Mesure de l'activité chitinase dans les échantillons biologiques
Summary
Présenté ici est une méthode simple pour mesurer l’activité chitinase dans les fluides biologiques tels que le lavage bronchoalvéolaire ou le sérum.
Abstract
Les chitinases sont les enzymes qui cisaillent la chitine. Même en l’absence de chitine, les mammifères ont des quantités significatives de chitinases présentes dans le corps, y compris à la ligne de base. Le rôle précis de la chitinase n’est pas connu, mais on croyait qu’il jouait un rôle important dans la digestion et la défense de l’hôte contre les aliments contenant de la chitine et les agents pathogènes, respectivement. Des travaux récents, y compris le nôtre, ont montré un rôle important de protéines chitinase et chitinase-like dans l’immunité de l’hôte et les maladies allergiques. Fait important, les activités de chitinase servent de biomarqueurs importants de la gravité de la maladie dans un large éventail de maladies, y compris les maladies inflammatoires de type 2 comme l’asthme et la fibrose pulmonaire. De même, les patients atteints de troubles génétiques comme la maladie de Gaucher ont des niveaux de chitinase significativement élevés, qui non seulement sont en corrélation avec la gravité de la maladie, mais servent également de biomarqueur fiable pour l’efficacité thérapeutique. Le protocole décrit ici une façon simple, rapide et directe de mesurer l’activité chitinase dans les échantillons de bal ou de sérum de souris et peut être largement adapté aux sujets humains et à d’autres organismes modèles en raison de la nature hautement conservée des enzymes.
Introduction
La chitinestine est le deuxième polysaccharide le plus abondant sur la terre après la cellulose, servant de composant structurel majeur d’une variété d’organismes, y compris l’exosquelette des insectes, des champignons, des levures et des algues; certains vertébrés ont également chitin1. Chitinases sont une famille d’enzymes qui sont capables de décomposer la chitine et sont très conservés tout au long de l’évolution des espèces allant des bactéries aux mammifères2,3. En plus des chitinases, les mammifères ont également des protéines chitinase-comme qui sont semblables aux chitinases dans leur capacité à lier la chitine mais diffèrent en ce qu’ils manquent de capacité enzymatique de cencouper la chitine4.
Bien que la chitine et les chitinases aient été étudiées depuis longtemps, avec des études remontant au début des années 1900, l’accent a été mis sur leur rôle dans les insectes et autres invertébrés. En fait, ce n’est que dans les années 1960 que l’on a découvert que les vertébrés avaient des chitinases. À l’aide d’un étosay à base de chitobiase, il a été démontré que des chitinases se trouvaient dans le tube digestif d’un certain nombre de vertébrés, y compris des lézards et des merles, une observation qui est présumée être due à la consommation d’organismes contenant de la chitine comme les insectes5. .
Les mammifères ont deux formes enzymatiquement actives de chitinase : la chitinase acide de mammifères (AMCase ; égalementconnue sous le nom chIT2 et CHIA) et la chitotriosidase (CHIT1) 4. Ces deux protéines sont capables d’hydrolyser la chitin. Cependant, CHIT1 est plus enzymatiquement actif chez l’homme, où presque toute l’activité chitinase est dérivée de CHIT1. 4 Chez la souris, Chit1 et AMCase contribuent presque également à l’activité chitinase globale6. D’autre part, les protéines chitinase-comme manquent d’activité chitinase.
Chit1 est principalement sécrété par les macrophages et est souvent considérécomme une réponse immunitaire aux agents pathogènes contenant de la chitin7 . L’enzyme a également été montré pour être impliqué dans la maturation des monocytes dans les deux sous-types de macrophage M1 et M2, même sans la présence du substrat chitin8. En outre, il peut également être impliqué dans la maturation d’autres cellules immunitaires, y compris les cellules de type 2 (Th2) d’aide T et les éosinophiles, comme cela s’est avéré être le cas dans l’infection pulmonaire cryptococcique9. Ces études indiquent un rôle complexe des chitinases dans le système immunitaire.
Ces dernières années, les niveaux de Chit1 ont été trouvés pour servir de biomarqueur important de la progression pour plus de 40 maladies humaines différentes, y compris les maladies de stockage lysosomal, les maladies infectieuses, les maladies respiratoires, les maladies endocriologiques, maladies neurologiques, et d’autres (révisé10). Dans beaucoup de ces maladies, les niveaux de Chit1 sont un prédicteur fort de la sévérité de la maladie et de l’efficacité thérapeutique10.
Comme les chitinases ont acquis une réputation de biomarqueur pour de nombreuses conditions médicales, y compris la maladie de Gaucher, des outils et des essais ont été développés pour faciliter les tests de présence de chitinase. Les méthodes plus anciennes incluent la procédure de Schales, un protocole adapté d’un essai de glucose sanguin, et la méthode de 3,5 acide dinitrosalicolilique (DNS). Cependant, ces méthodes sont souvent sensibles au temps et techniquement difficiles11. La procédure pour ces deux tests nécessite la réduction des oxydants inorganiques, ferricyanide dans le cas de la procédure des Schales par exemple, produisant un changement de couleur qui ne peut être mesuré spectrophotométriquement. En outre, les deux tests impliquent une étape de chauffage ou d’ébullition qui est à la fois long et nécessaire pour la couleur de se développer12,13.
Décrit ici est un test fluorémétrique rapide et simple pour déterminer les niveaux de chitinase dans les échantillons de mammifères14,15. Deux des échantillons utilisés ici comprennent le sérum et les liquides de lavage bronchoalvéolaire (BAL); l’activité de chitinase a également été mesurée dans le lait maternel et les échantillons d’urine, et la technique peut être exécutée dans ce type d’échantillons aussi bien que dans n’importe quel autre fluide biologique16,17.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’activité chitinase est apparue comme un biomarqueur important pour prédire la gravité de la maladie, la progression de la maladie, l’efficacité thérapeutique et la présence d’agents pathogènes spécifiques18. Bien que beaucoup de théories longtemps postulées sur le rôle des chitinases n’ont pas été expérimentalementprouvé19, de nouvelles études ont fourni des idées importantes sur le rôle des chitinases et chitinase comme les protéines dans diverses mala…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été soutenue par l’American Lung Association et l’American Thoracic Society Awards à LS. Les auteurs veulent sincèrement remercier le Dr Jack Elias et le Dr Chun Geun Lee d’avoir fourni des souches de souris transgéniques.
Materials
| 4-methylumbelliferone | Sigma | M1381 | Standard: commonly used in flourimetric assays for determination of enzyme activity |
| 4MU-GlcNAc2 | Sigma | M9763 | fluorescent chitinase substrate for use in mouse samples |
| 4MU-GlcNAc3 | Sigma | M5639 | fluorescent chitinase substrate for use in human samples |
| Citric Acid-monohydrate | for use in McIlvain Buffer | ||
| Glycine | for use in Stop Buffer at a concentration of 0.3 M | ||
| Na2HPO4xH2O | for use in McIlvain Buffer | ||
| NaOH | for use in Stop Buffer at a concentration of 12 g/L | ||
| Vision Plate: Non-sterile, untreated black 96 well plate | 4titude | 4ti-0224 |
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