Summary

Direcionando drogas para macrófagos de zebrafish larval injetando liposós carregados de drogas

Published: February 18, 2020
doi:

Summary

Aqui, descrevemos a síntese de liposós carregados de drogas e sua microinjeção em zebrafish larval com o propósito de direcionar o fornecimento de drogas para células de linhagem de macrófagos.

Abstract

As larvas de zebrafish (Danio rerio) desenvolveram-se em um modelo popular para investigar interações hospedeiras-patógenas e a contribuição de células imunes inatas para doenças inflamatórias devido ao seu sistema imunológico inato funcionalmente conservado. Eles também são amplamente utilizados para examinar como as células imunes inatas ajudam a orientar os processos de desenvolvimento. Aproveitando a transparência óptica e a tratabilidade genética dos zebrafish larvais, esses estudos muitas vezes se concentram em abordagens de imagem ao vivo para caracterizar funcionalmente macrófagos e neutrófilos fluorescentes dentro de animais intactos. Devido à sua diversa heterogeneidade funcional e papéis em constante expansão na patogênese da doença, os macrófagos receberam atenção significativa. Além das manipulações genéticas, as intervenções químicas são usadas rotineiramente para manipular e examinar o comportamento do macrófago em zebrafish larval. A entrega dessas drogas é tipicamente limitada ao direcionamento passivo de drogas gratuitas através de imersão direta ou microinjeção. Essas abordagens dependem da suposição de que quaisquer alterações no comportamento do macrófago são resultado de um efeito direto da droga nos próprios macrófagos, e não uma consequência a jusante de um efeito direto em outro tipo de célula. Aqui, apresentamos nossos protocolos para direcionar drogas especificamente para macrófagos de zebrafish larval, microinjetando liposós fluorescentes carregados de drogas. Revelamos que liposomos fluorescentes azuis carregados de drogas modificadas por poloxamer 188 são prontamente tomados por macrófagos, e não por neutrófilos. Também fornecemos evidências de que drogas entregues dessa forma podem impactar a atividade do macrófago de forma consistente com o mecanismo de ação da droga. Essa técnica será de valor para os pesquisadores que desejam garantir o direcionamento de medicamentos aos macrófagos e quando as drogas são tóxicas demais para serem entregues por métodos tradicionais como a imersão.

Introduction

O sistema de phagócito mononuclear fornece uma primeira linha de defesa contra patógenos invasores. Este sistema consiste em monócitos, células e macrófagos derivados de monocitos, que ativamente fagocytoze patógenos estrangeiros, limitando assim a propagação de patógenos. Além dessas funções de efeito phagofítico e microbicida, células dendríticas e macrófagos também são capazes de produção de citocinas e apresentação de antígenos para ativar o sistema imunológico adaptativo1. Dessas células, os macrófagos têm recebido atenção especial devido à sua diversa heterogeneidade funcional e envolvimento em múltiplas doenças inflamatórias, desde autoimunidade e doenças infecciosas até câncer2,3,4,5,6,7. A plasticidade dos macrófagos e sua capacidade de se adaptar funcionalmente às necessidades de seu ambiente tecidual exigem abordagens experimentais para observar e interrogar diretamente essas células in vivo.

Zebrafish larval são um organismo modelo ideal pelo qual estudar a função e plasticidade dos macrófagos no vivo8. A transparência óptica do zebrafish larval fornece uma janela para observar diretamente o comportamento dos macrófagos, especialmente quando acoplado com linhas de repórtertransgênicas com marcação de macrófagos. Explorar o potencial de imagem ao vivo e a tratabilidade experimental de zebrafish larval levou a muitas percepções significativas sobre a função macrófaga que têm relevância direta para a doença humana9,10,11,12,13,14,15. Muitos desses estudos também se aproveitaram da alta conservação da atividade medicamentosa em zebrafish (atributo que sustenta seu uso como uma plataforma inteira de descoberta de drogas animais16,17,18), utilizando intervenções químicas para manipular farmacologicamente a função macrófago. Até o momento, esses tratamentos farmacológicos têm sido entregues principalmente através da imersão, o que exige que a droga seja solúvel em água, ou por microinjeção direta de droga gratuita(Figura 1A). Limitações dessas estratégias de entrega passiva incluem efeitos fora do alvo e toxicidade geral que podem impedir a avaliação de qualquer impacto na função do macrófago. Além disso, ao investigar efeitos medicamentosos em macrófagos não se sabe se as drogas estão agindo sobre os próprios macrófagos ou através de mecanismos mais indiretos. Ao realizar estudos semelhantes de intervenção química para investigar a função do macrófago, reconhecemos que havia uma necessidade não atendida de desenvolver um método de entrega barato e direto para direcionar medicamentos especificamente para macrófagos.

