هنا ، نصف تركيب الليبوزومات المحملة بالأدوية وحقنها المجهري في سمك حمار وحشي اليرقات لغرض استهداف إيصال الدواء إلى خلايا النسب الضامة.
وقد تطورت اليرقات حمار وحشي(Danio rerio)إلى نموذج شعبي للتحقيق في تفاعلات الممرض المضيف ومساهمة الخلايا المناعية الفطرية في الأمراض الالتهابية بسبب نظام المناعة الفطري المحفوظة وظيفيا. كما أنها تستخدم على نطاق واسع لدراسة كيفية تساعد الخلايا المناعية الفطرية في توجيه عمليات النمو. من خلال الاستفادة من الشفافية البصرية وقابلية الوراثة لسمك اليرقان، تركز هذه الدراسات في كثير من الأحيان على أساليب التصوير الحي لتوصيف الكلمة والالعدلات الموسومة بشكل وظيفي داخل الحيوانات السليمة. ونظراً لتغايريتها الوظيفية المتنوعة وأدوارها المتزايدة باستمرار في الإمراض المرضي، فقد حظيت الضامة باهتمام كبير. بالإضافة إلى التلاعب الجيني، تستخدم التدخلات الكيميائية الآن بشكل روتيني للتلاعب ودراسة سلوك الضامة في سمك الحمار الوحشي اليرقات. يقتصر تسليم هذه الأدوية عادة على الاستهداف السلبي للدواء المجاني من خلال الغمر المباشر أو الحقن المجهري. تعتمد هذه الأساليب على افتراض أن أي تغييرات في سلوك الضامة هي نتيجة لتأثير مباشر للدواء على الضامة نفسها ، وليس نتيجة المصب للتأثير المباشر على نوع خلية أخرى. هنا ، نقدم بروتوكولاتنا لاستهداف الأدوية على وجه التحديد لالضهاض حمار وحشي اليرقات عن طريق حقن المواد الفلورية المحملة بالأدوية. نكشف أن poloxamer 188 معدلة المخدرات محملة الدهون الزرقاء الفلورسنت يتم تناولها بسهولة من قبل الضامة، وليس من قبل العدلات. كما نقدم أدلة على أن الأدوية التي يتم تسليمها بهذه الطريقة يمكن أن تؤثر على نشاط الضامة بطريقة تتسق مع آلية عمل الدواء. وستكون هذه التقنية ذات قيمة للباحثين الراغبين في ضمان استهداف الأدوية للضامة وعندما تكون الأدوية سامة للغاية بحيث لا يمكن تسليمها بالطرق التقليدية مثل الغمر.
يوفر نظام البلعوم أحادي النواة خط دفاع أول ضد مسببات الأمراض الغازية. يتكون هذا النظام من الخلايا الأحادية والخلايا التشجرات المشتقة من الأحادية والضامة ، والتي تقوم بنشاط ببلع مسببات الأمراض الأجنبية ، وبالتالي الحد من انتشار مسببات الأمراض. بالإضافة إلى هذه وظائف المنفطي ة وmicrobicidal effector ، والخلايا التشجرة والضامة هي أيضا قادرة على إنتاج السيتوكين ومستضد العرض لتنشيط نظام المناعة التكيفي1. من هذه الخلايا ، تلقت الضامة اهتمامًا خاصًا نظرًا لتغايريتها الوظيفية المتنوعة ومشاركتها في أمراض التهابية متعددة ، من المناعة الذاتية والأمراض المعدية إلى السرطان2،3،4،5،6. إن لدونة الضامة وقدرتها على التكيف وظيفياً مع الاحتياجات إلى بيئة الأنسجة الخاصة بها تتطلب اتباع نهج تجريبية لمراقبة هذه الخلايا واستجوابها مباشرة في الجسم الحي.
