Hier beschrijven we de synthese van door drugs geladen liposomen en hun micro-injectie in larve zebravissen met als doel de levering van geneesmiddelen aan macrofaagcellen te richten.
Zebravissen (Danio rerio) larven hebben zich ontwikkeld tot een populair model om gastheer-pathogene interacties en de bijdrage van aangeboren immuuncellen aan ontstekingsziekten te wijten aan hun functioneel bewaard gebleven immuunsysteem te onderzoeken. Ze worden ook veel gebruikt om te onderzoeken hoe aangeboren immuuncellen helpen bij het begeleiden van ontwikkelingsprocessen. Door gebruik te maken van de optische transparantie en genetische aallaatbaarheid van larve zebravissen, richten deze studies zich vaak op live beeldvormingsbenaderingen om fluorescerend gemarkeerde macrofagen en neutrofielen binnen intacte dieren functioneel te karakteriseren. Door hun diverse functionele heterogeniteit en steeds groeiende rollen bij pathogenese van ziekten, hebben macrofagen veel aandacht gekregen. Naast genetische manipulaties worden chemische interventies nu routinematig gebruikt om macrofaaggedrag bij larve zebravissen te manipuleren en te onderzoeken. Levering van deze geneesmiddelen is meestal beperkt tot passieve targeting van gratis drug door middel van directe onderdompeling of micro-injectie. Deze benaderingen vertrouwen op de veronderstelling dat eventuele veranderingen in macrofaaggedrag het resultaat zijn van een direct effect van het medicijn op de macrofagen zelf, en niet een stroomafwaarts gevolg van een direct effect op een ander celtype. Hier presenteren we onze protocollen voor het specifiek richten van drugs op larve zebravissen macrofagen door microinjecterende door drugs geladen fluorescerende liposomen. We onthullen dat poloxamer 188-gemodificeerde drug-loaded blauwe fluorescerende liposomen gemakkelijk worden opgenomen door macrofagen, en niet door neutrofielen. We leveren ook bewijs dat drugs die op deze manier worden geleverd, macrofaagactiviteit kunnen beïnvloeden op een manier die in overeenstemming is met het werkingsmechanisme van het medicijn. Deze techniek zal van waarde zijn voor onderzoekers die ervoor willen zorgen dat geneesmiddelen worden gericht op macrofagen en wanneer geneesmiddelen te giftig zijn om te worden geleverd met traditionele methoden zoals onderdompeling.
Het mononucleaire fagocytesysteem biedt een eerste verdedigingslinie tegen binnendringende ziekteverwekkers. Dit systeem bestaat uit monocyten, monocyten-afgeleide dendritische cellen en macrofagen, die actief fagocytoze vreemde ziekteverwekkers, waardoor de verspreiding van ziekteverwekkers wordt beperkt. Naast deze fagocytische en microbicidale effectorfuncties zijn dendritische cellen en macrofagen ook in staat cytokineproductie en antigeenpresentatie om het adaptieve immuunsysteem te activeren1. Van deze cellen hebben macrofagen bijzondere aandacht gekregen vanwege hun diverse functionele heterogeniteit en betrokkenheid bij meervoudige ontstekingsziekten, van auto-immuniteit en infectieziekten tot kanker2,3,4,5,6,7. De plasticiteit van macrofagen en hun vermogen om zich functioneel aan te passen aan de behoeften aan hun weefselomgeving vereisen experimentele benaderingen om deze cellen in vivo rechtstreeks te observeren en te ondervragen.