Liposomos são corículas microscópicas, biocompatíveis e lipídicas que podem encapsular proteínas, nucleotídeos e carga de drogas19. A estrutura de bicamadas lipídicas unilamelares ou multilémelares de liposomos forma um lúmen interno aquoso onde drogas solúveis em água podem ser incorporadas enquanto drogas hidrofóbicas podem ser integradas às membranas lipídicas. Além disso, as propriedades físicoquímicas dos liposomos, incluindo tamanho, carga e modificações de superfície podem ser manipuladas para adaptar seu direcionamento a células específicas20,21. Essas características dos liposomos tornaram-nos um veículo atraente para entregar medicamentos e melhorar a precisão dos regimes de tratamento atuais20. Como os liposós são naturalmente fagocytozed por macrófagos (um recurso explorado por seu uso rotineiro na entrega de clodronato especificamente para macrófagos para experimentos de ablação22), eles apresentam como uma opção atraente para a entrega de drogas específicas do macrófago(Figura 1B).

Este protocolo descreve a formulação de medicamentos em liposomos fluorescentes azuis revestidos com o poloxamer de polímero hidrofílico 188, que forma uma camada protetora na superfície liposome e tem sido mostrado para melhorar a retenção de drogas e ter biocompatibilidade superior23. Poloxamer foi escolhido para revestimento superficial de liposomos como nossa pesquisa anterior mostrou que, quando comparado com liposós modificados de polietileno glicol, liposomos modificados de poloxamer mostraram melhor biocompatibilidade após injeção subcutânea de patas de rato e farmacocinética semelhante em coelhos após infusão intravenosa23. Protocolos também são descritos para sua microinjeção em zebrafish larval e imagens vivas para avaliar sua capacidade de segmentação de macrófagos e localização para compartimentos intracelulares necessários para degradação liposome e entrega de drogas citoplasmáticas. Como prova de conceito, já usamos essa técnica para direcionar duas drogas aos macrófagos para suprimir sua ativação em um modelo de zebrafish larval de inflamação gouty aguda24. Esta técnica de entrega de drogas expande o “kit de ferramentas” químico disponível para pesquisadores de zebrafish que desejam garantir o direcionamento de macrófagos de suas drogas de interesse.

Protocol

1. Preparação de Liposomes marina azul carregado de drogas NOTA: Liposomes carregando o corante fluorescente azul, Marina Blue e droga são preparados usando um método de hidratação de filme fino com pós-inserção de poloxamer 188. Todos os procedimentos são realizados à temperatura ambiente, a menos que seja especificado de outra forma. Os liposós de controle só carregam Marina azul e PBS. O exemplo aqui descreve carregar liposomos com uma droga antioxidante25…

Representative Results

A abordagem de hidratação de filmes finos descrita aqui para a preparação de liposomos fluorescentes que abrigam medicamentos é um método simples e econômico. Com o protocolo utilizado neste estudo, espera-se que os liposósicos sejam unilamellar23,24. O tamanho, o potencial zeta, a eficiência de carga e armadilha dos liposomos produzidos são resumidos na Tabela 1. O tamanho da partícula dos liposomos (antes e depois do carregamento da …

Discussion

Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para formular liposós carregados de drogas para atingir especificamente macrófagos em zebrafish larval. Este método pode ser usado para dissecar o papel dos macrófagos em certos modelos da doença, garantindo a entrega direta direcionada de medicamentos especificamente aos macrófagos. Além disso, pode ser usado quando a toxicidade geral das drogas limita seu uso quando entregue por rotas mais convencionais, como a imersão. O protocolo descrito aqui fornece uma alternativa a …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por subsídios concedidos à C.J.H. (Conselho de Pesquisa em Saúde da Nova Zelândia e Marsden Fund, Royal Society of New Zealand) e Z.W. (Fundo de Desenvolvimento de Pesquisa da Faculdade da Universidade de Auckland). Os autores agradecem a Alhad Mahagaonkar pela gestão especializada da instalação de zebrafish, a Unidade de Pesquisa em Imagens Biomédicas, a Escola de Ciências Médicas da Universidade de Auckland por assistência com imagens confocais e Graham Lieschke por presentear a linha de repórteres Tg(mpeg1:EGFP).

