Biyolojik Örneklerde Konitinaz Aktivitesinin Ölçülmesi
Summary
Burada bronkoalveolar lavaj veya serum gibi biyolojik sıvılarda kitinaz aktivitesini ölçmek için basit bir yöntemdir.
Abstract
Chitinases kitin cleave enzimleridir. Hatta kitin yokluğunda, memeliler bazada da dahil olmak üzere vücutta mevcut chitinases önemli miktarda var. Konitinazın kesin rolü bilinmemektedir, ancak sırasıyla kitin içeren gıda ve patojenlere karşı sindirim ve konak savunmaönemli bir rol oynadığına inanılmaktadır. Son çalışmalar, bizim de dahil olmak üzere, konak bağışıklık ve alerjik hastalıklarda konitinaz ve konitinaz benzeri proteinlerin önemli bir rol göstermiştir. Daha da önemlisi, kitinaz aktiviteleri astım ve pulmoner fibrozis gibi tip 2 inflamatuar hastalıklar da dahil olmak üzere çok çeşitli hastalıklarda hastalık şiddetinin önemli biyobelirteçleri olarak hizmet vermektedir. Benzer şekilde, Gaucher hastalığı gibi genetik bozuklukları olan hastalar önemli ölçüde yüksek kitinaz düzeyleri var, hangi sadece hastalığın şiddeti ile ilişkili değil, aynı zamanda terapötik etkinliği için güvenilir bir biyomarker olarak hizmet vermektedir. Burada özetlenen protokol, BAL veya fare lerin serum örneklerindeki kitinaz aktivitesini ölçmenin basit, hızlı ve basit bir yolunu açıklar ve enzimlerin yüksek derecede korunmuş doğası nedeniyle insan deneklere ve diğer model organizmalara yaygın olarak adapte edilebilir.
Introduction
Chitin selüloz sonra yeryüzünde ikinci en bol polisakkarit, böceklerin dış iskelet ilerlerken dahil olmak üzere organizmaların çeşitli önemli bir yapısal bileşeni olarak hizmet vermektedir, mantarlar, maya, ve yosun; bazı omurgalılar da chitin1var. Chitinases kitin yıkmak yeteneğine sahip enzimler bir aile ve son derece bakterilerden memelilere kadar türlerde evrim boyunca korunur2,3. Chitinases ek olarak, memeliler de chitin bağlamak için yeteneklerini chitinases benzer ama onlar chitin cleave enzimatik yeteneği eksikliği farklı olan kitinaz benzeri proteinler var4.
Her ne kadar chitin ve chitinases uzun incelenmiş olsa da-1900’lerin başına kadar uzanan araştırmalar ile-ana odak böcekler ve diğer omurgasızlar rollerini olmuştur. Aslında, 1960’lara kadar omurgalıların chitinases olduğu tespit edildi. Chitobiare bazlı bir test kullanılarak, kitinazların kertenkeleler ve karakuşlar da dahil olmak üzere omurgalıların sindirim sisteminde bulunduğu gösterilmiştir— bu gözlem, böcekler gibi kitin içeren organizmaların tüketimine bağlı olduğu varsayımına yol açtı5 .
Memelilerin iki enzimatik aktif kromozom formu vardır: asidik memeli kitinaz (AMCase; chit2 ve CHIA olarak da bilinir) ve kitotriosidaz (CHIT1)4. Bu proteinlerin her ikisi de kitin hidrolize yeteneğine sahiptir. Ancak, CHIT1 insanlarda daha enzimatik olarak aktiftir, hemen hemen tüm kitinaz aktivitesi CHIT1 türetilmiştir. 4 Farelerde, hem Chit1 hem de AMCase neredeyse eşitgenel kitinaz aktivitesine katkıda 6. Öte yandan, kitinaz benzeri proteinlerde kitinaz aktivitesi yok.
Chit1 esas olarak makrofajlar tarafından salgılanır ve genellikle chitin içeren patojenlere karşı bağışıklık yanıtı olarak kabul edilir7. Enzim ayrıca substrat kitinvarlığıolmadan bile, hem M1 ve M2 makrofaj alt tipleri içine monositlerin olgunlaşmadahil olduğu gösterilmiştir 8 . Ayrıca, aynı zamanda T yardımcı tip 2 de dahil olmak üzere diğer bağışıklık hücrelerinin olgunlaşma dahil olabilir (Th2) hücreleri ve eozinofiller—kriptokok akciğerenfeksiyonu9 durumda olduğu gösterilmiştir . Bu çalışmalar bağışıklık sisteminde chitinases karmaşık bir rolüne işaret.
