Mirare i farmaci ai macrofagi di pesce zebra larvale iniettando liposomi caricati con droga

Il sistema di fagociti mononucleari fornisce una prima linea di difesa contro gli agenti patogeni invasori. Questo sistema è costituito da monociti, cellule dendritiche derivate da monciti e macrofagi, che attivamente fagocitozelare patogeni estranei, limitando così la diffusione di patogeni. Oltre a queste funzioni fagocitiche e microbicide, le cellule dendritiche e i macrofagi sono anche in grado di produzione di citochine e di presentazione dell’antigene per attivare il sistema immunitario adattivo¹. Di queste cellule, i macrofagi hanno ricevuto particolare attenzione a causa della loro eterogeneità funzionale diversificata e del coinvolgimento in molteplici malattie infiammatorie, dall’autoimmunità e malattie infettive al cancro^2,3,4,5,6,7. La plasticità dei macrofagi e la loro capacità di adattarsi funzionalmente alle esigenze del loro ambiente tissutale richiedono approcci sperimentali per osservare e interrogare direttamente queste cellule in vivo.

Il pesce zebra larvale è un organismo modello ideale con cui studiare la funzione e la plasticità dei macrofagi in vivo⁸. La trasparenza ottica del pesce zebra larvale fornisce una finestra per osservare direttamente il comportamento dei macrofagi, soprattutto se accoppiati con linee di reporter transgenici marcati macrofagi. Sfruttare il potenziale di imaging dal vivo e la trattatibilità sperimentale del pesce zebra larvale ha portato a molte intuizioni significative sulla funzione del macrofago che hanno una rilevanza diretta per la malattia umana^{9,10,11,12,13,14,15}. Molti di questi studi hanno anche approfittato dell’alta conservazione dell’attività farmacologica nel pesce zebra (un attributo che sostiene il loro uso come piattaforma di scoperta di farmaci animali^16,17,18), utilizzando interventi chimici per manipolare farmacologicamente la funzione macrofago. Ad oggi, questi trattamenti farmacologici sono stati per lo più erogati sia attraverso l’immersione, che richiede che il farmaco sia solubile in acqua, o per microiniezione diretta di droga libera (Figura 1A). Le limitazioni di queste strategie di consegna passiva includono effetti off-target e tossicità generale che possono impedire di valutare qualsiasi impatto sulla funzione del macrofago. Inoltre, quando si studiano gli effetti sui farmaci sui macrofagi non è noto se i farmaci agiscono sui macrofagi stessi o attraverso meccanismi più indiretti. Quando si eseguono studi di intervento chimico simili per studiare la funzione del macrofago, abbiamo riconosciuto che c’era una necessità insoddisfatta di sviluppare un metodo di somministrazione economico e diretto per indirizzare i farmaci specificamente ai macrofagi.

I liposomi sono vesciche microscopiche, biocompatibili, lipidi che possono incapsulare proteine, nucleotidi e merci di droga¹⁹. La struttura di unilamellar o bistrato lipidico multilamellar dei liposomi forma un lumen interno acquoso dove i farmaci solubili in acqua possono essere incorporati mentre i farmaci idrofobici possono essere integrati nelle membrane lipidiche. Inoltre, le proprietà fisico dei liposomi, comprese le modifiche di dimensioni, cariche e superfici, possono essere manipolate per adattare il loro targeting a celle specifiche^20,21. Queste caratteristiche dei liposomi li hanno resi un veicolo attraente per fornire farmaci e migliorare la precisione degli attuali regimi di trattamento²⁰. Poiché i liposomi sono naturalmente fagocitoscitosamente dai macrofagi (una caratteristica sfruttata dal loro uso di routine nel fornire clodrinonato specificamente ai macrofagi per esperimenti di ablazione²²), presentano come un’opzione attraente per la somministrazione di farmaci specifici per i macrofagi (Figura 1B).

Questo protocollo descrive la formulazione di farmaci in liposomi fluorescenti blu rivestiti con il poloxamer polimerico idrofilo 188, che forma uno strato protettivo sulla superficie liposomica e ha dimostrato di migliorare la ritenzione dei farmaci e avere una biocompatibilità superiore²³. Poloxamer è stato scelto per il rivestimento superficiale dei liposomi come la nostra ricerca precedente aveva dimostrato che, rispetto ai liposomi modificati in polietilene glicole, i liposomi modificati poloxamer hanno mostrato una migliore biocompatibilità dopo l’iniezione sottocutanea di zampe di ratto e simili farmacocinetici nei conigli che hanno seguito l’infusione endovenosa²³. I protocolli sono descritti anche per la loro microiniezione nel pesce zebra larvale e nell’imaging vivo per valutare la loro capacità di targeting dei macrofagi e la localizzazione in compartimenti intracellulari necessari per la degradazione liposomica e la somministrazione di farmaci citoplasmici. Come prova di concetto abbiamo usato questa tecnica per indirizzare due farmaci ai macrofagi per sopprimere la loro attivazione in un modello di pesce zebra larvale di infiammazione gotta acuta²⁴. Questa tecnica di somministrazione di farmaci espande il “toolkit” chimico disponibile per i ricercatori di pesci zebra che vogliono garantire il targeting dei macrofagi dei loro farmaci di interesse.