Meting van Chitinase activiteit in biologische monsters
Summary
Hier gepresenteerd is een eenvoudige methode voor het meten van Chitinase activiteit in biologische vloeistoffen zoals bronchoalveolaire spoeling of serum.
Abstract
Chitinasen zijn de enzymen die het aankleven van chitin. Zelfs bij afwezigheid van chitine hebben zoogdieren aanzienlijke hoeveelheden chitinases aanwezig in het lichaam, waaronder bij Baseline. De precieze rol van Chitinase is niet bekend, maar het werd verondersteld om een belangrijke rol te spelen in de spijsvertering en gastheer verdediging tegen chitin-bevattende voedsel en pathogenen, respectievelijk. Recent werk, met inbegrip van de onze, heeft een belangrijke rol getoond van Chitinase en Chitinase-achtige eiwitten in gastheer immuniteit en allergische ziekten. Belangrijk, Chitinase activiteiten dienen als belangrijke biomarkers van de ernst van de ziekte in een breed scala van ziekten, met inbegrip van type 2 ontstekingsziekten zoals astma en pulmonale fibrose. Evenzo hebben patiënten met genetische aandoeningen zoals de ziekte van Gaucher de Chitinase-niveaus significant verhoogd, die niet alleen correleren met de ernst van de ziekte, maar ook dienen als een betrouwbare biomarker voor therapeutische effectiviteit. Het protocol dat hier wordt beschreven, beschrijft een eenvoudige, snelle en eenvoudige manier om Chitinase-activiteit in BAL-of serummonsters van muizen te meten en kan op grote schaal worden aangepast aan menselijke proefpersonen en andere model organismen als gevolg van de sterk geconmaelde aard van de enzymen.
Introduction
Chitine is de op een na meest overvloedige polysaccharide op aarde na cellulose en fungeert als een belangrijke structurele component van een verscheidenheid aan organismen, waaronder het exoskelet van insecten, schimmels, gist en algen; Sommige gewervelde dieren hebben ook chitine1. Chitinases zijn een familie van enzymen die in staat zijn chitine af te breken en worden sterk geconconserd door de evolutie in soorten variërend van bacteriën tot zoogdieren2,3. Naast chitinases hebben zoogdieren ook Chitinase-achtige eiwitten die vergelijkbaar zijn met chitinases in hun vermogen om chitine te binden, maar verschillen in die zin dat ze het enzymatische vermogen missen om de chitine4te klieven.
Hoewel chitine en chitinases al lang bestudeerd zijn — met onderzoeken die dateren uit de vroege jaren 1900 — lag de nadruk op hun rol in insecten en andere ongewervelde dieren. In feite was het pas in de jaren zestig, toen gewervelde dieren in het geheel chitinases bleken te hebben. Met behulp van een op chitobiase gebaseerde assay bleken chitinases te worden gevonden in het spijsverteringskanaal van een aantal gewervelde dieren, waaronder hagedissen en Merel — een observatie veronderstelde te wijten aan het gebruik van chitine bevattende organismen zoals insecten5 .
Zoogdieren hebben twee enzymatisch actieve vormen van Chitinase: zure zoogdier Chitinase (AMCase; ook bekend als CHIT2 en CHIA) en chitotriosidase (CHIT1)4. Beide eiwitten zijn geschikt voor het hydrolyseren van chitine. Echter, CHIT1 is meer enzymatisch actief bij de mens, waar bijna alle Chitinase activiteit is afgeleid van CHIT1. 4 bij muizen dragen zowel Chit1 als amcase bijna evenveel bij aan de algehele activiteit van Chitinase6. Aan de andere kant, Chitinase-achtige eiwitten missen Chitinase activiteit.
Chit1 wordt voornamelijk uitgescheiden door macrofagen en wordt vaak beschouwd als een immuunrespons op chitine bevattende pathogenen7. Het enzym is ook betrokken bij de rijping van monocyten in zowel M1 en m2 macrofaag subtypen, zelfs zonder de aanwezigheid van het substraat chitine8. Bovendien, het kan ook worden betrokken bij de rijping van andere immuuncellen, met inbegrip van T helper type 2 (Th2) cellen en eosinofielen — zoals bleek het geval te zijn in crypto Kokken longinfectie9. Deze studies wijzen op een complexe rol van chitinases in het immuunsysteem.