Son yıllarda, Chit1 düzeyleri lisozomal depolama hastalıkları, bulaşıcı hastalıklar, solunum yolu hastalıkları, endokrinolojik hastalıklar, kardiyovasküler dahil olmak üzere 40’tan fazla farklı insan hastalığı için ilerleme önemli bir biyomarker olarak hizmet bulunmuştur hastalıklar, nörolojik hastalıklar vediğerleri (gözden 10). Bu hastalıkların çoğunda, Chit1 düzeyleri hastalığın şiddeti ve terapötik etkinliğigüçlübir belirleyici 10 vardır.
Chitinases Gaucher Hastalığı da dahil olmak üzere çok sayıda tıbbi durumlar için bir biyomarker olarak ün kazanmıştır gibi, araçlar ve tahliller chitinaz varlığı için test kolaylaştırmak için geliştirilmiştir. Eski yöntemler arasında Schales’in prosedürü, kan şekeri testinden uyarlanmış bir protokol ve 3,5 dinitrosalislik asit (DNS) yöntemi sayılabilir. Ancak, bu yöntemler genellikle zaman duyarlı ve teknik olarak zor11. Bu testlerin her ikisi için de prosedür inorganik oksidanların azaltılmasını gerektirir, örneğin Schales prosedürü durumunda ferricyanide, sadece spektrofotometrik olarak ölçülebilen bir renk değişikliği üreten. Ayrıca, her iki test de zaman alıcı ve renk12geliştirmekiçin gerekli bir ısıtma veya kaynama adım içerir 13 .
Burada açıklanan memeli örneklerinde kitinaz düzeylerini belirlemek için hızlı ve basit bir florimetrik test14,15. Burada kullanılan örneklerden ikisi serum ve bronkoalveoler lavaj sıvıları (BAL); kitinaz aktivitesi de anne sütü ve idrar örneklerinde ölçüldü ve teknik bu tür örneklerde yanı sıra diğer biyolojik sıvı16,17yapılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kitinaz aktivitesi hastalığın şiddetini, hastalığın ilerlemesini, terapötik etkinliğini ve spesifik patojenlerin varlığını tahmin etmek için önemli bir biyobelirteç olarak ortaya çıkmıştır18. Chitinases rolü hakkında uzun postulated teorilerin çoğu deneysel olarak kanıtlanmamıştır rağmen19, Yeni çalışmalar çeşitli hastalıklarda proteinler gibi chitinases ve kitinaz rolü içine önemli bilgiler sağlamıştır2<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma Amerikan Akciğer Derneği ve Amerikan Toraks Derneği ls ödülleri tarafından desteklenmiştir. Yazarlar içtenlikle Transgenik fare suşları sağlamak için Dr Jack Elias ve Dr Chun Geun Lee teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| 4-methylumbelliferone | Sigma | M1381 | Standard: commonly used in flourimetric assays for determination of enzyme activity |
| 4MU-GlcNAc2 | Sigma | M9763 | fluorescent chitinase substrate for use in mouse samples |
| 4MU-GlcNAc3 | Sigma | M5639 | fluorescent chitinase substrate for use in human samples |
| Citric Acid-monohydrate | for use in McIlvain Buffer | ||
| Glycine | for use in Stop Buffer at a concentration of 0.3 M | ||
| Na2HPO4xH2O | for use in McIlvain Buffer | ||
| NaOH | for use in Stop Buffer at a concentration of 12 g/L | ||
| Vision Plate: Non-sterile, untreated black 96 well plate | 4titude | 4ti-0224 |
References
- Hamid, R., Khan, M. A., Ahmad, M. Chitinases: An update. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 5 (1), 21-29 (2013).
- Sharma, L., et al. Regulation and Role of Chitotriosidase during Lung Infection with Klebsiella pneumoniae. Journal of Immunology. 201 (2), 615-626 (2018).
- Kanneganti, M., Kamba, A., Mizoguchi, E. Role of chitotriosidase (chitinase 1) under normal and disease conditions. Journal of Epithelial Biology & Pharmacology. 5, 1-9 (2012).
- Lee, C. G., et al. Role of Chitin and Chitinase/Chitinase-Like Proteins in Inflammation, Tissue Remodeling, and Injury. Annual Review of Physiology. (73), 479-501 (2011).