حمار وحشي اليرقات هي كائن مثالي نموذجي لدراسة وظيفة واللدونة من الضامة في الجسم الحي8. توفر الشفافية البصرية لسمك الحمار الوحشي اليرقاني نافذة لمراقبة سلوك الضامة مباشرة ، خاصة عندما تقترن بخطوط المراسل المعدلة وراثياً التي تميز الضامة. وقد أدى استغلال إمكانات التصوير الحي وtractability التجريبية من حمار وحشي اليرقات إلى العديد من الأفكار الهامة في وظيفة الضامة التي لها صلة مباشرة بمرض الإنسان9،10،11،12،13،14،15. وقد استفادت العديد من هذه الدراسات أيضا من الحفاظ على ارتفاع نشاط المخدرات في حمار وحشي (السمة التي تدعم استخدامها كمنصة اكتشاف المخدرات الحيوانية كله16،17،18)، من خلال استخدام التدخلات الكيميائية للتلاعب الدوائي وظيفة الضامة. حتى الآن ، تم تسليم هذه العلاجات الدوائية في الغالب إما عن طريق الغمر ، مما يتطلب أن يكون الدواء قابلًا للذوبان في الماء ، أو عن طريق الحقن المجهري المباشر للدواء المجاني(الشكل 1A). وتشمل القيود المفروضة على استراتيجيات التسليم السلبية هذه الآثار غير المستهدفة والسمية العامة التي قد تحول دون تقييم أي تأثير على وظيفة الضامة. بالإضافة إلى ذلك ، عند التحقيق في آثار المخدرات على الضامة ، من غير المعروف ما إذا كانت الأدوية تعمل على الضامة نفسها أو من خلال آليات غير مباشرة. عند إجراء دراسات تدخل كيميائي مماثلة للتحقيق في وظيفة الضامة، أدركنا أن هناك حاجة غير ملباة لتطوير طريقة إيصال غير مكلفة ومباشرة لاستهداف الأدوية على وجه التحديد إلى الضامة.
الليبوزومات هي مجهرية، متوافقة بيولوجيا، الحويصلات ثنائية الطبقات الدهون التي يمكن أن تغلف البروتينات والنيوكليوتيدات والبضائع المخدرات19. يشكل هيكل أحادي اللاميلار أو متعدد اللاميلار من الدهون ثنائية الطبقة من الليبوزومات تجويفًا داخليًا مائيًا حيث يمكن دمج الأدوية القابلة للذوبان في الماء بينما يمكن دمج الأدوية الكارهة للماء في أغشية الدهون. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن التلاعب بالخصائص الفيزيائية الكيميائية للدهون ، بما في ذلك الحجم والشحن والتعديلات السطحية لتفصيل استهدافها لخلايا محددة20،21. وقد جعلت هذه الميزات من الليبوزومات لهم وسيلة جذابة لتقديم الأدوية وتعزيز دقة نظم العلاج الحالية20. كما هي phagocytozed الليبوزومات بطبيعة الحال من قبل الضامة (ميزة استغلالها من قبل استخدامها الروتيني في تقديم كلودروناتي خصيصا لmacrophages لتجارب الاستئصال22),أنها تقدم كخيار جذاب لتسليم المخدرات الضامة محددة(الشكل 1B).
يصف هذا البروتوكول صياغة الأدوية إلى الليبوزومات الفلورية الزرقاء المغلفة بالبوليمر المائي poloxamer 188 ، التي تشكل طبقة واقية على سطح liposome وقد ثبت أنها تعزز الاحتفاظ بالأدوية ولها توافق حيوي فائق23. تم اختيار Poloxamer لطلاء سطح الليبوزومات كما أظهرت أبحاثنا السابقة أنه ، بالمقارنة مع الليبوزومات المعدلة من البولي إيثيلين ، أظهرت الليبوزومات المعدلة بولوكعامين توافقًا حيويًا أفضل بعد حقن الكفوف تحت الجلد من الكفوف الفئران والعقاقير المماثلة في الأرانب بعد التسريب الوريدي23. كما يتم وصف البروتوكولات للحقن المجهري في حمار وحشي اليرقات والتصوير الحي لتقييم قدرتها على استهداف الضامة وتوطينها إلى المقصورات داخل الخلايا اللازمة لتدهور الدهون وإيصال الأدوية السيتوبلازمية. كدليل على مفهوم استخدمنا سابقا هذه التقنية لاستهداف اثنين من الأدوية إلى الضامة لقمع تفعيلها في نموذج حمار وحشي اليرقات من التهاب النقرس الحاد24. هذه التقنية تسليم المخدرات يوسع “مجموعة الأدوات” الكيميائية المتاحة للباحثين حمار وحشي الراغبين في ضمان الضامة المستهدفة من الأدوية ذات الأهمية.