In de afgelopen jaren, Chit1 niveaus zijn gevonden om te dienen als een belangrijke biomarker van progressie voor meer dan 40 verschillende ziekten van de mens, met inbegrip van lysosomale opslag ziekten, infectieziekten, ademhalingsziekten, endocrinologische ziekten, cardiovasculaire ziekten, neurologische aandoeningen, en anderen (beoordeeld10). In veel van deze ziekten, de niveaus van Chit1 zijn een sterke voorspeller van de ernst van de ziekte en therapeutische effectiviteit10.
Omdat chitinases een reputatie hebben opgebouwd als biomarker voor talrijke medische aandoeningen, waaronder de ziekte van Gaucher, zijn gereedschappen en assays ontwikkeld om het testen van de aanwezigheid van Chitinase te vergemakkelijken. Oudere methoden zijn onder meer de procedure van Schales, een protocol dat is aangepast aan een bloedglucose test en de methode met 3, 5 dinitrosalicyl zuur (DNS). Echter, deze methoden zijn vaak tijd gevoelig en technisch moeilijk11. De procedure voor beide tests vereist de reductie van anorganische oxidanten, ferricyanide in het geval van de Schales-procedure, bijvoorbeeld het produceren van een kleurverandering die alleen spectrofotometrisch kan worden gemeten. Daarnaast hebben beide tests betrekking op een verwarmings-of kook stap die zowel tijdrovend als noodzakelijk is om de kleur12,13te ontwikkelen.
Hier beschreven is een snelle en eenvoudige fluorimetrische assay om de Chitinase spiegels in zoogdier monsters14,15te bepalen. Twee van de hier gebruikte monsters omvatten serum en bronchoalveolaire spoeling vloeistoffen (bal); Chitinase activiteit is ook gemeten in moedermelk en urine monsters, en de techniek kan worden uitgevoerd in dit soort monsters, alsmede in elke andere biologische vloeistof16,17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Chitinase activiteit is ontstaan als een belangrijke biomarker voor het voorspellen van de ernst van de ziekte, ziekteprogressie, therapeutische effectiviteit en de aanwezigheid van specifieke pathogenen18. Hoewel veel van de lang gepostleerde theorieën over de rol van chitinases niet experimenteel zijn bewezen19, hebben nieuwe studies belangrijke inzichten gegeven in de rol van chitinasen en Chitinase zoals eiwitten in verschillende ziekten2, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gesteund door de American Lung Association en de American Thoracic Society Awards voor LS. Schrijvers willen oprecht Dr. Jack Elias en Dr. Chun Geun Lee bedanken voor het leveren van transgene muis stammen.
Materials
| 4-methylumbelliferone | Sigma | M1381 | Standard: commonly used in flourimetric assays for determination of enzyme activity |
| 4MU-GlcNAc2 | Sigma | M9763 | fluorescent chitinase substrate for use in mouse samples |
| 4MU-GlcNAc3 | Sigma | M5639 | fluorescent chitinase substrate for use in human samples |
| Citric Acid-monohydrate | for use in McIlvain Buffer | ||
| Glycine | for use in Stop Buffer at a concentration of 0.3 M | ||
| Na2HPO4xH2O | for use in McIlvain Buffer | ||
| NaOH | for use in Stop Buffer at a concentration of 12 g/L | ||
| Vision Plate: Non-sterile, untreated black 96 well plate | 4titude | 4ti-0224 |
References
- Hamid, R., Khan, M. A., Ahmad, M. Chitinases: An update. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 5 (1), 21-29 (2013).
- Sharma, L., et al. Regulation and Role of Chitotriosidase during Lung Infection with Klebsiella pneumoniae. Journal of Immunology. 201 (2), 615-626 (2018).
- Kanneganti, M., Kamba, A., Mizoguchi, E. Role of chitotriosidase (chitinase 1) under normal and disease conditions. Journal of Epithelial Biology & Pharmacology. 5, 1-9 (2012).
- Lee, C. G., et al. Role of Chitin and Chitinase/Chitinase-Like Proteins in Inflammation, Tissue Remodeling, and Injury. Annual Review of Physiology. (73), 479-501 (2011).
- Jeuniaux, C. Chitinase: An Addition to the List of Hydrolases in the Digestive Tract of Vertebrates. Nature. 192 (4798), 135-136 (1961).