- Jeuniaux, C. Chitinase: An Addition to the List of Hydrolases in the Digestive Tract of Vertebrates. Nature. 192 (4798), 135-136 (1961).
- Boot, R. G., et al. Identification of a Novel Acidic Mammalian Chitinase Distinct from Chitotriosidase. Journal of Biological Chemistry. 276 (9), 6770-6778 (2000).
- Arndt, S., Hobbs, A., Sinclaire, I., Lane, A. B. Chitotriosidase Deficiency: A Mutation Update in an African Population. JIMD Reports. 10, 11-16 (2013).
- Di Rosa, M., Malaguarnera, G., De Gregorio, C., Drago, F., Malaguarnera, L. Evaluation of CHI3L-1 and CHIT-1 Expression in Differentiated and Polarized Macrophages. Inflammation. 36 (2), 482-492 (2013).
- Wiesner, D. L., et al. Chitin Recognition via Chitotriosidase Promotes Pathologic Type-2 Helper T Cell Responses to Cryptococcal Infection. PLOS Pathogens. 11 (3), e1004701 (2015).
- Elmonem, M. A., vanden Heuvel, L. P., Levtchenko, E. N. Immunomodulatory Effects of Chitotriosidase Enzyme. Enzyme Research. 2016, 1-9 (2016).
- Ferrari, A. R., Gaber, Y., Fraaije, M. W. A fast, sensitive and easy colorimetric assay for chitinase and cellulase activity detection. Biotechnol Biofuels. 7 (37), 1-8 (2014).
- Schales, O., Schales, S. S. Simple method for the determination of glucose in blood. Proc Am Fed Clin Res. 2, 78 (1945).
- Zarei, M., et al. Characterization of Chitinase with Antifungal Activity from a Native Serratia Marcescens B4A. Brazilian Journal of Microbiology. 42 (297), 1017-1029 (2011).
- Zhu, Z., et al. Acidic Mammalian Chitinase in Asthmatic Th2 Inflammation and IL-13 Pathway Activation. Science. 304 (5677), 1678-1682 (2004).
- Hollak, C. E., van Weely, S., van Oers, M. H., Aerts, J. M. Marked elevation of plasma chitotriosidase activity. A novel hallmark of Gaucher disease. Journal of Clinical Investigation. 93 (3), 1288-1292 (1994).
- Musumeci, M., Malaguarnera, L., Simpore, J., Barone, R., Whalen, M., Musumeci, S. Chitotriosidase activity in colostrum from African and Caucasian women. Clinical Chemistry and Laboratory. 43 (2), 198-201 (2005).
- Maddens, B., et al. Chitinase-like Proteins are Candidate Biomarkers for Sepsis-induced Acute Kidney Injury. Mol Cell Proteomics. 11, 1-13 (2012).
- Hector, A., et al. Chitinase activation in patients with fungus-associated cystic fibrosis lung disease. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (4), 1183-1189 (2016).
- Hall, A. J., Morroll, S., Tighe, P., Götz, F., Falcone, F. H. Human chitotriosidase is expressed in the eye and lacrimal gland and has an antimicrobial spectrum different from lysozyme. Microbes and Infection. 10 (1), 69-78 (2008).
- Kim, L. K., et al. AMCase is a crucial regulator of type 2 immune responses to inhaled house dust mites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (22), e2891-e2899 (2015).
- Olkhovych, N. V. Chitotriosidase activity as additional biomarker in the diagnosis of lysosomal storage diseases. Ukrainian Biochemical Journal. 88 (1), 69-78 (2016).
- Bouayadi, O., et al. Disease: An Underdiagnosed Pathology in the Eastern Moroccan Population. eJIFCC. 30 (1), 82-87 (2019).
- Tasci, C., et al. Efficacy of serum chitotriosidase activity in early treatment of patients with active tuberculosis and a negative sputum smear. Therapeutics and Clinical Risk Management. 8, 369-372 (2012).
- Barone, R., Simporé, J., Malaguarnera, L., Pignatelli, S., Musumeci, S. Plasma chitotriosidase activity in acute Plasmodium falciparum malaria. Clinica Chimica Acta. 331 (1-2), 79-85 (2003).
- Kitamoto, S., et al. Chitinase inhibition promotes atherosclerosis in hyperlipidemic mice. American Journal of Pathology. 183 (1), 313-325 (2013).
- Kzhyshkowska, J., Gratchev, A., Goerdt, S. Human Chitinases and Chitinase-Like Proteins as Indicators for Infl Ammation and Cancer. Biomark Insights. 2, 128-146 (2007).