Larve zebravissen zijn een ideaal model organisme waarmee de functie en plasticiteit van macrofagen in vivo8te bestuderen. De optische transparantie van larve zebravissen biedt een venster om het gedrag van macrofagen direct te observeren, vooral in combinatie met macrofaagmarkeringtransgene reporterlijnen. Het benutten van het levende beeldvormingspotentieel en de experimentele traktaat van larvezebravissen heeft geleid tot veel significante inzichten in de macrofaagfunctie die direct relevant zijn voor de menselijke ziekte9,10,11,12,13,14,15. Veel van deze studies hebben ook gebruik gemaakt van de hoge instandhouding van de activiteit van drugs bij zebravissen (een attribuut dat hun gebruik als een hele dierlijke drug discovery platform16,17,18), door gebruik te maken van chemische interventies om farmacologisch te manipuleren macrofaag functie. Tot op heden zijn deze farmacologische behandelingen meestal geleverd door onderdompeling, waardoor het medicijn in water oplosbaar moet zijn, of door directe micro-injectie van vrij geneesmiddel(figuur 1A). Beperkingen van deze passieve leveringsstrategieën omvatten off-target effecten en algemene toxiciteit die de beoordeling van eventuele gevolgen voor de macrofaagfunctie kunnen uitsluiten. Bovendien, bij het onderzoeken van drugseffecten op macrofagen is het onbekend of de geneesmiddelen handelen op de macrofagen zelf of door meer indirecte mechanismen. Bij het uitvoeren van soortgelijke chemische interventie studies om macrofaag functie te onderzoeken, erkenden we dat er een onvervulde noodzaak om een goedkope en eenvoudige leveringsmethode te ontwikkelen om drugs specifiek richten op macrofagen.
Liposomen zijn microscopisch, biocompatibel, lipide tweelaagse blaasjes die eiwitten, nucleotiden en drugslading kunnen inkapselen19. De unilamellar of multilamellar lipide bilayer structuur van liposomen vormt een waterig binnenlumen waar in water oplosbare geneesmiddelen kunnen worden opgenomen, terwijl hydrofobe geneesmiddelen kunnen worden geïntegreerd in de lipide membranen. Bovendien kunnen de fysischchemische eigenschappen van liposomen, waaronder grootte, lading en oppervlaktemodificaties, worden gemanipuleerd om hun targeting af te stemmen op specifieke cellen20,21. Deze kenmerken van liposomen hebben ze een aantrekkelijk voertuig om drugs te leveren en de precisie van de huidige behandeling regimes20te verbeteren. Aangezien liposomen van nature worden gefagocytozed door macrofagen (een functie die wordt uitgebuit door hun routinematiggebruik bij het specifiek leveren van clodronaat aan macrofagen voor ablatieexperimenten22),presenteren zij zich als een aantrekkelijke optie voor macrofaagspecifieke geneesmiddelenlevering(figuur 1B).
Dit protocol beschrijft de formulering van geneesmiddelen in blauwe fluorescerende liposomen bekleed met de hydrofiele polymeer poloxamer 188, dat vormt een beschermende laag op het liposoom oppervlak en is aangetoond dat het behoud van geneesmiddelen te verbeteren en hebben superieure biocompatibiliteit23. Poloxamer werd gekozen voor oppervlaktecoating van liposomen, omdat ons vorige onderzoek had aangetoond dat, in vergelijking met polyethyleenglycol gemodificeerde liposomen, poloxamer gemodificeerde liposomen betere biocompatibiliteit vertoonden na onderhuidse injectie van rattenpoten en soortgelijke farmacokinetiek bij konijnen na intraveneuze infusie23. Protocollen worden ook beschreven voor hun micro-injectie in larve zebravissen en live beeldvorming om hun macrofaag-targeting vermogen en lokalisatie te beoordelen naar intracellulaire compartimenten die nodig zijn voor liposoomafbraak en cytoplasmatische drug levering. Als proof-of-concept hebben we deze techniek eerder gebruikt om twee geneesmiddelen op macrofagen te richten om hun activering te onderdrukken in een larve zebravismodel van acute jichtontsteking24. Deze drug levering techniek breidt de chemische “toolkit” beschikbaar voor zebravis onderzoekers willen macrofaag-targeting van hun drugs van belang te waarborgen.
Hier hebben we een gedetailleerd protocol om met drugs geladen liposomen te formuleren om specifiek macrofagen bij larve zebravissen aan te pakken. Deze methode kan worden gebruikt om de rol van macrofagen in bepaalde ziektemodellen te ontleden door te zorgen voor directe gerichte levering van geneesmiddelen specifiek aan macrofagen. Bovendien kan het worden gebruikt wanneer de algemene toxiciteit van geneesmiddelen het gebruik ervan beperkt wanneer ze worden geleverd door meer conventionele routes, zoals onderdompeling….