- Boot, R. G., et al. Identification of a Novel Acidic Mammalian Chitinase Distinct from Chitotriosidase. Journal of Biological Chemistry. 276 (9), 6770-6778 (2000).
- Arndt, S., Hobbs, A., Sinclaire, I., Lane, A. B. Chitotriosidase Deficiency: A Mutation Update in an African Population. JIMD Reports. 10, 11-16 (2013).
- Di Rosa, M., Malaguarnera, G., De Gregorio, C., Drago, F., Malaguarnera, L. Evaluation of CHI3L-1 and CHIT-1 Expression in Differentiated and Polarized Macrophages. Inflammation. 36 (2), 482-492 (2013).
- Wiesner, D. L., et al. Chitin Recognition via Chitotriosidase Promotes Pathologic Type-2 Helper T Cell Responses to Cryptococcal Infection. PLOS Pathogens. 11 (3), e1004701 (2015).
- Elmonem, M. A., vanden Heuvel, L. P., Levtchenko, E. N. Immunomodulatory Effects of Chitotriosidase Enzyme. Enzyme Research. 2016, 1-9 (2016).
- Ferrari, A. R., Gaber, Y., Fraaije, M. W. A fast, sensitive and easy colorimetric assay for chitinase and cellulase activity detection. Biotechnol Biofuels. 7 (37), 1-8 (2014).
- Schales, O., Schales, S. S. Simple method for the determination of glucose in blood. Proc Am Fed Clin Res. 2, 78 (1945).
- Zarei, M., et al. Characterization of Chitinase with Antifungal Activity from a Native Serratia Marcescens B4A. Brazilian Journal of Microbiology. 42 (297), 1017-1029 (2011).
- Zhu, Z., et al. Acidic Mammalian Chitinase in Asthmatic Th2 Inflammation and IL-13 Pathway Activation. Science. 304 (5677), 1678-1682 (2004).
- Hollak, C. E., van Weely, S., van Oers, M. H., Aerts, J. M. Marked elevation of plasma chitotriosidase activity. A novel hallmark of Gaucher disease. Journal of Clinical Investigation. 93 (3), 1288-1292 (1994).
- Musumeci, M., Malaguarnera, L., Simpore, J., Barone, R., Whalen, M., Musumeci, S. Chitotriosidase activity in colostrum from African and Caucasian women. Clinical Chemistry and Laboratory. 43 (2), 198-201 (2005).
- Maddens, B., et al. Chitinase-like Proteins are Candidate Biomarkers for Sepsis-induced Acute Kidney Injury. Mol Cell Proteomics. 11, 1-13 (2012).
- Hector, A., et al. Chitinase activation in patients with fungus-associated cystic fibrosis lung disease. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (4), 1183-1189 (2016).
- Hall, A. J., Morroll, S., Tighe, P., Götz, F., Falcone, F. H. Human chitotriosidase is expressed in the eye and lacrimal gland and has an antimicrobial spectrum different from lysozyme. Microbes and Infection. 10 (1), 69-78 (2008).
- Kim, L. K., et al. AMCase is a crucial regulator of type 2 immune responses to inhaled house dust mites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (22), e2891-e2899 (2015).
- Olkhovych, N. V. Chitotriosidase activity as additional biomarker in the diagnosis of lysosomal storage diseases. Ukrainian Biochemical Journal. 88 (1), 69-78 (2016).
- Bouayadi, O., et al. Disease: An Underdiagnosed Pathology in the Eastern Moroccan Population. eJIFCC. 30 (1), 82-87 (2019).
- Tasci, C., et al. Efficacy of serum chitotriosidase activity in early treatment of patients with active tuberculosis and a negative sputum smear. Therapeutics and Clinical Risk Management. 8, 369-372 (2012).
- Barone, R., Simporé, J., Malaguarnera, L., Pignatelli, S., Musumeci, S. Plasma chitotriosidase activity in acute Plasmodium falciparum malaria. Clinica Chimica Acta. 331 (1-2), 79-85 (2003).
- Kitamoto, S., et al. Chitinase inhibition promotes atherosclerosis in hyperlipidemic mice. American Journal of Pathology. 183 (1), 313-325 (2013).
- Kzhyshkowska, J., Gratchev, A., Goerdt, S. Human Chitinases and Chitinase-Like Proteins as Indicators for Infl Ammation and Cancer. Biomark Insights. 2, 128-146 (2007).