هنا، قدمنا بروتوكول مفصل لصياغة الليبوزومات المحملة بالمخدرات لاستهداف الضامة على وجه التحديد في سمك اليرقات. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتشريح دور الضامة في نماذج معينة من الأمراض عن طريق ضمان التسليم المباشر المستهدف للأدوية على وجه التحديد إلى الضامة. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدامه عن?…
The authors have nothing to disclose.
وقد تم دعم هذا العمل بمنح قُدّمإليها إلى مجلس البحوث الصحية في نيوزيلندا وصندوق مارسدن، والجمعية الملكية لنيوزيلندا) ومؤسسة Z.W. (صندوق تطوير بحوث أعضاء هيئة التدريس من جامعة أوكلاند). يشكر المؤلفون الهاد ماهاغونكار على إدارة الخبراء لمرفق الحمار الوحشي ، ووحدة أبحاث التصوير الطبي الحيوي ، وكلية العلوم الطبية ، وجامعة أوكلاند للمساعدة في التصوير البؤري وغراهام Lieschke لإهداء Tg (mpeg1:EGFP) خط المراسل.
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850355P | |
1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850367P | |
1.0 µm Whatman Nuclepore Track-Etched polycarbonate membranes | GE Healthcare Life Sciences | 110610 | |
25 mL round-bottom flask | Sigma-Aldrich | Z278262 | |
35 mm culture dish | Thermo Scientific | 150460 | |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | |
Agilent 1260 Infinity Diode Array Detector | Agilent Technologies | G4212B | |
Agilent 1260 Infinity Quaternary Pump | Agilent Technologies | G1311B | |
Agilent 1290 Infinity Series Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | |
Avanti mini-extruder Avanti Polar Lipids Inc. | Avanti Polar Lipids Inc. | ||
borosilicate microinjection needles | Warner Instruments | 203-776-0664 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901-100G | |
cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
Dumont No.5 fine tip forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
Eppendorf Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242956003 | |
Eppendorf SmartBlock 1.5 mL, thermoblock for 24 reaction vessels | Eppendorf | 4053-6038 | |
eyelash manipulator | Ted Pella Inc. | 113 | |
hemocytometer | Hawksley | BS.748 | |
HEPES | BDH Chemicals | 441474J | |
HPLC system | Agilent Technologies | 1260 series HPLC system | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541-1KG | |
low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
LysoTracker Deep Red | Invitrogen | L12492 | 1 mM stock solution in DMSO, keep at -20 °C and protect from light. |
LysoTracker Deep Red | Thermo Scientific | L12492 | |
magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE) | Invitrogen | M12652 | Keep at -20 °C and protect from light. |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0387-500G | |
methylene blue | Alfa Aesar | 42771 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391-500G | |
micromanipulator | Narishige | M-152 | |
mineral oil | Sigma-Aldrich | M-3516 | |
Mitochondria-targeting antioxidant MitoTEMPO | Sigma-Aldrich | SML0737 | |
MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator | Thermo Scientific | M36008 | |
MitoTEMPO | Sigma-Aldrich | SML0737 | Keep at -20 °C and protect from light. |
N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-10G | Take care when handling, toxic. |
NaCl | BDH Chemicals | 27810.295 | |
PBS (pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
Petri dish (100 mm x 20 mm) | Corning Inc. | 430167 | |
Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4.6 mm column | Phenomenex | 00G-4439-E0 | |
pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate | Thermo Scientific | P35361 | |
pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate | Invitrogen | P35361 | Keep at -20 °C and protect from light. Make 1 mg/mL stock solution by dissolving 2 mg lyophilized product in 2 mL of PBS supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4. |
plastic transfer pipette | Medi'Ray | RL200C | |
poloxamer 188 | BASF Corporation | ||
pressure injector | Applied Scientific Instruments | MPPI-2 | |
rotary evaporator | Büchi, Flawil, Switzerland | Büchi R-215 Rotavapor | |
Scanning confocal microscope | Olympus | Olympus FV1000 FluoView | |
Sorvall WX+ Ultracentrifuge | Thermo Scientific | 75000090 | |
stereomicroscope | Leica | MZ12 | |
Tricaine | Sigma-Aldrich | A5040-25G | Make 4 mg/mL stock solution (in deionzed H2O) and keep at -20 °C. |
triton-X100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
Ultrasonic bath | Thermo Scientific | FB-11205 | |
Volocity Image Analysis Software | PerkinElmer | version 6.3 | |
water bath | |||
Zetasizer Nano | Malvern Instruments Ltd | Zetasizer Nano ZS ZEN 3600 |