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door subsidies toegekend aan C.J.H. (Health research Council of New Zealand and Marsden Fund, Royal Society of New Zealand) en Z.W. (Faculty Research Development Fund van de Universiteit van Auckland). De auteurs bedanken Alhad Mahagaonkar voor deskundig beheer van de zebravis faciliteit, de Biomedical Imaging Research Unit, School of Medical Sciences, Universiteit van Auckland voor hulp bij confocale beeldvorming en Graham Lieschke voor gifting de Tg (mpeg1:EGFP) reporter lijn.
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850355P | |
1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850367P | |
1.0 µm Whatman Nuclepore Track-Etched polycarbonate membranes | GE Healthcare Life Sciences | 110610 | |
25 mL round-bottom flask | Sigma-Aldrich | Z278262 | |
35 mm culture dish | Thermo Scientific | 150460 | |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | |
Agilent 1260 Infinity Diode Array Detector | Agilent Technologies | G4212B | |
Agilent 1260 Infinity Quaternary Pump | Agilent Technologies | G1311B | |
Agilent 1290 Infinity Series Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | |
Avanti mini-extruder Avanti Polar Lipids Inc. | Avanti Polar Lipids Inc. | ||
borosilicate microinjection needles | Warner Instruments | 203-776-0664 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901-100G | |
cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
Dumont No.5 fine tip forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
Eppendorf Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242956003 | |
Eppendorf SmartBlock 1.5 mL, thermoblock for 24 reaction vessels | Eppendorf | 4053-6038 | |
eyelash manipulator | Ted Pella Inc. | 113 | |
hemocytometer | Hawksley | BS.748 | |
HEPES | BDH Chemicals | 441474J | |
HPLC system | Agilent Technologies | 1260 series HPLC system | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541-1KG | |
low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
LysoTracker Deep Red | Invitrogen | L12492 | 1 mM stock solution in DMSO, keep at -20 °C and protect from light. |
LysoTracker Deep Red | Thermo Scientific | L12492 | |
magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE) | Invitrogen | M12652 | Keep at -20 °C and protect from light. |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0387-500G | |
methylene blue | Alfa Aesar | 42771 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391-500G | |
micromanipulator | Narishige | M-152 | |
mineral oil | Sigma-Aldrich | M-3516 | |
Mitochondria-targeting antioxidant MitoTEMPO | Sigma-Aldrich | SML0737 | |
MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator | Thermo Scientific | M36008 | |
MitoTEMPO | Sigma-Aldrich | SML0737 | Keep at -20 °C and protect from light. |
N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-10G | Take care when handling, toxic. |
NaCl | BDH Chemicals | 27810.295 | |
PBS (pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
Petri dish (100 mm x 20 mm) | Corning Inc. | 430167 | |
Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4.6 mm column | Phenomenex | 00G-4439-E0 | |
pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate | Thermo Scientific | P35361 | |
pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate | Invitrogen | P35361 | Keep at -20 °C and protect from light. Make 1 mg/mL stock solution by dissolving 2 mg lyophilized product in 2 mL of PBS supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4. |
plastic transfer pipette | Medi'Ray | RL200C | |
poloxamer 188 | BASF Corporation | ||
pressure injector | Applied Scientific Instruments | MPPI-2 | |
rotary evaporator | Büchi, Flawil, Switzerland | Büchi R-215 Rotavapor | |
Scanning confocal microscope | Olympus | Olympus FV1000 FluoView | |
Sorvall WX+ Ultracentrifuge | Thermo Scientific | 75000090 | |
stereomicroscope | Leica | MZ12 | |
Tricaine | Sigma-Aldrich | A5040-25G | Make 4 mg/mL stock solution (in deionzed H2O) and keep at -20 °C. |
triton-X100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
Ultrasonic bath | Thermo Scientific | FB-11205 | |
Volocity Image Analysis Software | PerkinElmer | version 6.3 | |
water bath | |||
Zetasizer Nano | Malvern Instruments Ltd | Zetasizer Nano ZS ZEN 3600 |