Primer Nöronlarda Neurite Outgrowth Çalışma için Geliştirilmiş Yeşil Floresan Protein Tabanlı Test
Summary
Bu yazıda, EGFP ve ilgi proteini ile birlikte transfekting tarafından embriyonik sıçan kortikal nöronlarda neurite büyüme incelenmesi için basit bir protokol açıklanmıştır.
Abstract
Neurite büyüme sinir sistemi gelişimi sırasında nöral devrelerin oluşumunda temel bir olaydır. Şiddetli nötrit hasarı ve sinaptik disfonksiyon çeşitli nörodejeneratif hastalıklarda ve yaşa bağlı dejenerasyonda meydana gelir. Neurite büyümesini düzenleyen mekanizmaların araştırılması sadece beyin gelişim süreçlerine değil, aynı zamanda bu tür nörolojik bozukluklara da değerli Bir ışık tutamaz. Düşük transfeksiyon verimliliği nedeniyle, şu anda birincil memeli nöronlarda nörit büyüme üzerinde belirli bir proteinin etkisini incelemek zordur. Burada, egfp ve ilgi bir protein (POI) ile birincil sıçan kortikal nöronların co-transfeksiyon tarafından neurite outgrowth soruşturma için basit bir yöntem açıklar. Bu yöntem, EGFP sinyali ile POI transfected nöronların belirlenmesini sağlar, ve böylece neurite outgrowth poi etkisi tam olarak belirlenebilir. Bu EGFP tabanlı test, neurite büyümesini düzenleyen yolların araştırılması için uygun bir yaklaşım sağlar.
Introduction
Hem aksonlar hem de dendritler de dahil olmak üzere nöritler, nöral ağların kurulmasında rol oynayan nöronların projeksiyonlarıdır. Nöritlerin dinamik büyümesi nörogelişim için gereklidir. Ancak, altında yatan düzenleyici mekanizmalar belirsizliğini koruyor. Özellikle, neurite hasar genellikle çeşitli nörodejeneratif hastalıklarda gözlenen ve beyin yaralanmalarısonra 1. Bu nedenle, çeşitli neurite outgrowth düzenleyici yollarda putatif moleküllerin rollerinin araştırılması süreci anlayışımızı artıracaktır. Ayrıca, çeşitli nörolojik bozukluklar için yeni terapötik hedefler ortaya çıkarabilir. Nöronal hücre hatları onlar işlemek ve transfectkolayolduğu gibi neurite outgrowth dahil olmak üzere nöronal süreçleri incelemek için değerlimodellerdir 2 ,3. Ancak, genetik sürüklenme bazı yaygın olarak kullanılan hücre hatları meydana bildirilmiştir, onların fizyolojik yanıtları varyasyonları yol açabilir4. Ayrıca nöronal hücre hatları ile primer nöronlar arasında diferansiyel protein ekspresyonu gösterilmiştir. Örneğin, PC12, yaygın neuriteoutgrowth2 ,3, NMDA reseptörleri ifade etmez çalışma için kullanılan sıçan adrenal bezinden elde edilen bir nöronal hücre hattı5 . Ayrıca, birincil nöronlara göre nörotoksinlere fare nöroblastom hattı nöroblastom hattı nöro-2a azaltılmış yanıt bazı membran reseptörleri ve iyonkanallarınınifade eksikliği nedeniyle olduğu ileri sürülmuştur 6 . Bu nedenle, birincil nöronlar daha arzu edilen ve temsili bir model neurite outgrowth soruşturma için. Ancak, birincil nöronların kullanımı düşük transfeksiyon verimliliği7tarafından engellenir.
Burada, ilgi proteininin (POI) ve EGFP’nin birincil sıçan kortikal nöronlarına birlikte transfeksiyonunu içeren bir yöntemi tanımlıyoruz. EGFP başarılı transfeced nöronların belirlenmesi için bir morfolojik belirteç olarak davranır ve nöritlerin ölçümü sağlar. Bu yöntemi, netürit büyümesini modüle ettiği bildirilen bileşikler/moleküller kullanarak doğruladık. Ayrıca, FE65, neurite büyüme uyarmak için gösterilmiştir bir nöronal adaptör protein, Bu yaklaşım göstermek için kullanılmıştır8,9. Bu protokol (1) embriyonik gün 18 (E18) sıçan embriyolarından birincil kortikal nöronların izolasyonunu, (2) egfp ve POI (bu çalışmada FE65) ile nöronların birlikte transfeksiyonunu ve (3) görüntü işlemeyi kullanarak nöronların görüntülenme ve analizini içerir. NeuronJ eklentisi ile yazılım ImageJ10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Daha önce de belirtildiği gibi, PC12 ve subklonları yaygın olarak neurite uzantısı çalışmak için istihdam çünkü mükemmel transfeksiyon verimliliği2,3. Buna karşılık, birincil nöronlar düşük transfeksiyon hızıvar, transfeksiyon7ile neurite outgrowth regülatörleri incelenmesi için önemli bir engeldir. Burada, birincil nöronlarda nötrit büyümesini ölçmek için uygun bir protokol uyguluyoruz. Düşük genel tr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Araştırma Hibekonseyi Hong Kong, Sağlık ve Tıbbi Araştırma Fonu (Hong Kong), CUHK doğrudan hibe programı, United College bağış fonu ve TUYF Charitable Trust fonları tarafından desteklendi.
