Измерение активности читиназа в биологических образцах

Читин является вторым наиболее распространенным полисахаридом на земле после целлюлозы, выступающей в качестве основного структурного компонента различных организмов, включая экзоскелет насекомых, грибов, дрожжей и водорослей; некоторые позвоночные также имеют хитин¹. Читиназы представляют собой семейство ферментов, которые способны разрушать хитин и высоко сохраняются на протяжении всей эволюции в видах, начиная от бактерий до млекопитающих^2,3. В дополнение к хитиназы, млекопитающие также имеют хитиназы, как белки, которые похожи на хитиназы в их способности связывать хитин, но отличаются тем, что они не имеют ферментатической способности расщеплять хитин⁴.

Хотя хитин и хитиназы уже давно изучены, исследования датируются началом 1900-х годов, основное внимание уделяется их роли в насекомых и других беспозвоночных. В самом деле, он не был до 1960-х годов, когда позвоночные были найдены, что хитиназа на всех. Использование цитобиазного анализ, хитиназы были показаны, чтобы быть найдены в пищеварительном тракте ряда позвоночных, включая ящериц и черных дроздов-наблюдение предположил, что из-за потребления хитина содержащих организмов, таких как насекомые⁵ .

Млекопитающие имеют две ферментативно активные формы хитиназы: кислую хитиназу млекопитающих (AMCase; также известный как CHIT2 и CHIA) и chitotriosidase (CHIT1)⁴. Оба этих белка способны гидролизовать хитин. Тем не менее, CHIT1 более ферментативно активен у людей, где почти вся активность хитиназы происходит от CHIT1. ⁴ У мышей, как Chit1 и AMCase почти в равной степени способствовать общей активности хитиназы⁶. С другой стороны, хитиназоподобные белки не имеют хитиназной активности.

Chit1 в основном выделяется макрофагами и часто считается иммунным ответом на хитинсодержащие патогены⁷. Фермент также было показано, что участвует в созревании моноцитов в обоих M1 и M2 макрофаг подтипов, даже без присутствия субстрата хитина⁸. Кроме того, он также может быть вовлечен в созревание других иммунных клеток, включая T помощник типа 2 (Th2) клетки и эозинофилы, как было показано в случае криптококковой инфекции легких⁹. Эти исследования указывают на сложную роль хитиназав в иммунной системе.

В последние годы, Chit1 уровни были найдены в качестве важного биомаркера прогрессирования для более чем 40 различных заболеваний человека, включая лисосомальные заболевания хранения, инфекционные заболевания, респираторные заболевания, эндокринологические заболевания, сердечно-сосудистые заболеваний, неврологических заболеваний и др. (обзор¹⁰). Во многих из этих заболеваний, уровни Chit1 являются сильным предиктором тяжести заболевания и терапевтической эффективности¹⁰.

Как хитиназа приобрели репутацию биомаркера для многочисленных заболеваний, включая болезнь Гоше, инструменты и анализы были разработаны для облегчения тестирования на наличие хитиназа. Более старые методы включают процедуру Schales, протокол приспособленный от испытания глюкозы крови, и метод 3.5 динитрозалиловной кислоты (DNS). Тем не менее, эти методы часто чувствительны к времени и технически трудно¹¹. Процедура для обоих из этих испытаний требует уменьшения неорганических окислителей, ferricyanide в случае процедуры Schales например, производя изменение цвета которое можно только измерить спектрофотометрическо. Кроме того, оба теста включают нагревание или кипячение шаг, который является одновременно трудоемким и необходимым для цвета развиваться^12,13.

Описано здесь быстрый и простой фторметрический анализ для определения уровня хитиназы в образцах млекопитающих^14,15. Два из используемых здесь образцов включают сыворотку и бронхоальвеолярные лавовые жидкости (BAL); хитиназа активность также измеряется в грудном молоке и моче образцов, и техника может быть выполнена в этих типах образцов, а также в любой другой биологической жидкости^16,17.