Medição da atividade da quitinase em amostras biológicas

A quitina é o segundo polissacárido mais abundante na terra após a celulose, servindo como um componente estrutural importante de uma variedade de organismos, incluindo o exoesqueleto de insetos, fungos, leveduras e algas; alguns vertebrados também têm quitina¹. Quitinases são uma família de enzimas que são capazes de quebrar a quitina e são altamente conservadas ao longo da evolução em espécies que variam de bactérias a mamíferos^2,3. Além de quitinases, os mamíferos também têm quitinase-como proteínas que são semelhantes às quitinases em sua capacidade de ligar a quitina, mas diferem em que falta capacidade enzimática para Cleave a quitina⁴.

Embora a quitina e as quitinases tenham sido estudadas há muito tempo — com investigações que datam do início de 1900 — o foco principal tem sido o seu papel em insetos e outros invertebrados. Na verdade, não foi até a década de 1960, quando os vertebrados foram encontrados para ter quitinases em tudo. Usando um ensaio à base de quitobiase, as quitinases mostraram-se no trato digestivo de um número de vertebrados, incluindo lagartos e melros — uma observação hipotética para ser devido ao consumo de organismos contendo quitina, como insetos⁵ .

Os mamíferos têm duas formas enzimaticamente ativas de quitinase: quitinase de mamíferos ácidos (AMCase; também conhecida como CHIT2 e CHIA) e quitotriosidase (CHIT1)⁴. Ambas as proteínas são capazes de hidrolisando quitina. No entanto, CHIT1 é mais enzimaticamente ativo em seres humanos, onde quase toda a atividade de quitinase é derivada de CHIT1. ⁴ em camundongos, tanto o Chit1 quanto o amcase contribuem quase igualmente para a atividade geral da quitinase⁶. Por outro lado, as proteínas quitinase-like falta de atividade quitinase.

Chit1 é secretado principalmente por macrófagos e é muitas vezes considerado uma resposta imune aos patógenos contendo quitina⁷. A enzima também demonstrou estar envolvida na maturação dos monócitos nos subtipos de macrófago M1 e m2, mesmo sem a presença do substrato quitina⁸. Além disso, também pode estar envolvida na maturação de outras células imunes, incluindo células T auxiliares tipo 2 (Th2) e eosinófilos — como se mostrou ser o caso na infecção pulmonar criptocócica⁹. Estes estudos apontam para um papel complexo de quitinases no sistema imunológico.

Nos últimos anos, Chit1 níveis foram encontrados para servir como um importante biomarcador de progressão para mais de 40 diferentes doenças humanas, incluindo doenças de armazenamento lisossomal, doenças infecciosas, doenças respiratórias, doenças endocrinológicas, cardiovascular doenças neurológicas e outras (revistas¹⁰). Em muitas dessas doenças, os níveis de Chit1 são um forte preditor de severidade da doença e efetividade terapêutica¹⁰.

Como quitinases ganharam uma reputação como um biomarcador para inúmeras condições médicas, incluindo a doença de Gaucher, ferramentas e ensaios foram desenvolvidos para facilitar o teste para a presença de quitinase. Os métodos mais antigos incluem o procedimento de schales, um protocolo adaptado de um teste de glicose no sangue, e o método de ácido 3, 5 dinitrosalicílico (DNS). No entanto, esses métodos são muitas vezes sensíveis ao tempo e tecnicamente difícil¹¹. O procedimento para ambos os testes exige a redução de oxidantes inorgânicos, ferricianeto no caso do schales ‘ procedimento por exemplo, produzindo uma mudança de cor que só pode ser medido espectrofotometricamente. Adicionalmente, ambos os testes envolvem um aquecimento ou uma etapa de ebulição que seja demorado e necessário para que a cor desenvolva^12,13.

Descrito aqui é um ensaio fluimétrico rápido e simples para determinar os níveis de quitinase em amostras de mamíferos^14,15. Duas das amostras utilizadas aqui incluem fluidos de lavagem de soro e broncoalveolar (LBA); a atividade da quitinase também foi mensurada em amostras de leite materno e urina, e a técnica pode ser realizada nessas amostras, bem como em qualquer outro fluido biológico^16,17.