentrifugationLive Cell Imaging

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Linnerz, T., Kanamala, M., Astin, J. W., Dalbeth, N., Wu, Z., Hall, C. J. Targeting Drugs to Larval Zebrafish Macrophages by Injecting Drug-Loaded Liposomes. J. Vis. Exp. (156), e60198, doi:10.3791/60198 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image