Materials
| #5 tweezers | Regine | 5-COB | |
| 18 mm Circle Cover Slips | Thermo Scientific | CB00180RA | Sterilize before use. |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| Cytochalasin D | Invitrogen | PHZ1063 | Dissolved in DMSO. |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dissecting Scissors, 10 cm | World Precision Instruments | 14393 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm | World Precision Instruments | 15922 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Fluorescence Mounting Medium | Dako | S302380 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| NGF 2.5S Native Mouse Protein | Gibco | 13257019 | |
| Nugent Utility Forceps, 10mm, Straight Tip | World Precision Instruments | 504489 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pEGFP-C1 | Clontech | #6084-1 | |
| pCI FE65 | Please see references 8 and 15 | ||
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Spatula | Sigma-Aldrich | S4147 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 |
References
- Kaplan, A., Bueno, M., Hua, L., Fournier, A. E. Maximizing functional axon repair in the injured central nervous system: Lessons from neuronal development. Developmental Dynamics. 247 (1), 18-23 (2018).
- Harrill, J. A., Mundy, W. R. Quantitative assessment of neurite outgrowth in PC12 cells. Methods in Molecular Biology. 758, 331-348 (2011).
- Yeyeodu, S. T., Witherspoon, S. M., Gilyazova, N., Ibeanu, G. C. A rapid, inexpensive high throughput screen method for neurite outgrowth. Current Chemical Genomics. 4, 74-83 (2010).
- Ben-David, U., et al. Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response. Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).
- Edwards, M. A., Loxley, R. A., Williams, A. J., Connor, M., Phillips, J. K. Lack of functional expression of NMDA receptors in PC12 cells. Neurotoxicology. 28 (4), 876-885 (2007).
- LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).
- Cheung, H. N., et al. FE65 interacts with ADP-ribosylation factor 6 to promote neurite outgrowth. The FASEB Journal. 28 (1), 337-349 (2014).
- Li, W., et al. Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1. Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).
- Swanson, L. W. Brain maps 4.0-Structure of the rat brain: An open access atlas with global nervous system nomenclature ontology and flatmaps. The Journal of Comparative Neurology. 526 (6), 935-943 (2018).
- Brewer, G. J. Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus. Journal of Neuroscience Research. 42 (5), 674-683 (1995).
- Yamada, K. M., Spooner, B. S., Wessells, N. K. Axon growth: roles of microfilaments and microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (4), 1206-1212 (1970).
- Casella, J. F., Flanagan, M. D., Lin, S. Cytochalasin D inhibits actin polymerization and induces depolymerization of actin filaments formed during platelet shape change. Nature. 293 (5830), 302-305 (1981).
- Calabrese, E. J. Enhancing and regulating neurite outgrowth. Critical Reviews in Toxicology. 38 (4), 391-418 (2008).
- Lau, K. F., et al. Dexras1 Interacts with FE65 to Regulate FE65-Amyloid Precursor Protein-dependent Transcription. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34728-34737 (2008).
- Cui, X., et al. Niacin treatment of stroke increases synaptic plasticity and axon growth in rats. Stroke. 41 (9), 2044-2049 (2010).
- Khodosevich, K., Monyer, H. Signaling involved in neurite outgrowth of postnatally born subventricular zone neurons in vitro. BMC Neuroscience. 11, 18 (2010).
- Tang, F., et al. Resveratrol Enhances Neurite Outgrowth and Synaptogenesis Via Sonic Hedgehog Signaling Following Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation Injury. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 43 (2), 852-869 (2017).
- He, W., Liu, Y., Tian, X. Rosuvastatin Improves Neurite Outgrowth of Cortical Neurons against Oxygen-Glucose Deprivation via Notch1-mediated Mitochondrial Biogenesis and Functional Improvement. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 6 (2018).
- Tesarova, P., et al. Receptor for advanced glycation end products (RAGE)–soluble form (sRAGE) and gene polymorphisms in patients with breast cancer. Cancer Investigation. 25 (8), 720-725 (2007).
- Park, S. Y., et al. Hippocalcin Promotes Neuronal Differentiation and Inhibits Astrocytic Differentiation in Neural Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (1), 95-111 (2017).
- Radbruch, A. Immunofluorescence: Basic Considerations. Flow Cytometry and Cell Sorting. , 38-52 (2000).
- Wang, T., Larcher, L. M., Ma, L., Veedu, R. N. Systematic Screening of Commonly Used Commercial Transfection Reagents towards Efficient Transfection of Single-Stranded Oligonucleotides. Molecules. 23 (10), (2018).
- Sariyer, I. K. Transfection of neuronal cultures. Methods in Molecular Biology. 1078, 133-139 (2013).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Research. 126 (3), 397-425 (1977).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Further observations on hippocampal neurons in dispersed cell culture. The Journal of Comparative Neurology. 187 (3), 469-493 (1979).
- Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study. PLoS One. 8 (12), e83899 (2013).
- Hiragi, T., et al. Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC)-Derived Neurons in Mouse Hippocampal Slice Cultures. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 143 (2017).
- Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews. Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).
- Jones, M. R., Villalon, E., Northcutt, A. J., Calcutt, N. A., Garcia, M. L. Differential effects of myostatin deficiency on motor and sensory axons. Muscle & Nerve. 56 (6), E100-E107 (2017).