Materials

1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) Avanti Polar Lipids, Inc. 850355P
1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE) Avanti Polar Lipids, Inc. 850367P
1.0 µm Whatman Nuclepore Track-Etched polycarbonate membranes GE Healthcare Life Sciences 110610
25 mL round-bottom flask Sigma-Aldrich Z278262
35 mm culture dish Thermo Scientific 150460
Acetonitrile Sigma-Aldrich 34998
Agilent 1260 Infinity Diode Array Detector Agilent Technologies G4212B
Agilent 1260 Infinity Quaternary Pump Agilent Technologies G1311B
Agilent 1290 Infinity Series Thermostat Agilent Technologies G1330B
Avanti mini-extruder Avanti Polar Lipids Inc. Avanti Polar Lipids Inc.
borosilicate microinjection needles Warner Instruments 203-776-0664
CaCl2 Sigma-Aldrich C4901-100G
cholesterol Sigma-Aldrich C8667
Dumont No.5 fine tip forceps Fine Science Tools 11251-10
Eppendorf Microloader pipette tip Eppendorf 5242956003
Eppendorf SmartBlock 1.5 mL, thermoblock for 24 reaction vessels Eppendorf 4053-6038
eyelash manipulator Ted Pella Inc. 113
hemocytometer Hawksley BS.748
HEPES BDH Chemicals 441474J
HPLC system Agilent Technologies 1260 series HPLC system
KCl Sigma-Aldrich P9541-1KG
low melting point agarose Invitrogen 16520-100
LysoTracker Deep Red Invitrogen L12492 1 mM stock solution in DMSO, keep at -20 °C and protect from light.
LysoTracker Deep Red Thermo Scientific L12492
magnetic stand Narishige GJ-1
Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE) Invitrogen M12652 Keep at -20 °C and protect from light.
Methanol Sigma-Aldrich 34860
methyl cellulose Sigma-Aldrich M0387-500G
methylene blue Alfa Aesar 42771
MgSO4 Sigma-Aldrich 230391-500G
micromanipulator Narishige M-152
mineral oil Sigma-Aldrich M-3516
Mitochondria-targeting antioxidant MitoTEMPO Sigma-Aldrich SML0737
MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator Thermo Scientific M36008
MitoTEMPO Sigma-Aldrich SML0737 Keep at -20 °C and protect from light.
N-Phenylthiourea (PTU) Sigma-Aldrich P7629-10G Take care when handling, toxic.
NaCl BDH Chemicals 27810.295
PBS (pH 7.4) Gibco 10010-023
Petri dish (100 mm x 20 mm) Corning Inc. 430167
Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4.6 mm column Phenomenex 00G-4439-E0
pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate Thermo Scientific P35361
pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate Invitrogen P35361 Keep at -20 °C and protect from light. Make 1 mg/mL stock solution by dissolving 2 mg lyophilized product in 2 mL of PBS supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4.
plastic transfer pipette Medi'Ray RL200C
poloxamer 188 BASF Corporation
pressure injector Applied Scientific Instruments MPPI-2
rotary evaporator Büchi, Flawil, Switzerland Büchi R-215 Rotavapor
Scanning confocal microscope Olympus Olympus FV1000 FluoView
Sorvall WX+ Ultracentrifuge Thermo Scientific 75000090
stereomicroscope Leica MZ12
Tricaine Sigma-Aldrich A5040-25G Make 4 mg/mL stock solution (in deionzed H2O) and keep at -20 °C.
triton-X100 Sigma-Aldrich X100-100ML
Ultrasonic bath Thermo Scientific FB-11205
Volocity Image Analysis Software PerkinElmer version 6.3
water bath
Zetasizer Nano Malvern Instruments Ltd Zetasizer Nano ZS ZEN 3600

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Linnerz, T., Kanamala, M., Astin, J. W., Dalbeth, N., Wu, Z., Hall, C. J. Targeting Drugs to Larval Zebrafish Macrophages by Injecting Drug-Loaded Liposomes. J. Vis. Exp. (156), e60198, doi:10.3791/60198 (2020).

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