Medición de la actividad de la chitinasa en muestras biológicas
Summary
Aquí se presenta un método sencillo para medir la actividad de la chitinasa en fluidos biológicos como el lavado broncoalveolar o el suero.
Abstract
Las chitinasas son las enzimas que se paran la quitina. Incluso en ausencia de quitina, los mamíferos tienen cantidades significativas de chitinasis presentes en el cuerpo, incluso al inicio. El papel preciso de la chitinasa no se conoce, sin embargo se creía que desempeña un papel importante en la digestión y la defensa del huésped contra los alimentos y patógenos que contienen quitina, respectivamente. El trabajo reciente, incluido el nuestro, ha demostrado un importante papel de las proteínas de chitinasa y las proteínas similares a las chitinasas en la inmunidad al huésped y las enfermedades alérgicas. Es importante destacar que las actividades de la chitinasa sirven como biomarcadores importantes de la gravedad de la enfermedad en una amplia gama de enfermedades, incluidas enfermedades inflamatorias de tipo 2 como el asma y la fibrosis pulmonar. Del mismo modo, los pacientes con trastornos genéticos como la enfermedad de Gaucher tienen niveles significativamente elevados de chitinasa, que no sólo se correlacionan con la gravedad de la enfermedad, sino que también sirven como un biomarcador fiable para la eficacia terapéutica. El protocolo descrito aquí describe una manera simple, rápida y directa de medir la actividad de la chitinasa en BAL o muestras séricas de ratones y puede ser ampliamente adaptado a sujetos humanos y otros organismos modelo debido a la naturaleza altamente conservada de las enzimas.
Introduction
La quitina es el segundo polisacárido más abundante en la tierra después de la celulosa, sirviendo como un componente estructural importante de una variedad de organismos incluyendo el exoesqueleto de insectos, hongos, levaduras y algas; algunos vertebrados también tienen quitina1. Las chitinasas son una familia de enzimas que son capaces de descomponer la quitina y están altamente conservadas a lo largo de la evolución en especies que van desde bacterias hasta mamíferos2,3. Además de las chitinasis, los mamíferos también tienen proteínas similares a las chitinasas que son similares a las chitinasas en su capacidad para unir la quitina pero difieren en que carecen de capacidad enzimática para cortar la quitina4.
Aunque la quitina y las chitinasis han sido estudiadas durante mucho tiempo, con investigaciones que se remontan a principios de 1900, el enfoque principal ha estado en su papel en insectos y otros invertebrados. De hecho, no fue hasta la década de 1960 cuando se encontró que los vertebrados tenían chitinasis en absoluto. Utilizando un ensayo a base de chitobiase, se demostró que las chitinasas se encuentran en el tracto digestivo de una serie de vertebrados, incluyendo lagartos y mirlos, una observación que se presume que se debe al consumo de organismos que contienen quitina como insectos5 .
Los mamíferos tienen dos formas enzimáticamente activas de chitinasa: chitinasa de mamíferoá ácida (AMCase; también conocida como CHIT2 y CHIA) y chitotriosidasa (CHIT1)4. Ambas proteínas son capaces de hidrolizar la quitina. Sin embargo, CHIT1 es más activo en los seres humanos, donde casi toda la actividad chitinasa se deriva de CHIT1. 4 En ratones, tanto Chit1 como AMCase contribuyen casi por igual a la actividad general de la chitinasa6. Por otro lado, las proteínas similares a la chitinasa carecen de actividad de la chitinasa.
Chit1 se secreta principalmente por macrófagos y a menudo se considera como una respuesta inmune a los patógenos que contienen quitina7. La enzima también ha demostrado estar implicada en la maduración de monocitos en los subtipos de macrófagos M1 y M2, incluso sin la presencia de la quitinadesustrato 8. Además, también puede estar involucrado en la maduración de otras células inmunitarias, incluyendo t helper tipo 2 (Th2) células y eosinófilos, como se demostró que era el caso en la infección pulmonar criptocócica9. Estos estudios apuntan a un papel complejo de las chitinasas en el sistema inmunológico.
En los últimos años, se ha encontrado que los niveles de Chit1 sirven como un importante biomarcador de progresión para más de 40 enfermedades humanas diferentes, incluyendo enfermedades de almacenamiento lisosomal, enfermedades infecciosas, enfermedades respiratorias, enfermedades endocrinológicas, enfermedades neurológicas y otras (revisadas10). En muchas de estas enfermedades, los niveles de Chit1 son un fuerte predictor de la gravedad de la enfermedad y la eficacia terapéutica10.
Como las chitinasis se han ganado una reputación como un biomarcador para numerosas condiciones médicas incluyendo la enfermedad de Gaucher, se han desarrollado herramientas y ensayos para facilitar las pruebas de presencia de chitinasa. Los métodos más antiguos incluyen el procedimiento de Schales, un protocolo adaptado de una prueba de glucosa en sangre y el método de ácido dinitrosalicílico 3,5 (DNS). Sin embargo, estos métodos son a menudo sensibles al tiempo y técnicamente difíciles11. El procedimiento para ambas pruebas requiere la reducción de oxidantes inorgánicos, ferricyanida en el caso del procedimiento de los Schales, por ejemplo, produciendo un cambio de color que sólo puede medirse espectrofotométricamente. Además, ambas pruebas implican un paso de calentamiento o ebullición que consume mucho tiempo y es necesario para que el color se desarrolle12,13.
Aquí se describe un ensayo fluorado rápido y simple para determinar los niveles de chitinasa en muestras de mamíferos14,15. Dos de las muestras utilizadas aquí incluyen suero y líquidos de lavado broncoalveolar (BAL); la actividad de la chitinasa también se ha medido en muestras de leche materna y orina, y la técnica se puede realizar en ese tipo de muestras, así como en cualquier otro fluido biológico16,17.
Protocol
Representative Results
Discussion
La actividad chitinasa ha surgido como un biomarcador importante para predecir la gravedad de la enfermedad, la progresión de la enfermedad, la eficacia terapéutica y la presencia de patógenos específicos18. Aunque muchas de las teorías de largo postulado sobre el papel de las chitinasis no han sido probadas experimentalmente19, nuevos estudios han proporcionado información importante sobre el papel de las chitinasis y las chitinasas como proteínas en varias enfermed…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por la American Lung Association y los premios de la American Thoracic Society a LS. Los autores sinceramente quieren agradecer al Dr. Jack Elias y al Dr. Chun Geun Lee por proporcionar cepas de ratón transgénicas.
Materials
| 4-methylumbelliferone | Sigma | M1381 | Standard: commonly used in flourimetric assays for determination of enzyme activity |
| 4MU-GlcNAc2 | Sigma | M9763 | fluorescent chitinase substrate for use in mouse samples |
| 4MU-GlcNAc3 | Sigma | M5639 | fluorescent chitinase substrate for use in human samples |
| Citric Acid-monohydrate | for use in McIlvain Buffer | ||
| Glycine | for use in Stop Buffer at a concentration of 0.3 M | ||
| Na2HPO4xH2O | for use in McIlvain Buffer | ||
| NaOH | for use in Stop Buffer at a concentration of 12 g/L | ||
| Vision Plate: Non-sterile, untreated black 96 well plate | 4titude | 4ti-0224 |
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